Биологическая стабилизация наноструктур ДНК имеет важное значение для будущих виво-приложений, таких как целевая доставка лекарств. Тем не менее, ДНК деградирует в организме различными ферментами. Здесь мы представляем технику покрытия, которая защищает наноструктуры ДНК от энзиматической деградации.
Основные преимущества заключается в том, что наше покрытие состоит из нетоксичных соединений, которые уже используются в живых организмах, и что функционализация поверхности остается возможной. Эта функционализация имеет важное значение для включения молекулярных датчиков для распознавания целевых и переключателей для выпуска наркотиков. Поликационные покрытия значительно увеличивают клеточное поглощение инкапсулированных структур оригами ДНК, поэтому этот метод может открыть дверь для применения ДНК-оригамиса в диагностике и терапии.
Клеточное поглощение также необходимо для потенциального применения генов в нанотехнологиях ДНК. Я считаю, что метод довольно прост и может быть легко освоен. Для начала измерьте концентрацию очищенных оригами ДНК.
Используйте два микролитров буфера туберкулеза в качестве пробела для калибровки ультрафиолетового спектрофотометра. А затем измерить концентрацию оригами ДНК на 260 нанометров. Затем вычислите количество фосфатов в очищенной ДНК оригами раствор, используя формулу 2, как описано в рукописи.
Подготовьте 15 микролитров структуры оригами ДНК, включив в него одну наномолу фосфата, используя буфер туберкулеза для разбавления. Добавьте 13,2 микролитров к ТБ до 1,8 микролитров хитозана. И добавьте 15 микролитров хитозанового раствора в 15 микролитров оригами ДНК для разработки ДНК-оригами хитозан-полиплекса с соотношением N/P восемь.
Продолжить подготовку полиплексов различных соотношений N/P, используя расчеты, описанные в рукописи. Приготовьте 80 миллиметров трубки для 2%agarose геля. Добавьте 352 микролитера 2,5 мларного хлорида магния, а затем предварительно окрашивайте его 10 микролитров пятна геля ДНК.
Налейте гель раствор в сухую коробку геля. Вставьте гель электрофорез гребень и дайте ему затвердеть при комнатной температуре в течение 15 до 30 минут. Тем временем дополните бегущий буфер 11 миллимолярдным хлоридом магния.
Смешайте от 10 до 20 микролитров каждого образца с 20% буфера загрузки 6X. Загрузите образцы в колодцы агарозы геля, в том числе голые оригами ДНК в качестве контроля. Вы запустите гель на 70 вольт при комнатной температуре в течение двух с половиной до трех часов.
Затем используйте УФ-сканер для визуализации геля. Для выполнения анализа защиты DNase I добавьте четыре микролитера каждого полиплекса по сравнению с различными коэффициентами N/P, 1,5 микролитров буфера 10X DNase I, 8 микролитров туберкулеза и 1,5 микролитров DNase I в отдельную 2 миллилитровую ПЦР-трубку. Затем инкубировать же при 37 градусах по Цельсию в термоциклере в течение 24 часов.
Чтобы переварить DNase I, добавьте два микролитров по 20 миллиграммов на миллилитров протеиназы K и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию в термоциклере. Затем, чтобы разгадать основные наноструктуры ДНК добавить 3,6 микролитров 50 миллиграммов на миллилитр 40 килодальтонов декстран сульфата. Затем используйте эти образцы и свежие оригами ДНК в качестве контроля для выполнения агарозы гель электрофорез, как описано ранее.
Акцизная полоса, соответствующая загруженным образцам из геля. Для извлечения оригами ДНК используйте колонку для извлечения замораживания сжатия и следуйте инструкциям производителя и продолжайте с помощью изображения электронной микроскопии передачи отрицательных пятен, как описано в рукописи. Смешайте 6,5 микролитров очищенных 36 наномолярных HRP-NR с 6,5 микролитров поликаций различной концентрации.
Для подготовки полиплекса в соотношении N/P один, два, четыре, 10 и 20, подготовьте пустую группу, смешивая 6,5 микролитров дистиллированной воды с 6,5 микролитров поликаций различных концентраций, соответствующих соотношению N/P одного, двух, четырех, 10 и 20. Затем добавьте 12,5 микролитров каждого из этих подготовленных растворов в отдельный колодец из 96 пластин. Затем добавьте 72,5 микролитров буфера HEPES к каждой колодец и перемешайте.
Добавьте 10 микролитров 15 миллимолярной ABTS, а затем 5 микролитров перекиси водорода 12 миллимоляров к каждой хорошо и смешайте путем трубопроводов вверх и вниз. Наконец, используйте мультимодный считыватель пластин для измерения абсорбции на 421 нанометров в течение четырех часов. После анализа полиплексов с помощью анализа гелезащиты, произошло смещение голой наноструктуры в сторону катода, вероятно, из-за уравновешивания отрицательного заряда фосфатных групп при связывании с поликациями, а также увеличения размера комплекса.
При добавлении дополнительного количества полианионов, таких как декстран сульфат, полиплексное образование было обращено вспять. Декстран сульфат более высокого молекулярного веса показал свою эффективность по сравнению с более низким молекулярным весом. Проанализировав полиплексы с помощью электронной микроскопии передачи отрицательных пятен, микрографы показали голые наноструктуры ДНК оригами, линейные полиэтилениминные полиплексы после декапсулирования, хитозан-полиплексы, изображения обнаженных и защищенных ДНК оригами, подвергаемых истощению магния, энзиматической деградации и пищеварению сыворотки.
В присутствии DNase I, через два часа, голые наноструктуры были полностью переварены, в то время как линейные полиэтиленимин полиплексы хитозан инкапсулированных ДНК оригами остались нетронутыми в присутствии 10 единиц на миллилитр DNase I.Linear полиэтилениленимин полиплексы защищают наноструктуры ДНК более эффективно по сравнению с хитозан. Когда соотношение N/P полиплекса увеличивается, пищеварение ДНК было ниже. После покрытия фермента, или после более функционализированной ДНК оригами, с линейными политиленимин полиплексами и хитозаном в варианте N/P коэффициентов, никаких замечательных помех с ферментативной активностью не наблюдалось.
С другой стороны, кинетик фермента HRP резко изменился после связывания с оригами ДНК. Важно начать с хорошо очищенных структур оригами ДНК. Существует более стабильная нить, которая также может связываться с поликациями.
Их трудно отделить от полиплексов оригами ДНК. Наши молекулы покрытия также используются в применениях генной терапии. Это означает, что наноструктуры ДНК могут быть использованы в будущем для изменения генома живых организмов.
Для окрашивания геля агарозы, как правило, используются молекулы, которые интеркалируют ДНК и потенциально мутагеничны. Пожалуйста, следуйте инструкциям по безопасности вашей лаборатории при окрашивания ДНК.
