DNA nanoyapılarının biyolojik stabilizasyonu, hedeflenen ilaç teslimatı gibi gelecekteki in-vivo uygulamalar için gereklidir. Ancak, DNA çeşitli enzimler tarafından vücutta bozulmuş olur. Burada DNA nanoyapılarını enzimatik bozulmadan koruyan bir kaplama tekniği salıyoruz.
En önemli avantajları, kaplamamızın canlı organizmalarda zaten kullanılan toksik olmayan bileşiklerden oluşması ve yüzeyin işlevselleştirilmesinin mümkün kalmasıdır. Bu işlevselleştirme, hedef tanıma için moleküler sensörler ve ilaç kargo salınımı için anahtarlar dahil etmek için önemlidir. Polycation kaplamalar kapsüllü DNA origami yapıların hücresel alımını önemli ölçüde artırır, bu nedenle bu yöntem tanı ve tedavi DNA origamis uygulamaları için kapıyı açabilir.
HÜCRESEL alım da DNA nanoteknoloji potansiyel gen dağıtım uygulamaları için gereklidir. Ben yöntem oldukça basit ve kolayca hakim olabilir düşünün. Başlamak için, saflaştırılmış DNA origami konsantrasyonu ölçmek.
Ultraviyole spektrofotometrekalibre etmek için boş olarak Tüberküloz tampon iki mikrolitre kullanın. Ve sonra DNA origami konsantrasyonu 260 nanometre ölçün. Daha sonra, el yazmasında açıklandığı gibi formül 2'yi kullanarak saflaştırılmış DNA origami çözeltisindeki fosfat miktarlarını hesaplayın.
Seyreltme için TB tampon kullanarak, fosfat bir nanomole ekleyerek DNA origami yapısının 15 mikrolitre hazırlayın. 1,8 mikrolitre kitosan için TB'ye 13,2 mikrolitre ekleyin. Ve DNA origami 15 mikrolitre için chitosan çözeltisi 15 mikrolitre ekleyin sekiz N / P oranı ile bir DNA origami chitosan polikseksi geliştirmek için.
Makalede açıklandığı gibi hesaplamaları kullanarak farklı N/P oranlarındaki polikseleri hazırlamaya devam edin. % 2 agarose jel için bir tüp 80 milimetre hazırlayın. 2.5 molar magnezyum klorür 352 mikrolitre ekleyin ve sonra DNA jeli leke 10 mikrolitre ile ön leke.
Kuru bir jel kutusuna jel çözeltisi dökün. Bir jel elektroforez tarak yerleştirin ve 15-30 dakika oda sıcaklığında katılaşmaya bırakın. Bu arada 11 milimolar magnezyum klorür ile çalışan tampon ek.
Her numunenin 10 ila 20 mikrolitresini 6X yükleme tamponunun %20'si ile karıştırın. Kontrol olarak çıplak BIR DNA origami de dahil olmak üzere agarose jel kuyuları, içine örnekleri yükleyin. Jeli oda sıcaklığında 70 voltta 2,5-3 saat çalıştırın.
Sonra jel görselleştirmek için bir UV tarayıcı kullanın. Bir DNase I koruma tayini gerçekleştirmek için, farklı N / P oranları, 10X DNase I tampon 1,5 mikrolitre, TB 8 mikrolitre ve ayrı bir 2 mililitre PCR tüp dNase I 1.5 mikrolitre karşılaştırıldığında her polikskop dört mikrolitre ekleyin. Daha sonra aynı şeyi 37 derecede bir termocycler'da 24 saat kuluçkaya yatırın.
DNase I'i sindirmek için, mililitre proteinaz K başına 20 miligram iki mikrolitre ekleyin ve bir termocycler 37 santigrat derece 30 dakika kuluçka. Sonra, çekirdek DNA nanoyapıları çözmek için mililitre başına 50 miligram 3.6 mikrolitre eklemek 40 kilodalton dekstran sülfat. Daha sonra daha önce açıklandığı gibi agarose jel elektroforezi gerçekleştirmek için kontrol olarak bu örnekleri ve taze DNA origami kullanın.
Jelden gelen dolu numunelere karşılık gelen bandı boşaltın. DNA origamisi ayıklamak için, bir sıkma dondurma çıkarma sütunu kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun ve el yazması açıklandığı gibi negatif leke iletim elektron mikroskobu görüntüleme ile devam edin. 6,5 mikrolitre saflaştırılmış 36 nanomolar HRP-NR ile 6,5 mikrolitre farklı konsantrasyonlarda polikasyonları karıştırın.
Bir, iki, dört, 10 ve 20'lik N/P oranlarında bir polipleksi hazırlamak için, 6,5 mikrolitre distile suyu 6,5 mikrolitre lik çeşitli konsantrasyonlarda bir, iki, dört, 10 ve 20'nin N/P oranlarına karşılık gelen polikasyonlarla karıştırarak boş bir grup hazırlayın. Daha sonra 96 kuyuluk tan ayrı bir kuyuya bu hazırlanan çözeltilerin her birinin 12,5 mikrolitresini ekleyin. Sonra her iyi HEPES tampon 72,5 mikrolitre ekleyin ve karıştırın.
15 milimolar ABTS 10 mikrolitre ve daha sonra her kuyuya 12 milimoler hidrojen peroksit 5 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı boru lama tarafından karıştırın. Son olarak, dört saat içinde 421 nanometre de emiciölçmek için bir çok modlu plaka okuyucu kullanın. Bir jel geriliği tetkik kullanarak poliksler analiz edildikten sonra, katot doğru çıplak nanoyapı bir kayma vardı, muhtemelen polikasyonlar bağlanarak fosfat gruplarının negatif yük dengeleme nedeniyle, ve kompleksin boyut artışı.
Dekstran sülfat gibi ekstra miktarda polianiyon eklendiğinde polipleks oluşumu tersine çevrildi. Yüksek molekül ağırlığıdextran sülfat daha düşük molekül ağırlığına göre daha verimli olduğunu gösterdi. Negatif leke iletimelektron mikroskobu kullanılarak polikseanaliz edildikten sonra mikrograflar çıplak DNA origami nanoyapıları, decapsulation sonrası lineer polietilenin polikler, chitosan poliksler, magnezyum tükenmesi, enzimatik bozulma ve serum sindirimine maruz kalan çıplak ve korumalı DNA origami görüntülerini gösterdi.
DNase I'in varlığında, iki saat sonra çıplak nanoyapılar tamamen sindirilirken, kitosan kapsüllü DNA origamisinin lineer polietilenin polikler, mililitre DNase I.Lineer polietilenin polikler iline göre DNA nanoyapılarını daha verimli bir şekilde korurken, dna nanoyapılarını daha verimli bir şekilde korur. Poliplezin N/P oranı arttığında DNA sindirimi daha düşüktü. Enzimkaplama sonra, veya daha fonksiyonel DNA origami sonra, lineer polietileninpoliksiler ve varyant N / P oranlarında chitosan ile, enzimatik aktivite ile dikkate değer bir girişim gözlendi.
Öte yandan, HRP enziminin kinetik önemli ölçüde DNA origami bağlandıktan sonra değişti. Bu iyi saflaştırılmış ile başlamak önemlidir, DNA origami yapıları. Çokkatyonlar alabilen daha sabit bir iplik çikar.
Onlar DNA origami polikler ayrılması zordur. Kaplama moleküllerimiz gen terapisi uygulamalarında da kullanılmaktadır. Bu, DNA nanoyapılarının gelecekte canlı organizmaların genomunu değiştirmek için kullanAbileceği anlamına gelir.
Agarose jel boyama için, genellikle moleküller DNA intercalate ve potansiyel olarak mutajenik kullanılır. DNA'yı boyarken lütfen laboratuvarınızın güvenlik talimatlarına uyun.
