Name: metagenomic analysis of silage
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metagenomic Analysis of Silage at JoVE.com

Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Site Location <ol><li> Coletar a amostra de silagem de um local apropriado, como uma fazenda. Aqui, a fazenda foi localizado em Ballydulea, Co. Cork, Irlanda (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. Extração de DNA NOTA: extracção de ADN foi realizada utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Um controlo negativo, que não continha qualquer amostra, foi usado em todo o processo de preparação da biblioteca. <ol><li> Adicionar 100-400 mg de amostra a 978 ul de tampão de fosfato de sódio e 122 uL de tampão de lise do solo no interior dos tubos de lise fornecidos. </li><li> Homogeneizar amostras colocando os tubos de lise para o homogeneizador durante 40 segundos a uma velocidade de 6,0 m / s. </li><li> Os lisados ​​de centrifugar a 14000 xg durante 15 minutos e transferir o sobrenadante para um tubo de micro-centrífuga limpo contendo 250 uL de proteína Precipitado Solução (PPS). Misture a solução por inversão 10 vezes e centrifugara 14000 xg durante 5 min. </li><li> Adicionar ao sobrenadante para uma matriz de ligação ao ADN ml num tubo de 15 ml de centrífuga limpo. Misture a solução por inversão do tubo constantemente durante 3 min. Deixar a mistura assentar durante 3 min, depois descartá-se 500 pL de sobrenadante. Misturar-se o sobrenadante restante. </li><li> Transferir 600 ul da suspensão para um filtro de centrifugação e centrifugar a 14000 xg durante 1 min. Descartar o filtrado e repetir o processo com a suspensão remanescente. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lavagem para a matriz de ligação ao ADN no interior do filtro de rotação, mistura por pipetagem, depois centrifugar a 14000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar o filtrado e centrifugar novamente o filtro de centrifugação a 14000 xg durante 2 minutos para garantir que todo o tampão de lavagem é removida. Seca-se o filtro de rotação a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Pré-quente (70 ° C) a água livre de DNase (DES) e re-suspender a matriz de ligação ao DNA em 100 mL de DES dentro do filtro de rotação. Transferir o filtro de rotação para um ambiente limpo 1,5 mL micro-centrífuga tuser e centrifugar a 14000 xg durante 1 min para eluir o DNA. Armazenar o ADN purificado a -20 ° C até análise posterior é executada. </li></ol> 3. Purificação de DNA Beads purificação usando DNA NOTA: Antes da preparação da biblioteca metagenômico o DNA extraído foi purificado utilizando esferas de purificação para garantir uma amostra de ADN puro foi obtido. <ol><li> Incubar os grânulos a 23 ° C durante 30 min antes da utilização. Adicionar 2 volumes de grânulos para a amostra de ADN e incubar a solução a 23 C durante 5 min. </li><li> Coloque as amostras em um íman separação durante 5 min e, em seguida, desprezar o sobrenadante. Lavam-se as esferas duas vezes com 200 mL de etanol fresco a 80% (EtOH). Ar secar os grânulos durante 10 min. </li><li> Retirar as amostras de separação do magneto e adicionar 50 ul de tampão de eluição (EB), misturar por pipetagem. </li><li> Incubar a suspensão a 23 ° C durante 5 min, após o que coloca as amostras de volta para o íman de separação durante 3 min. </li><li> Transfer o sobrenadante, que contém o DNA, para um tubo limpo. Descarte as contas. </li><li> Quantificar o DNA purificado conforme a secção quatro. </li></ol> 4. Quantificação do ADN purificado NOTA: O ADN purificado foi quantificado usando um fluorómetro e kit de ensaio de cadeia dupla (dsDNA) de alta sensibilidade (HS) seguindo as instruções do fabricante. <ol><li> Preparar uma solução de trabalho usando 199: 1 de tampão de reagente. </li><li> Adicionam-se 10 ul de cada padrão de ADN a 190 uL de solução de trabalho. </li><li> Adiciona-se 10 uL de ADN purificado a 190 uL de solução de trabalho. O volume final deverá ser de 200 uL. Incubar as amostras normais e de ADN a 23 C durante 2 min. </li><li> Analisar os padrões antes de as amostras de DNA no fluorímetro usando as instruções na tela. </li></ol> 5. Shotgun Sequencing Biblioteca Preparação NOTA: A biblioteca shotgun de sequenciação foi preparado usando umkit de preparação biblioteca comercial utilizando as instruções do fabricante. <ol><li> Diluir as amostras de DNA de 0,2 ng / mL usando EB. Qualquer amostra que já está abaixo desta concentração, isto é, o controlo negativo, é deixado na sua concentração actual. </li><li> Dissolvem-se 5 uL do ADN purificado com 10 ul de tampão e 5 ul mistura de enzima. Incubar as amostras a 55 C durante 5 min. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de neutralização e incubar a solução a 23 C durante 5 min. </li><li> Adicionar 5 uL de cada um dos índices de sequenciação específicos de amostra e 15 ul de PCR Master Mix. </li><li> Num termociclador, incubar as amostras a 72 ° C durante 3 min, 95 C durante 30 s, antes de 12 ciclos de 95 C durante 10 s, 55 C durante 30 s e 72 C durante 30 s. Incubar as amostras a 72 finalmente C durante 5 min. </li><li> Purifica-se o ADN preparado utilizando o talão de purificação como antes, mas com uma eluição final de 30 mL de EB. </li></ol> 6. Library Quantidade e Verificação da Qualidade NOTA: A quantidade e qualidade das bibliotecas preparadas foram avaliadas utilizando um kit comercial e instrumentação. <ol><li> Incubar os componentes do kit a 23 ° C durante 30 min antes da utilização. </li><li> Adicionar 2 mL de ADN de 2 mL de tampão e vortex durante 1 min a 2000 rpm. </li><li> Girar a amostra para assegurar que está na parte inferior do tubo. </li><li> Insira os tubos de amostra, fita de análise e dicas para o instrumento, e realizar análises conforme indicado pelo software. </li></ol> Sequencing 7. DNA <ol><li> Transferir as amostras bibliotecas de sequenciamento de DNA preparados e quantificáveis para um serviço de sequenciação e sequência usando 300 pb final emparelhado sequenciamento 45. </li></ol> 8. Análise de Dados de Sequência bruto NOTA: Os comandos para cada programa usando um sistema operacional Linux são mostrados abaixo do salto de protocolo. A tubagem utilizada para sanálise de dados equence é mostrado na Figura 1. Os programas devem ser instalados pelo usuário antes da análise. Este processo deve ser realizado separadamente para cada amostra. <ol><li> Analisar e visualizar dados de sequência de DNA usando FastQC 46, digitando na linha de comando / path-to-file / fastqc, seguido pela frente e verso, cru lê raw_read2.fastq raw_read1.fastq. </li><li> Especifique uma pasta de saída, digitando output_fastqc -o eo formato de arquivo dos arquivos de leitura em bruto por fastq -f. </li><li> Ver o arquivo de saída (Figura 2). path-to-file / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Controle de Qualidade aparamento e Dados Sequence Filtering <ol><li> Execute o programa de corte, Trimmomatic 28 digitando na linha de comando java -jar / path-to-file / trimmomatic-0.35.jar. </li><li> Especificar os arquivos estão emparelhados arquivos finais, digitando &quot;PE&quot;. Estado que 16 pr Centralunidades ocessing (CPUs) deve ser utilizado pelo programa escrevendo -threads 16. </li><li> Liste os dois arquivos para verificar QC, digitando os nomes da frente cru e reverter lê. O prefixo dos arquivos de saída é determinado digitando silagem -baseout. </li><li> Definir as opções para o programa digitando ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 principais: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 CROP: 200 HEADCROP: 15 minLen: 36. </li><li> Uma vez completo, analisar as sequências aparadas usando FastQC como antes e comparar a saída para os dados de sequência de matérias para garantir o corte foi realizado com sucesso. NOTA: A ferramenta de software, Trimmomatic, aparado lê mais, removendo líder baixa qualidade ou bases N (abaixo qualidade 3), a remoção de fuga de baixa qualidade ou bases N (abaixo qualidade 3) e analisando cada lido com um 4-base da janela ampla deslizante. Os parâmetros foram ajustados para o corte quando a qualidade média por base de cair abaixo de 20 e depois para soltar qualquer lê abaixo de 36 bases de comprimento. Finalmente, 15 bases foram cortadas from a cabeça de cada ler e lê foram cortadas para manter 200 bases a partir do início da leitura. Esta etapa final foi realizada para superar alguns problemas de qualidade quando sequenciar longo (&gt; 200 pb) lê. Estes podem ser ajustadas para amostras específicas 28. java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout silagem ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 principais: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 CROP: 200 HEADCROP: 15 minLen: 36 </li></ol> Assembléia metagenoma 10. <ol><li> Mesclar a não pareado, aparado lê digitando cat seguido pelo não emparelhado lê; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Escrever os arquivos para um novo arquivo digitando&gt; silage_merged_unpaired.fastq cat silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Para de novo montar o DNA sequenciado, usar Espadas (St. Petersburg genoma assembler) 30 digitando / path-to-file / spades.py. Especificar que CPUs 16 estão a ser utilizados, digitando -t 16 e que o parâmetro metagenômico deve aplicada escrevendo --meta. </li><li> Identificar os aparado frente lê usando -1 silage_read1_paired.fastq eo reverso lê por -2 silage_read2_paired.fastq. A não pareado mesclada lê são especificados por silage_merged_unpaired.fastq -s. </li><li> Definir a pasta de saída, digitando -o silage_spades. path-to-file / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11.-end Emparelhado Leia Sobreposição <ol><li> Mesclar pares de sequência de DNA lê usando FLASH (Ajuste Rápido comprimento de curto Lê) 29 digitando na linha de comando / path-to-file / flash. Especificar que CPUs 16 deve ser usado usando -t 16 e o ​​prefixo saída digitando -o silagem. </li><li> Identificar aparado lê digitando silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq caminho para arquivo / flash -t 16 -o brilhou silage_read2_paired.fastq silage_read1_paired.fastq </li></ol> 12. taxonômica Classificação <ol><li> Tipo / path-to-file / kraken e especifique o banco de dados digitando --db / caminho-para-arquivo / standard. </li><li> Definir que 16 CPUs deve ser usado digitando --threads 16 e identificar uma pasta de saída usando --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Digite o nome do arquivo de entrada; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq path-to-file / padrão --db kraken --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOTA: A classificação dos andaimes de sequência de ADN montados usando Kraken 7 foi completado contra o mais recente banco de dados, padrão Kraken que continha todas as sequências do genoma Prokaryote disponíveis. </li><li> colunas de transferência de 2 e 3 do arquivo de saída e para um novo arquivo digitando corte -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Abra o arquivo de saída no navegador web. cortar -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importar o novo arquivo para Krona 12 digitando ktImportTaxonomy. Especifique o arquivo de entrada, digitando FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Identificar o arquivo de saída, digitando -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html. path-to-file / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. anotação funcional <ol><li> Ir para 47 site da MG-RAST, http://metagenomics.anl.gov/. Registre-se como um novo usuário, se necessário. Após o login, clique no botão &quot;Upload&quot;. Faça o upload dos andaimes montados a partir do Passo 10. </li><li> Uma vez que os arquivos foram enviados, clique em &quot;Enviar&quot; e siga as instruções e aguardar a conclusão da análise. </li><li> Após a análise for concluída, consulte o link enviado via email da MG-RAST, ou, em alternativa, clique em &quot;Progress&quot;. Há uma lista de trabalhos concluídos. Clique na ID de trabalho relevante e, em seguida, o link para a &quot;página de download&quot;. </li><li> Na página de download, sob o título &quot;Clustering Protein 90%&quot;, clique no botão de proteína para baixar o arquivo de proteína prevista, 550.cluster.aa90.faa. </li><li> Para classificar as proteínas como supostamente pertencentes a uma determinada classe de enzimas cazy, comparar as proteínas transferidas para o banco de dados cazy 48. Baixar as enzimas Carboidratos-ativos banco de dados (cazy) de arquivos são: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip e PL.zip. Esses arquivos representam as seguintes classes de enzimas, respectivamente: Actividades Auxiliares (AA), hidrato de carbono Esterases (CE), glicosídeo hidrolases (GH), glicosil transferases (GT) e polissacarídeo Liases (PL). </li><li> Descompacte os arquivos de bancos de dados e anotar as proteínas determinando a similaridade de proteína para as proteínas de banco de dados cazy usando o algor USEARCH UBLASTithm 49. Para usar um loop bash (for i in * .txt) para percorrer a 5 de banco de dados tipo de arquivos .txt &quot;for i in * .txt; fazer&quot;. </li><li> Execute USEARCH digitando / path para arquivo / usearch8 com o -ublast parâmetro, a fim de usar o algoritmo ublast. Em seguida, digite o nome do arquivo de sequência de proteína baixado MG-RAST &quot;, mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Para indicar o arquivo de banco de dados para ser utilizado tipo &quot;-db $ i&quot; e especificar o limite de E-valor em 1e -5, digite &quot;-evalue 1e-5&quot;. </li><li> Para terminar a pesquisa após a descoberta de uma sequência alvo e, por conseguinte, a classificação da referida sequência de proteína como pertencendo à classe das enzimas-alvo, por exemplo, GH, tipo &quot;-masaccepts 1&quot;. </li><li> Para definir que 16 CPUs deve ser utilizado tipo &quot;-threads 16&quot; e especificar o formato do arquivo de saída como tipo de texto &quot;-blast6out&quot; separados por ATAB. Para identificar o tipo de arquivo &quot;$ i.ublast&quot;. Para terminar o loop festança, tipo &quot;; feito&quot; for i in * .txt; fazer / caminho-para-arquivo / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; feito </li></ol> 14. A visualização cazy Anotação <ol><li> Para visualizar a saída a partir da anotação cazy como um diagrama de Venn, gerar listas ID proteína para cada classe de enzimas utilizando uma ansa festa. Tipo &quot;for i in * .ublast; fazer&quot;. </li><li> Para transferir coluna 1 do arquivo de saída e para um novo arquivo, digite &quot;cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Terminar o loop e tipo &quot;; done&quot;. </li><li> Abra os arquivos .list em um editor de texto. Ir para o site, selecione o número de conjuntos como 5 e colar o conteúdo de cada arquivo de lista em uma caixa separada. Baixe o diagrama resultante como um arquivo .SVG. for i in * .ublast; fazer cat $ i | cortar -f 1&gt; $ i.list; feito </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Embora uma análise in silico pode dar uma excelente visão para as comunidades microbianas que estão presentes nas amostras ambientais, é crítico que as classificações taxonómicos demonstrou ser realizada em associação com os controlos relevantes e que uma profundidade adequada de sequenciação foi obtida para capturar a totalidade população presente 51. Com qualquer análise computacional, existem muitos caminhos para atingir um objetivo similar. Os métodos que usamos neste estudo são exemplos de métodos adequados e direta, que foram trazidos em conjunto para alcançar uma gama de análises sobre o microbioma silagem. A variedade e um número cada vez maior de ferramentas e técnicas de bioinformática estão disponíveis para analisar os dados metagenomic, por exemplo Phylosift 8 e MetaPhlAn2 52, e estes devem ser avaliados antes da investigação por sua relevância para a amostra ea análise required 53. métodos de análise metagenomic são limitados pelos bancos de dados para disponíveis para a classificação, a profundidade de sequenciação e a qualidade do sequenciamento. O processamento de bioinformática demonstrado aqui foi realizada num aparelho mecânico local, um elevado; no entanto sistemas baseados em nuvem também estão disponíveis. Estes serviços baseados em nuvem permitem o aluguer do poder computacional necessário sem ter o investimento de alto custo de uma estação de trabalho local poderosa adequado. Uma aplicação potencial deste método seria para avaliar a silagem antes da sua utilização na agricultura para garantir que não há bactérias potencialmente nocivas estão presentes, portanto, impedindo-os de entrar na cadeia alimentar.

Metagenomics é a análise directa de ADN purificado a partir de comunidades biológicos encontrados nas amostras ambientais 1 e foi originalmente usado para detectar bactérias unculturable encontrados em sedimentos 2. Metagenomics tem sido amplamente utilizada para um número de aplicações, tais como a identificação da microbiota humano 3, classificando as populações microbianas dentro do oceano 4 e até mesmo para a análise das comunidades de bactérias que se desenvolvem em máquinas de café 5. A introdução de tecnologias de sequenciamento de próxima geração resultou em maior rendimento de sequenciação e de saída. Consequentemente, sequenciamento de DNA tornou-se mais económica 6 e a profundidade de sequenciação que pode ser executada aumentou consideravelmente, permitindo metagenômica para se tornar uma poderosa ferramenta analítica. Melhorias &quot;Front-end&quot; no aspecto prático, molecular de sequenciamento metagenomic têm impulsionado o crescimento do noferramentas de bioinformática silico disponíveis para a classificação taxonómica 7-9, anotação funcional 10,11 e representação visual 12,13 de dados de sequência de DNA. O crescente número de disponíveis, sequenciado procariotas e eucariotas 14 genomas permite ainda mais a precisão na classificação de comunidades microbianas, que são invariavelmente realizadas contra um &quot;back-end&quot; de banco de dados de referência de genomas seqüenciados 15. Duas abordagens principais podem ser adotados para análise metagenômica. O método mais convencional é a análise do gene 16S rRNA região de codificação do genoma bacteriano. O ARNr 16S é altamente conservada entre espécies procariotas mas apresenta nove regiões hiper-variáveis (V1 - V9), o que pode ser explorado na identificação de espécies 16. A introdução de mais sequenciação (≤ 300 pb final emparelhado) permitiu a análise de sequências de ADN que abrangem duas regiões hiper-variáveis, nomeadamenteo V3 - V4 região 17. Avanços em outras tecnologias de seqüenciamento, tais como Oxford Nanopore 18 e PacBIO 19, que permitem que todo o gene 16S rRNA a ser sequenciado de forma contígua. Enquanto as bibliotecas baseadas 16S rDNA proporcionar uma abordagem orientada para a identificação de espécies e permitir a detecção de ADN de baixo número de cópias que ocorre naturalmente dentro de amostras purificadas, bibliotecas shotgun de sequenciação permitir a detecção de espécies que podem conter regiões de DNA que sejam ou não amplificável por 16S sequências de iniciadores de ARNr marcador utilizado, ou porque as diferenças entre a sequência do molde e a sequência de amplificação do iniciador são muito grandes 20,21. Além disso, apesar de as polimerases de ADN tem uma alta fidelidade da replicação de ADN, no entanto, os erros de base pode ocorrer durante a amplificação por PCR e estes erros incorporados pode resultar na classificação errada das espécies originárias 22. Desvios na amplificação por PCR do modelo SEQuencia também pode ocorrer; sequências de ADN com um elevado teor de GC pode ser representada sob a piscina em amplicão finais 23 e similarmente modificações de bases não naturais, tais como a timina glicol, pode interromper as polimerases de ADN causando falhas na amplificação de sequências de ADN 24. Em contraste, uma biblioteca de ADN shotgun de sequenciação é uma biblioteca de DNA que foi preparado usando todo o DNA purificado que foi extraída a partir de uma amostra e, subsequentemente, fragmentadas em comprimentos de cadeia de DNA mais curtos antes da preparação para a sequenciação. A classificação taxonómica das sequências de ADN gerados pela sequenciação espingarda é mais exacto quando comparado com o rRNA 16S amplicão sequenciação 25, embora o custo financeiro necessário para atingir uma profundidade de sequenciação de confiança é maior do que a do fragmento amplificado de sequenciação 26. O principal benefício de espingarda sequenciamento metagenômica é que as regiões sequenciadas dos vários genomas na amostra estão disponíveis para a prospecção de genes depois de terem sidofoi taxonomicamente classificada 27. dados de seqüência metagenômica é analisado por uma gama cada vez maior de ferramentas de bioinformática. Essas ferramentas são capazes de executar uma ampla variedade de aplicações, por exemplo, análises de controle de qualidade dos dados de sequência de matérias-28, a sobreposição de final emparelhado lê 29, de novo montagem de sequência lê para contigs e scaffolds 30,31, classificação taxonômica e visualização da sequência lê e montados sequências 7,12,32,33 e a anotação funcional das sequências montados 34,35. Silagem, produzido por agricultores em todo o mundo a partir de cereais fermentados, como o milho (Zea mays), é predominantemente utilizado como alimento para o gado. A silagem é tratada com a bactéria Lactobacillus sp. para ajudar a fermentação 36 mas até à data, não há conhecimento limitado das outras populações microbianas encontradas em silagem. o fermentadosprocesso n pode levar a microrganismos indesejáveis e potencialmente prejudiciais se tornando predominantes dentro da silagem 37. Além de bolores e leveduras, bactérias são particularmente adaptáveis ao ambiente anaeróbio em fermentação de silagem e são mais frequentemente associados com doenças no gado, em vez do que a degradação da silagem 38. Bactérias ácido butírico pode ser adicionado inadvertidamente a partir do solo permanece durante o enchimento do silo de silagem e é capaz de converter o ácido láctico, um produto de digestão anaeróbica, para o ácido butírico, aumentando, assim, o pH da silagem 39. Este aumento no pH pode levar a um surto de bactérias de deterioração que, normalmente, seria incapaz de sustentar o crescimento em condições de fermentação óptima silagem 38. Clostridium spp. , Listeria spp. e Bacillus spp. são particularmente preocupantes, especialmente em silagem para alimentação de gado leiteiro, como esporos de bactérias que sobreviveram desatrato ointestinal 40 podem entrar na cadeia alimentar, levar à deterioração dos alimentos e, em casos raros, à sanidade animal e mortes humanas 37,39,41-44. Além disso, embora seja difícil estimar o impacto econômico exata de tratamento veterinário e perda de gado causado pela deterioração de silagem, é provável que seja prejudicial para uma fazenda, se um surto estava a ocorrer. Supõe-se que ao utilizar uma abordagem metagenômica podemos classificar as populações microbianas que estão presentes em amostras de silagem e, além disso, identificar as comunidades microbianas associadas com a deterioração da silagem que, por sua vez, potencialmente, ter um efeito negativo sobre os animais domésticos, permitindo medidas correctivas a ser tomadas antes da silagem é para ser usado como uma fonte de alimento.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Antes do processamento de bioinformática, sequência cru lê foram aparadas e adaptadores foram removidos usando software Trimmomatic 28. Depois do passo de limpeza e filtração, o número de leituras foi reduzida para 50% da sequência lê-se (Tabela 1). A pontuação média de base Phred era&gt; 30 depois de controle de qualidade (Figura 2). Pares de sequências de DNA que tinham regiões sobrepostas foram fundidas usando o software Flash 29 para gerar única já não lê, não sobreposta lê foram mantidos em um arquivo separado. 45.47% lê (105.343), combinada com sucesso. Após a sobreposição de leituras usando FLASH de leituras, as resultantes fragmentos estendidos foram submetidos a classificação taxonômica bacteriana usando software Kraken 7 e foram posteriormente visualizados com software Krona (Figura 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; A maioria das espécies de bactérias presentes na metagenome silagem são encontrados dentro de 4 filos procariótica: Firmicutes (34%), Actinobactérias (28%), Proteobacteria (27%) e Bacteroides (7%) . A distribuição de classes presentes dentro destes filos pode ser visto na Figura 4. As espécies mais abundantes no metagenome foram Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobactérias), Propionibacterium spp. (3%; Actinobactérias) e Prevotella spp. (3%; Bacteroides). Espécies importantes para a saúde animal e implicados na doença também foram observados; Clostridium spp. (1%) de Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) foram previstos para estar presente na amostra de ensilagem. anotação funcional foi realizado em montado lê. O metagenome foi montado utilizando o montador pás 30 usando o aparadas e filtradaemparelhado-end e não emparelhado lê gerando 92,284 andaimes. A fim de identificar as celulases, as proteínas foram preditos usando MG-RAST e anotado usando as enzimas de carboidratos-ativos banco de dados (cazy). Dos 97,562 proteínas preditas, 6357 foram anotados como uma enzima de hidrato de carbono-activo putativo em uma das cinco classes de enzimas que compõem a base de dados cazy (Figura 5). Os resultados foram visualizados como um diagrama de Venn usando software InteractiVenn 50 que mostra a distribuição de notas de proteínas, incluindo aqueles que contêm mais do que uma classe de enzimas cazy anotação. Destes, 3861 foram previstos como tendo actividade beta-glicosidases e vai ainda ser caracterizado no laboratório para confirmar a função. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Figura 1: Bioinformatic Metagenomics Pipeline para Análise de Silagem. Duas abordagens principais foramusado para investigar o microbioma da silagem, classificação taxonômica e anotação funcional. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Figura 2: Qualidade Sequence Per-base antes e após o corte e remoção do adaptador. A trama de qualidade per-base de sequência de FASTQC mostra a pontuação média Phred em todo o comprimento da sequência lê controle pré e pós-qualidade. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Figura 3: taxonômica Classificação do bacteriana Microbiome de Silagem Sólido. Classificação da sequência aparado e sobreposição lê a partir FLASH foi realizada utilizando Kraken 7 e posteriormente visualizados com coroa. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Figura 4: Classe taxonômica Distribuição do 4 Filos mais abundante no bacteriana Microbiome de Silagem Sólido. A percentagem de cada classe de bactérias dentro das quatro filos mais abundante. Firmicutes: Clostridia (vermelho) e bacilos (azul escuro); Proteobactérias: delta / epsilon (rosa), alfa (azul-claro), gama (laranja) e beta (turquesa); Bacteroidetes: Flavobacteriia (azul escuro) e Bacteroidia(verde pálido); Actinobacteria: Coriobacteriia (roxo escuro) e outros actinobactérias (verde escuro). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Figura 5: cazy anotação do Proteome prevista no sólido Silagem Microbiome. diagrama de Venn mostra a distribuição das cinco classes de enzimas de anotações cazy no proteoma previsto de microbioma silagem sólido. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw lê </td><td rowspan="2"> # Filtrada lê (emparelhado) </td&gt; <td> # Filtrada lê </td><td rowspan="2"> # Brilhou lê </td></tr><tr><td> (Emparelhado) </td><td> (Não pareado) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1.892.534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resumo da tabela de Sequenciamento Lê.

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Análise metagenômica de Silagem

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

18.1K visualizações.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

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Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Genética

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Avaliando o impacto da fratura hidráulica nos córregos usando assinaturas moleculares microbianas

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biologia

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Um método de extração de DNA híbrido para a Avaliação de comunidades bacterianas Qualitativa e Quantitativa de amostras de produção de aves de capoeira

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Análise metagenômica de Silagem

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Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Avaliando o impacto da fratura hidráulica nos córregos usando assinaturas moleculares microbianas

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

Um método de extração de DNA híbrido para a Avaliação de comunidades bacterianas Qualitativa e Quantitativa de amostras de produção de aves de capoeira

Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais