A estabilização biológica das nanoestruturas de DNA é essencial para futuras aplicações in vivo, como a entrega de medicamentos direcionados. No entanto, o DNA é degradado no corpo por várias enzimas. Aqui apresentamos uma técnica de revestimento que protege as nanoestruturas de DNA da degradação enzimática.
As principais vantagens são que nosso revestimento compreende compostos não tóxicos que já são usados em organismos vivos e que a funcionalidade da superfície permanece possível. Esta funcionalidade é importante para incorporar sensores moleculares para reconhecimento de alvos e interruptores para liberação de carga de drogas. Os revestimentos de policação aumentam significativamente a absorção celular de estruturas de origami de DNA encapsulado, de modo que este método pode abrir a porta para aplicações de origamis de DNA em diagnósticos e terapêuticas.
A captação celular também é necessária para aplicações potenciais de entrega de genes da nanotecnologia de DNA. Considero que o método é bastante simples e pode ser facilmente dominado. Para começar, meça a concentração de origami de DNA purificado.
Use dois microliters de tampão de TB como o branco para calibrar o espectrofotômetro ultravioleta. E então meça a concentração de dna origami em 260 nanômetros. Em seguida, calcule as quantidades de fosfatos na solução purificada de origami de DNA, usando a fórmula dois, conforme descrito no manuscrito.
Prepare 15 microliters da estrutura de origami de DNA, incluindo um nanomole de fosfato, usando tampão de TB para diluição. Adicione 13,2 microliters à TB a 1,8 microliters de chitosan. E adicione 15 microliters da solução chitosana a 15 microliters do DNA origami para desenvolver um dna origami chitosan polyplex com uma razão N/P de oito.
Continue preparando poliplexes de diferentes proporções N/P, utilizando cálculos descritos no manuscrito. Prepare 80 milímetros de tubo para gel de 2%agarose. Adicione 352 microliters de 2,5 cloreto de magnésio molar e, em seguida, pré-manchá-lo com 10 microliters de mancha de gel de DNA.
Despeje a solução de gel em uma caixa de gel seco. Insira um pente de eletroforese em gel e deixe solidificar à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. Enquanto isso, suplemente o tampão de corrida com 11 cloreto de magnésio mililitro.
Misture de 10 a 20 microlitadores de cada amostra com 20% do buffer de carregamento 6X. Carregue as amostras nos poços de gel de agarose, incluindo um origami de DNA nu como controle. Execute o gel a 70 volts em temperatura ambiente por duas horas e meia a três horas.
Em seguida, use um scanner UV para visualizar o gel. Para realizar um ensaio de proteção DNase I, adicione quatro microliters de cada poliplex comparado em diferentes proporções N/P, 1,5 microliters de tampão 10X DNase I, 8 microliters de TB e 1,5 microliters de DNase I a um tubo PCR separado de 2 mililitros. Em seguida, incubar o mesmo a 37 graus celsius em um termociclador por 24 horas.
Para digerir DNase I, adicione dois microliters de 20 miligramas por mililitros proteinase K e incubar por 30 minutos a 37 graus celsius em um termociclador. Em seguida, para desvendar as nanoestruturas de DNA do núcleo adicionam 3,6 microlitadores de 50 miligramas por mililitro 40 kilodaltons dextran sulfato. Em seguida, use essas amostras e origami de DNA fresco como controle para realizar eletroforese de gel agarose como descrito anteriormente.
Extir esse valor é a banda correspondente a amostras carregadas do gel. Para extrair o origami de DNA, use uma coluna de extração de congelamento de espremer e siga as instruções do fabricante e continue com imagens de microscopia eletrônica de transmissão negativa, conforme descrito no manuscrito. Misture 6,5 microliters de 36 hrp-nr nanomolar purificados com 6,5 microliters de polilaculações de concentrações variadas.
Para preparar um poliplex em proporções N/P de uma, duas, quatro, 10 e 20, prepare um grupo em branco misturando 6,5 microliters de água destilada com 6,5 microliters de polilações de várias concentrações correspondentes às relações N/P de uma, duas, quatro, 10 e 20. Em seguida, adicione 12,5 microliters de cada uma dessas soluções preparadas a um poço separado de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 72,5 microliters de tampão HEPES a cada poço e misture.
Adicione 10 microliters de 15 mililitros ABTS e depois 5 microliters de um peróxido de hidrogênio de 12 mililitros a cada poço e misture por tubulação para cima e para baixo. Por fim, use um leitor de placas multimoda para medir a absorvência em 421 nanômetros ao longo de quatro horas. Depois de analisar os poliplexes usando um ensaio de retardo de gel, houve uma mudança na nanoestrutura nua em direção ao cátodo, provavelmente devido ao contrabalanciamento da carga negativa de grupos fosfatos ao ligar-se às policações, e o aumento de tamanho do complexo.
Quando foi adicionada uma quantidade extra de polianões, como sulfato de dextran, a formação de poliplex foi revertida. O sulfato de dextran de maior peso molecular mostrou-se mais eficiente em comparação com o menor peso molecular. Após analisar os poliplexes usando microscopia eletrônica de transmissão de manchas negativas, micrografos mostraram nanoestruturas de origami de DNA nu, poliplexes lineares de polietilenimina após decapsulação, poliplexes chitosanos, imagens de origami de DNA nu e protegido submetidos à esgotamento do magnésio, degradação enzimática e digestão sérmica.
Na presença de DNase I, após duas horas, nanoestruturas nuas foram completamente digeridas, enquanto os polietilenimina linear polyplexes do origami de DNA encapsulado chitosano permaneceram intactos na presença de 10 unidades por mililitro DNase I.Polietilenimina linear polyplexes protegem as nanoestruturas de DNA de forma mais eficiente em comparação com o quitossano. Quando a razão N/P do poliplex é aumentada, a digestão do DNA foi menor. Após a enzima de revestimento, ou após origami de DNA mais funcionalizado, com polietilenimina linear poliplexes e quitosan nas proporções N/P variante, não foi observada nenhuma interferência notável com a atividade enzimática.
Por outro lado, a cinética da enzima HRP mudou drasticamente após a ligação ao origami de DNA. É importante começar com estruturas bem purificadas de origami de DNA. Existe um fio estabilizador que também pode se ligar a policações.
São difíceis de serem separados dos poliplexos de origami de DNA. Nossas moléculas de revestimento também são usadas em aplicações de terapia genética. Isso significa que as nanoestruturas de DNA podem ser usadas no futuro para alterar o genoma dos organismos vivos.
Para a coloração de gel de agarose, geralmente são usadas moléculas que intercalam o DNA e são potencialmente mutagênicas. Por favor, siga as instruções de segurança do seu laboratório ao colorar o DNA.
