DNA 나노 구조의 생물학적 안정화는 표적 약물 전달과 같은 미래의 생체 내 응용 분야에 필수적입니다. 그러나, DNA는 각종 효소에 의해 바디에서 저하됩니다. 여기서 우리는 효소 분해로부터 DNA 나노 구조를 보호하는 코팅 기술을 제시합니다.
주요 장점은 우리의 코팅은 이미 살아있는 유기체에서 이미 사용되는 비 독성 화합물을 포함하고 표면의 기능화가 가능하다는 것입니다. 이러한 기능화는 약물 화물 방출을 위한 표적 인식 및 스위치를 위한 분자 센서를 통합하는 것이 중요합니다. 다각화 코팅은 캡슐화된 DNA 종이 접기 구조의 세포 통풍구를 크게 증가시므로 이 방법은 진단 및 치료에서 DNA 오리가미스의 적용을 위한 문을 열 수 있습니다.
세포 섭취는 DNA 나노 기술의 잠재적인 유전자 전달 응용 프로그램에도 요구됩니다. 나는 방법이 매우 간단하고 쉽게 마스터 할 수 있다고 생각합니다. 시작하려면 정제 된 DNA 종이 접기의 농도를 측정합니다.
UV 분광광광계를 보정하기 위해 빈 칸으로 TB 버퍼의 두 마이크로 리터를 사용합니다. 그리고 260 나노미터에서 DNA 종이 접기 농도를 측정합니다. 그런 다음 원고에 설명된 바와 같이 수식 2를 사용하여 정제된 DNA 종이 접기 용액에서 인산염의 양을 계산합니다.
희석을 위해 결핵 버퍼를 사용하여 인산염 의 나노몰 1개를 포함시킴으로써 DNA 종이 접기 구조의 15 마이크로리터를 준비합니다. 13.2 마이크로리터를 TB에 넣고 키토산 1.8 마이크로리터에 넣습니다. 그리고 DNA 종이 접기의 15 마이크로 리터에 키토산 용액의 15 마이크로 리터를 추가하여 8의 N /P 비율로 DNA 종이 접기 키토산 폴리 플렉스를 개발한다.
원고에 설명된 것과 같은 계산을 사용하여 다른 N/P 비율의 폴리플렉스를 계속 준비합니다. 2% 아가로즈 젤에 대한 튜브의 80 밀리그램을 준비합니다. 2.5 개의 어금니 마그네슘 염화물 352 마이크로 리터를 추가한 다음 DNA 젤 얼룩 10 마이크로 리터로 미리 얼룩지게하십시오.
젤 용액을 드라이 젤 상자에 붓습니다. 젤 전기 전구 빗을 삽입하고 15~30분 동안 실온에서 고형화하십시오. 한편 11 밀리모어 마그네슘 염화 마그네슘으로 실행 버퍼를 보완합니다.
각 샘플의 10~20마이크로리터를 6X 로딩 버퍼의 20%와 혼합합니다. 알몸 DNA 종이 접기를 포함하여 아가로즈 젤 우물에 샘플을 적재합니다. 2시간 반에서 3시간 동안 실온에서 70볼트에서 젤을 실행합니다.
그런 다음 UV 스캐너를 사용하여 젤을 시각화합니다. DNase I 보호 분석기를 수행하려면 서로 다른 N/P 비율에 비해 각 폴리플렉스의 마이크로리터 4개, 10X DNase I 버퍼의 1.5 마이크로리터, 8개의 TB 마이크로리터, DNase I의 1.5 마이크로리터를 별도의 2 밀리리터 PCR 튜브에 추가합니다. 그런 다음 24 시간 동안 열 순환기에서 섭씨 37도에서 동일한 배양합니다.
DNase I를 소화하려면 밀리리터 단백질Ase K당 20 밀리그램의 마이크로리터 2개를 추가하고 열사이클러에서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 핵심 DNA 나노 구조를 해명하기 위해 밀리리터 40 킬로달톤 더스톤 황산염당 50 밀리그램의 3.6 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이러한 샘플과 신선한 DNA 종이 접기를 대조군으로 사용하여 이전에 설명한 바와 같이 아가로즈 젤 전기 포전을 수행합니다.
젤에서 로드된 샘플에 해당하는 대역을 소비한다. DNA 종이 접기를 추출하려면 스퀴즈 동결 추출 열을 사용하고 제조업체의 지침을 따르고 원고에 설명된 바와 같이 부정적인 얼룩 전달 전자 현미경 이미징을 계속하십시오. 정제된 36 나노몰러 HRP-NR의 6.5 마이크로리터를 다양한 농도의 폴리시징 6.5 마이크로리터와 혼합합니다.
1, 2, 4, 10 및 20의 N/P 비율로 폴리플렉스를 준비하기 위해 증류수 6.5 마이크로리터를 1, 2, 4, 10 및 20의 N/P 비율에 대응하는 다양한 농도의 폴리케이션6.5 마이크로리터를 혼합하여 빈 그룹을 준비한다. 그런 다음 이러한 준비된 각 솔루션 의 12.5 마이크로리터를 96 웰 플레이트의 별도의 웰에 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 72.5 마이크로리터의 HEPES 버퍼를 추가하고 혼합합니다.
15 밀리머 ABTS의 마이크로리터 10개, 과산화수소 12마이크로리터 5개를 각 웰에 넣고 위아래로 파이프를 섞어 섞습니다. 마지막으로 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 4시간 동안 421 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 겔 지체 분석을 사용하여 폴리플렉스를 분석한 후, 음극을 향한 벌거벗은 나노구조의 변화가 있었는데, 이는 아마도 다각화에 결합할 때 인산염 군의 음전하의 균형을 맞추기 때문이며, 복합체의 크기가 증가했기 때문이다.
덱엑스트라황산염과 같은 폴리아니온의 추가량이 첨가되었을 때, 폴리플렉스 형성이 반전되었다. 더 높은 분자량의 Dextran 황산염은 낮은 분자량에 비해 더 효율적인 것으로 나타났다. 음의 얼룩 전염 전자 현미경을 사용하여 폴리플렉스를 분석한 결과, 현미경 사진은 알몸 DNA 종이 접기 나노 구조, 선형 폴리에틸레니민 폴리플렉스, 키토산 폴리플렉스, 알몸 및 보호 된 DNA 종이 접기 의 이미지, 효소 분해 및 세루미를 실시하는 것을 보여 주었다.
DNase I의 존재에서, 2 시간 후에, 벌거 벗은 나노 구조는 완전히 소화된 반면, 키토산 캡슐화 된 DNA 종이 접기의 선형 폴리에틸렌민 폴리 플렉스는 밀리리터 DNase I.Linear 폴리에틸레니민 폴리 플렉스가 DNA 나노 구조를 보다 효율적으로 보호하는 동안 그대로 머물렀다. 폴리플렉스의 N/P 비율이 증가하면 DNA 소화가 낮았습니다. 코팅 효소 후, 또는 더 기능화 된 DNA 종이 접기 후, 변이체 N /P 비율로 선형 폴리에틸렌성 폴리 플렉스 및 키토산을 사용하여 효소 활성에 대한 놀라운 간섭이 관찰되지 않았습니다.
한편, HRP 효소의 운동은 DNA 종이 접기에 결합한 후 극적으로 변화하였다. 잘 정제 된 DNA 종이 접기 구조로 시작하는 것이 중요합니다. 다변화에도 결합할 수 있는 안정형 가닥이 존재합니다.
그들은 DNA 종이 접기 폴리 플렉스에서 분리하기 어렵다. 우리의 코팅 분자는 또한 유전자 치료 응용 프로그램에서 사용됩니다. 이것은 DNA 나노 구조가 살아있는 유기체의 게놈을 바꾸기 위하여 미래에 이용될 수 있다는 것을 의미합니다.
아가로즈 젤 염색의 경우, 일반적으로 분자는 DNA를 교제하고 잠재적으로 돌연변이작용을 하는 데 사용됩니다. DNA를 염색할 때 실험실의 안전 지침을 따르십시오.
