O trabalho de pesquisa reportado nesta publicação foi apoiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio número R35GM124913, programa de incentivo de PI4D Universidade de Purdue e PVM interno competitivo Programa de fundos de pesquisa básica. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos agentes de financiamento. Agradecemos a construção Tol2, Michael Lin para a construção de ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon para a promotora ubi construir através de Addgene.

O zebrafish estão alojados em instalações animais AAALAC-aprovado, e todos os experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado do Animal de Purdue e Comissão de utilização (PACUC).
1. Tol2 Transposon plasmídeo construção preparação
Nota: Tol2, um transposon que foi descoberto no peixe medaka, tem sido amplamente utilizado na Comunidade de investigação o zebrafish8,9. Foi com sucesso adoptado para o Gateway site-specific recombinação sistema baseado em clonagem e conhecido como o Tol2 do kit10. O kit Tol2 permite uma maneira mais conveniente de criar construções personalizadas de expressão, enquanto também aumenta a eficiência da transgênese. Assim, foi uma decisão fácil para tirar vantagem deste sistema e criar uma linha onipresente de zebrafish expressão ASAP1 usando um promotor validado ubiquitin para conduzir ASAP111.
<ol><li>Criando uma construção de entrada meio ASAP1: pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Adquira a construção de sensor ASAP1 tensão geneticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmídeo #52519), de Addgene. Para amplificar a região codificante ASAP1, configure uma PCR utilizando primers personalizados (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) ladeados com sequências attB na extremidade 5' dos primers (Figura 1). Phusion DNA polimerase foi escolhido por sua alta eficiência, e condições PCR foram otimizadas com base no protocolo previamente publicado12.</li>
		<li>Carregar os produtos PCR 50 µ l em um 1% TAE gel usando uma pipeta regular com dicas de 200 µ l e executar eletroforese em 160 V em um tanque de gel de horizontal por cerca de 30 min.</li>
		<li>Verifique o gel sob um transiluminador UV (353 nm), excisar a banda desejada usando um lâmina/bisturi sob um transiluminador UV como anteriormente publicado13,14e coloque a amostra do DNA contendo gel em microcentrifuga limpa 1,5 mL tubo.</li>
		<li>Execute o gel de purificação para os produtos de PCR ASAP1. Recuperar o DNA no gel extirpado usando um kit comercial de purificação gel ADN seguindo as instruções do fabricante e eluir o DNA em 20 µ l de água. Tomar 1 µ l de como uma amostra e medir a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro. Fluxo as instruções de software utilizando a água como um controle em branco15.</li>
		<li>Pegue 100 ng de purificado o produto do PCR e misturá-lo com 150 ng do plasmídeo pDONR221 em 10 µ l de TE buffer (10 mM Tris, pH de 1 mM EDTA 8.0)16. Adicionar 2 µ l de BP Clonase II para a reação e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Execute a transformação. A reação de transferência e misturá-lo com 50 µ l de Top10 competentes de Escherichia coli células e incubar as células no gelo por 30 min. Em seguida, transferência imediatamente, o tubo de reação em um banho de água de 42 ° C por 1 min. Retire o tubo e incubar no gelo por 2 min. Em seguida, colocar o tubo em um shaker de 37 ° C e incube por 1h.</li>
		<li>Retire o tubo e as células em um prato de canamicina LB da placa. Em seguida, incubar a placa durante a noite (16-18 h) a 37 ° C.</li>
		<li>Escolha única e bem separadas colônias e inoculá-los em tubos de cultura de células de 14 mL com 3 mL de meio LB. Cultura-los durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm (rotação por minuto).</li>
		<li>Execute miniprep usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instrução17.</li>
		<li>Sequência 3-4 plasmídeos com Sanger sequenciamento identificar positivo pDONR221-ASAP1 clones usando M13F e M13R iniciadores de sequenciamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criando a construção Tol2 para microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1<ol>
<li>Escolha que o sequenciamento e verificados pela medida pDONR221-ASAP1 clone sua concentração de DNA usando uma sequência de espectrofotômetro a instruções de software utilizando a água como um espaço em branco controlar15.</li>
		<li>Pegue 100 µ g de pDONR221-ASAP1 e misture com 100 µ g de plasmídeo de 5-final do Tol2 kit (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g de p3E-polyA (kit de Tol2 #302) e 150 µ g de pDestTol2pA2 (kit de Tol2 #394). Ajustar o volume total de 8 µ l usando TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) numa microcentrifuga 1,5 mL do tubo e misture bem por um vórtice de breve s 2-5. Em seguida, adicionar 2 µ l de LR Clonase II plus e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação usando uma pipeta de 10 µ l e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Realizar a transformação e identificar clones positivos, como descrito acima (passos 1.1.7-11).</li>
		<li>Medida a concentração de DNA de sequenciamento verificado clone pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) usando um espectrofotômetro15. Normalmente, a concentração é em torno de 200ng / µ l.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. prepare Tol2 Transposase mRNA e injeção de solução
<ol><li>Raia Escherichia coli glicerol estoque de pCS2FA-transposase plasmídeo (kit de Tol2 #396) em uma placa LB (com 100 ampicilina µ g/mL) com uma ansa de inoculação esterilizado. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora durante a noite. No dia seguinte, escolher uma única colônia e inoculá-lo em 3 mL de LB (Ampicilina 100 µ g/mL) com uma ponta de pipeta de 10 µ l esterilizado. Cultura-lo durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm.</li>
	<li>Execute miniprep na cultura de Escherichia coli usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instruções. Eluir Plasmídeo em 30-50 µ l de tampão TE por 1 minuto centrifugação a 14.000 rpm e medir sua concentração de DNA com um espectrofotômetro.</li>
	<li>Linearizar 1-2 µ g do plasmídeo com eu não endonuclease e purificar o DNA com um DNA kit eu não seguindo o seu manual de instruções de limpeza digestão. Eluir o DNA em 5 µ l de água por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. A concentração esperada é de 200-300 ng / µ l.</li>
	<li>Executar em vitro transcrição com não eu linearizada transposase-pCS2FA como um modelo de DNA usando um kit de transcrição comercial SP6.</li>
	<li>Quando a reação estiver terminada, purifica Tol2 transposase mRNA usando um RNA de limpeza comercial kit seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, eluir mRNA na água de RNAase livre 20 µ l e medir a concentração de RNA em um espectrofotômetro. A concentração esperada é sobre 1-3 µ g / µ l. as amostras podem ser armazenadas em um freezer-80 ° C, se necessário.</li>
	<li>Preparar a solução de microinjeção misturando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-ASAP1 e Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ l) em um tubo de microcentrifugadora por pipetagem. Para prevenir a degradação do ácido nucleico causada por repetidos descongelar e recongelar, alíquota 6 µ l pelo tubo e armazená-lo em um freezer-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>3. microinjection
<ol><li>Conjunto 4-6 tanques de criação pelo menos 2 machos e 2 fêmeas a tarde antes da injeção. Estes peixes não devem ser alimentados à tarde. Esta etapa irá reduzir a quantidade de resíduos de peixe e economizar tempo para limpá-los na manhã seguinte, enquanto também ajuda a induzir uma resposta de reprodução.</li>
	<li>Na manhã seguinte, retire a solução preparada de injeção (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construção e Tol2 mRNA) do congelador a-80 ° C e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Puxe os divisores nas tanques de piscicultura e permitir que os peixes acasalar. Em geral, peixes depositam ovos dentro de 20-30 minutos depois de puxar para fora o divisor. Se não, espere 1-2 horas a mais. Alguns peixes não podem colocar ovos em tudo. Neste caso, repita este experimento para colheita de embriões de peixe.</li>
	<li>Enquanto espera, certifique-se que existem agulhas preparadas com a ponta quebrada em um ângulo, criando uma borda chanfrada com fórceps, ou quebrando em um limpador de tarefa delicada.<ol>
<li>Puxe as agulhas de vidro capilar um puxador de micropipeta usando os seguintes parâmetros: aqueça 545; Puxe a 60; velocidade 80; tempo 250; pressão de 500. Quebre a agulha com pinça debaixo de um escopo de dissecação (com a parte do olho régua para estimativa de diâmetro), mantendo-se a pinça a um ângulo de aproximadamente 45 °. Diâmetros de agulha desejada podem ser variável dependendo das configurações de microinjector, mas menor diâmetro é preferível para diminuir a mortalidade do embrião.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que os peixes têm ovos, recolhê-los em um diâmetro de 10 cm de Petri e trazê-los para o escopo de dissecação. Remover todos os embriões anormais e resíduos de peixe.</li>
	<li>Pipetar os embriões fertilizados para a injeção de agarose preparado a 3% do molde. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.</li>
	<li>Uma vez que todas as linhas estão cheios de embriões viáveis, organizá-los para que as células únicas todas enfrentam o mesmo sentido em direção a agulha, que é aproximadamente um ângulo de 45° na horizontal. Isto facilitará injeção muito mais tarde.</li>
	<li>Usando luvas, usar uma pipeta de carregamento de 20 µ l ponta e retire o tubo no gelo 5 µ l de construção de preparado.</li>
	<li>Introduza cuidadosamente a ponta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde começa a seringueiro, para obter o reagente mais perto da ponta. Se ainda existem bolhas de ar, agite a seringa, certificando-se de não quebrar a ponta.</li>
	<li>Introduza a agulha direto para o suporte da agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permanece no lugar. Ajuste o ângulo de aproximadamente 45°.</li>
	<li>Uma vez que a agulha é preparada e ligada, ligue o microscópio e gás tanque de pressão. Comercial CO2 tanques são geralmente bons para essa finalidade. O volume de injeção é ajustado pela pressão de exploração e ejeção: aproximado de 0,5 psi para exploração e 30 psi para ejeção. Certifique-se de verificar que a solução vem quando pressionando o pedal.</li>
	<li>Usando um micrômetro de palco com uma gota de óleo mineral, ajustar o volume e o fluxo da solução a ~ 150 µm de diâmetro (cerca de 2 nL). Certifique-se de que a pressão de retorno vai deixar uma pequena quantidade a escorrer para fora da agulha. Se não houver pressão suficiente, ação capilar causará líquido inserir a agulha e destruir o mRNA.</li>
	<li>Uma vez que a agulha é calibrada, começam a injetar a construção para a única célula dos embriões fertilizados. Nota: Isto leva a uma grande quantidade de prática, paciência e sutileza, devido à membrana celular, sendo difícil de furar. É importante injectar a solução dentro da célula, não a gema, para a geração de zebrafish transgênico. Isso é diferente de Morpholinos injeção. Não importa de que lado a agulha entra na célula, enquanto a construção vai na célula. A transgênese terá uma taxa muito baixa de sucesso se injetado a gema ao invés da célula. Injeção de célula única fase também é importante, ou peixe Quimera somática será criado. Isso reduzirá a possibilidade do transgene entrando para as células germinativas.</li>
	<li>Use a borda do gel de entalhe para fornecer um revestimento protetor que mantém o embrião no lugar e permite que a agulha aplicar pressão sem mover o embrião. Uma vez que a ponta da agulha na única célula, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução. Repita este processo para todos os embriões.</li>
	<li>Quando concluído, transferi os embriões injetados num prato rotulado enxaguando-os fora do entalhe de agarose com sistema de água de peixes e uma pipeta de transferência descartável 3,4 mL. Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 ° C para deixá-los a desenvolver. Verifique volta ao longo do dia removendo embriões de peixe morto e substitua a água com azul de metileno 0,1% em água de peixe.</li>
	<li>Cerca de 6-8 horas após a injeção, tome 10 indivíduo injetado embriões de peixe e preparar o DNA genômico de-los usando o método de Hotshot18.</li>
	<li>Na manhã seguinte, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz de fluorescência para classificar para fora os embriões mostrando GFP nos tecidos não-gema. Estes embriões de peixe devem conter a construção injetada.</li>
	<li>Realize o ensaio de impostos especiais de consumo Tol2 para verificar a atividade do transposon conforme descrito anteriormente,19. Se o plasmídeo excisado pode ser detectado, manter o injetado embriões de peixe e criá-los. Se nenhum plasmídeo excisado pode ser detectado, repita o processo de síntese e microinjeção de mRNA Tol2 até alcançar os resultados positivos do ensaio de impostos especiais de consumo do Tol2.</li>
</ol>4. a criação de peixes transgênicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
<ol><li>Levante o peixe injetado (geração de0 F) até a idade adulta, conforme descrito anteriormente no zebrafish livro20. Isto geralmente leva cerca de 4 meses.</li>
	<li>Tirar um único adulto F0 peixe e cruzá-lo com um único oposto sexo sua peixe. Colete embriões de peixes após a criação no final do dia. Manter os embriões de peixes coletados na incubadora de 28,5 ° C em peixes de água com azul de metileno 0,1%.</li>
	<li>No terceiro dia, verifique os embriões de peixes debaixo de um microscópio fluorescente dissecação com um filtro GFP. Resolver os embriões de peixe verde, se houver algum e criá-los até a idade adulta como F1 geração transgénica peixe, Tg (ubi: ASAP1). Nota: Proporção mendeliana não é esperada uma vez que a maioria dos peixes0 F parentais é quimeras genética germinal.</li>
	<li>Cruze o único F1 peixes adultos com peixes de sua e coletar embriões de peixes. Resolver os embriões de peixe verde e criá-los para a vida adulta como F2 geração de peixe. Nota: Verde e embriões de peixe não-verde devem ser próximo de 1:1 se há um único transgene.</li>
	<li>Para exibir as alterações de potenciais elétricas no tumor como tumores de bainha de nervo periférico maligno (MPNST), atravessar a geração de2 F Tg (ubi: ASAP1) peixe com peixe rpl35hi258/wt . Sabe-se que tumores visíveis começam a ser encontrados em 6-8 meses de idade adultos21,22.</li>
</ol>5. imaging
<ol><li>Que imagem zebrafish embriões tomar múltiplos fundador de geração F2 peixes e cruzá-los com sua peixe pares individuais. Colete embriões de peixe em diferentes estádios de desenvolvimento desejados, de acordo com o zebrafish encenando guia23.</li>
	<li>Para os estágios iniciais dos embriões de peixes, descascar e retirar chorions dos embriões com cuidado, usando um par de pinças em um escopo de dissecação de um diâmetro de 10 cm Petri com sistema de água de peixes.</li>
	<li>Transferi alguns embriões de peixe numa lâmina de vidro concaved com metilcelulose de 3%, utilizando uma pipeta de transferência descartável de 3,4 mL. Ajuste os embriões para as posições desejadas para visualizar a atividade celular de GFP usando uma agulha por baixo de um escopo de dissecação fluorescente.</li>
	<li>Para as fases móveis de embriões de peixes (mais de 12 palco somite), use o mesilato de metanosulfonato de 0,05% para anestesiar os embriões de peixe antes de transferi-los para slides. Brevemente, embriões de peixes foram surgiu em 0.05% tricaina mesilato em água de peixe até que eles pararam de natação e equilíbrio do corpo de perda. Além disso, adicione uma gota de mesilato de tricaina 0,05% com a metilcelulose no slide.</li>
	<li>Para menos de 12 embriões de peixe de estágio somite, use um microscópio composto de epi-fluorescência com uma câmera compatível e software para a imagem latente. Por mais de 12 embriões de peixe somite estágio, use um microscópio de fluorescência dissecação.</li>
	<li>Tensão de célula de tumor de imagem, primeiro, identificar os peixes com tumores MPNST. Em seguida, anestesia o peixe com mesilato de metanosulfonato de 0,05%. Para toda montagem imagem, coloque o peixe em um prato de Petri de 10-cm de diâmetro. Para visualizar a atividade elétrica de células de tumor, tumores de peixe podem ser dissecados para fora após toda montagem imagem.</li>
</ol>

<ol>
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P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation.">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo.">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators.">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora as atividades elétricas nível celular e tecidos durante o desenvolvimento embrionário e doença humana foram descobertas há muito tempo atrás, na vivo elétrica mudanças dinâmicas e seus papéis biológicos ainda permanecem em grande parte desconhecidos. Um dos maiores desafios é Visualizar e quantificar as alterações elétricas. Tecnologia de braçadeira do remendo é um quebra-through para acompanhamento de células únicas, mas sua aplicação aos embriões vertebrados é limitada, porque eles são compostos de muitas células. As tinturas químicas tensão atual também não são ideais devido a suas sensibilidades, especificidades e toxicidades. Os recentes esforços na invenção de GEVIs fornecem-em um novo caminho para visualizar atividades elétrica celular na vivo e em tempo real. Aqui, nós mostramos o processo de criação de uma linha de eléctrico repórter zebrafish, Tg (ubi:ASAP1).
Usando esta linha de peixe de repórter, mostramos celulares atividades elétricas que podem ser monitoradas em embriões de peixe-zebra. A mudança de tensão elétrica está altamente relacionada com o ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário precoce. Temos observado que hiperpolarização acontece antes da formação da divisão de celular/sulco de clivagem (Figura 3). Isto está em contraste com o conhecimento atual a despolarização acontece antes da divisão celular26. Assim, mais detalhes de voltagem da membrana da célula muda durante o ciclo celular de outras células de animais e humanos e se isto está relacionado com o contexto de tecido, requerem mais estudos. Estudos relacionados estão em andamento no nosso laboratório. Além disso, podemos ter verificado que ASAP1 é capaz de controlar alterações de tensão fisiológica do sistema neural-muscular (Figura 4), em que a alteração é relativamente rápida em comparação com as mudanças nos ciclos de célula.
Também foi demonstrado que este repórter também pode ser usado para visualizar tumores zebrafish (Figura 5). Foi interessante descobrir o tumor células geralmente eram mais polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes. No entanto, se se trata de um fenômeno geral para todos os tecidos malignos requer mais investigação, devido à limitação de amostras do tumor e tipos de tumor de peixes neste estudo. Futuras investigações sobre quantificação de polarização e a tensão de membrana celular em outros tipos de tumores e células cancerosas humanas será informativas para melhor compreensão de suas funções durante a tumorigênese.
Neste protocolo, optamos por um promotor onipresente para dirigir a expressão ASAP1 para controlar todas as células em embriões de peixe. Promotores de determinado tecido ou órgão podem ser outra opção se houver apenas um determinado tipo de célula/tecido preferido. O sensor de tensão ASAP1 é um biossensor relativamente bem caracterizado, e é composto por um domínio sensível tensão de Ascídia fosfatase de tensão-sensível (loop de S3-S4) e uma permutação circular de GFP (o padrão é baixa fluorescência). Foi relatado para ser expressas na membrana celular externa em células neurônio humano e rato cérebro fatias4,,27,28. O brilho do sensor é predominantemente determinado pelas posições conformacionais do loop de S3-S4 e GFP. A mudança rápida de fluorescência verde era improvável causada pela concentração de proteína, devido à velocidade das mudanças de brilho e síntese de proteínas. No entanto, o transgene, ASAP1, pode ter alterado a expressão em células tumorais, devido à natureza da instabilidade genômica. Além de ASAP1, outros GEVIs, tais como indicadores de tensão baseado em archaerhodopsin (QuasAr1 e QuasAr2), também podem ser uma boa opção complementar, desde que eles usam um mecanismo completamente diferente, e eles também têm uma alta sensibilidade e velocidade de 29. Além disso, sua emissão é na faixa de cor vermelha. Isso os torna particularmente cortesia para o ASAP1 verde, se já houver outra proteína fluorescente na mesma cela. Por exemplo, ASAP1 e QuasAr podem ser combinado com Fucci zebrafish30 para estudar a relação entre o ciclo celular e as alterações de potenciais elétricas.

Bioeletricidade refere-se a sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular1. Intercâmbio iônico através da membrana celular e as acoplado mudanças atuais e potenciais elétricas, é essencial para a sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis. Além disso, bioeletricidade e gradientes de íons têm uma variedade de outras funções biológicas importantes, incluindo o armazenamento de energia, biossíntese e transporte do metabólito. Sinalização bioelétrica também foi descoberto como um regulador de formação embrionária padrão, tais como machados do corpo, o ciclo celular e de diferenciação celular1. Assim, é fundamental para a compreensão de muitas doenças congênitas humanas que resultam do Regulamento mis deste tipo de sinalização. Embora a braçadeira do remendo tem sido amplamente utilizada para gravação de células únicas, é ainda longe do ideal para o monitoramento simultâneo de várias células durante o desenvolvimento embrionário em vivo. Além disso, pequenas moléculas sensíveis de tensão também não são ideais para aplicações em vivo devido às suas especificidades, sensibilidades e toxicidades.
A criação de uma variedade de geneticamente codificado fluorescente tensão indicadores (GEVIs) oferece um novo mecanismo para superar este problema e permite a fácil aplicação estudar o desenvolvimento embrionário, mesmo que eles foram originalmente destinados para monitoramento neural células de2,3. Dentre os GEVIs atualmente disponíveis é o acelerado Sensor de potenciais de ação 1 (ASAP1)4. É composto por um loop extracelular de um domínio sensor de tensão de tensão sensível fosfatase e uma circular permutada proteína verde fluorescente. Portanto, ASAP1 permite a visualização de alterações de potenciais elétricas celulares (polarização: verde brilhante; despolarização: verde-escuro). ASAP1 tem 2 ms sobre-e-off cinética e pode seguir abaixo do limite potencial mudança4. Assim, esta ferramenta genética permite um novo nível de eficácia no monitoramento em tempo real bioelétrica em células vivas. Mais compreensão dos papéis de bioeletricidade no desenvolvimento embrionário e muitas doenças humanas, tais como câncer, derramará nova luz sobre os mecanismos subjacentes, que é fundamental para a prevenção e tratamento da doença.
Zebrafish provaram um poderoso modelo animal para estudar a biologia do desenvolvimento e doenças humanas, incluindo o câncer5,6. Eles compartilham genes ortólogos de 70% com os humanos, e eles têm biologia vertebrada semelhante7. Zebrafish fornecer cuidados relativamente fácil, um tamanho de embreagem grande de ovos, genética tractable, transgênese fácil e desenvolvimento embrionário externo transparente, que faz com que um sistema superior na vivo de imagem5,6. Com uma grande fonte de linhas de peixes mutantes já presentes e um genoma completamente sequenciado, zebrafish fornecerá uma variedade relativamente ilimitada de descoberta científica.
Para investigar na vivo em tempo real atividade elétrica das células, aproveitamos o sistema modelo de zebrafish e ASAP1. Neste artigo, descrevemos como incorporar o biosensor fluorescente tensão ASAP1 no genoma da zebrafish usando Tol2 transposon transgênese e visualizar a atividade elétrica celular durante o desenvolvimento embrionário, movimento larvas de peixe e no tumor ao vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14mL cell culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-725</td>
			<td>E.Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose electrophoresis tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Owl B2</td>
			<td>DNA eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose RA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N605-500G</td>
			<td>For making the injection gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb1-ASAP1-F primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb2-ASAP1-R primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field dissection scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 745</td>
			<td>Dechorionation, microinjection, mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRc</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48336-001</td>
			<td>For holding fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette 3.4 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Fish embryos and water transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endonuclease enzyme, Not I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189L</td>
			<td>For linearizing plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent compound scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.A2</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent stereo dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Discovery.V12</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light source</td>
			<td>Lumen dynamics</td>
			<td>X-cite seris 120</td>
			<td>Light source for fluorescence microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500342</td>
			<td>Dechorionation and needle breaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Gateway BP recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12538120</td>
			<td>Gateway LR recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td>DNA gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>For loading injection solution into capilary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (1600cPs)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43146</td>
			<td>Fish embryo mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pneumatic Picopump PV820</td>
			<td>Microinjection injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manipulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Microinjector mm33 rechts</td>
			<td>Microinjection operation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>For preparing capillary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J217-500ml</td>
			<td>For calibrating injection volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolor camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Prepare small amount of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>For holding fish or fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td>mRNA cleaning after in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>For measuring DNA and RNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Micrometer</td>
			<td>Am Scope</td>
			<td>MR100</td>
			<td>Microinjection volume calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>DNA amplification for gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Raw glass for making cappilary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exL1 primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exR primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C404006</td>
			<td>Used for transformation during gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing fish or fish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV trans-illuminator 302nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>M-20V</td>
			<td>DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2853</td>
			<td>For transformation process of gene cloning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors

Bioeletricidade, sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular, desempenha papéis importantes na sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis e muitos outros processos biológicos, tais como embrionárias padronização do desenvolvimento. No entanto, há uma necessidade na vivo monitoramento da atividade elétrica em vertebrados embriogênese. Os avanços dos indicadores de voltagem fluorescente geneticamente codificado (GEVIs) tornaram possível fornecer uma solução para este desafio. Aqui, descrevemos como criar um indicador de tensão transgénicos zebrafish usando o indicador de tensão estabelecida, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciais de ação 1), por exemplo. O kit de Tol2 e um promotor de zebrafish onipresente, ubi, foram escolhidos neste estudo. Nós também explicar os processos de clonagem de site-specific Gateway Tol2 baseados em transposon zebrafish transgênese e o processo de imagem para tumores de embriões e peixes peixes fase inicial usando regular epifluorescente microscópios. Usando esta linha de peixe, achamos que há mudanças de tensão elétrica celular durante a embriogênese de zebrafish e movimento de larvas de peixes. Além disso, observou-se que em alguns zebrafish tumores de bainha de nervo periférico maligno, o tumor de células foram geralmente polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes.

Em uma injeção bem sucedida, mais do que embriões de peixe 50% injetado irão exibir algum grau de fluorescência verde nas células somáticas, e a maioria deles será positiva por meio de ensaio Tol2 transposon impostos especiais de consumo (Figura 2). Após 2-4 gerações de para fora-Cruz com sua peixes (até que o peixe fluorescente chegar a 50%, a proporção mendeliana esperada), os peixes transgênicos foram utilizados para o experimento de imagem para controlar potenciais de membrana celular durante o desenvolvimento embrionário. Primeiro, as alterações de potencial de membrana foram examinadas ao longo do ciclo celular durante zebrafish estágios iniciais do desenvolvimento embrionário. Observou-se que as células hyperpolarized antes da formação do sulco de clivagem (Figura 3A-3Ce complementar vídeo 1). Além disso, diferentes tecidos mostraram uma variedade de potenciais de membrana no dia 1-3 embriões de peixe velho. (Figura 3D-3G). Por exemplo, o somitas e notocorda são geralmente hyperpolarized, em comparação com os tecidos/órgãos adjacentes. Uma vez que os embriões de zebrafish foram capazes de mover-se,... também fomos capazes de detectar as atividades elétricas neuromusculares (Figura 4, complementar vídeo 2). Como propriedades bioelétricas de células de câncer poderiam ser alteradas, nós aproveitou este repórter ASAP1 de peixe e ele cruzou com um mutante de gene rpL35 , que é propenso a espontânea de nervo periférico maligno bainha tumores21,24 ,25. Embora apenas alguns tumores de peixes foram examinados, devido ao período de crescimento há muito potencial para o mutante de tumor de peixe, foi perceptível que existiam diferenças de tensão entre tumores e tecidos circunvizinhos no zebrafish ao vivo de tumor-rolamento (Figura 5). Assim, estes resultados representativos demonstraram a geração bem sucedida de uma linha de peixes repórter elétrico celular e sua aplicação potencial para biologia celular e do desenvolvimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57330/57330fig1.jpg"> Figura 1: Ilustração da construção baseada em transposon plasmídeo Tol2. (A) recombinação BP foi usada para ASAP1 sub clonagem em vetor de entrada meio a pDONR221. attB sequências foram adicionadas para o 5-fim dos primers para ASAP1. (B) diagrama para Tol2 baseados em transposon construir montagem baseada na recombinação de LR. Forma oval roxa mostra Tol2 invertido repete. As linhas tracejadas indicam recombination homologous. <a href="/files/ftp_upload/57330/57330fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57330/57330fig2.jpg"> Figura 2: Resultados típicos dos embriões injetados por epifluorescência e ensaio Tol2-impostos especiais de consumo. Embrião de peixe 1dpf Non-positivo (A) . (B) injetado com sucesso embriões de peixe 1dpf. Manchas GFP são evidentes no porta-malas. Embrião de peixe 2dpf Non-positivo (C) . (D) injetado com sucesso embriões de peixe 2dpf. Manchas GFP são evidentes no porta-malas. (E) um resultado representativo do Tol2 ensaio de impostos especiais de consumo. Pista 1-7 PCR foram ampliados de 7 aleatoriamente selecionado embriões de peixe 8 horas depois da injecção. O último é um controle negativo (NC), sem qualquer DNA genômico. Barra de escala = 250 μm. <a href="/files/ftp_upload/57330/57330fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57330/57330fig3.jpg"> Figura 3: Tensão dinâmica muda durante o desenvolvimento do embrião do zebrafish. (A-C) Polaridade da tensão diferencial de celular durante a mitose em embriões de peixe. (A) embrião de zebrafish fase 2-célula. (B) embrião de estágio de 4 células. Embrião de 8 células estágio (C) . As cabeças de seta vermelha indicam as posições dos sulcos a clivagem nos painéis (A-C). As mudanças também são evidentes no filme correspondente (complementar vídeo 1). A região em torno da constrição é mais polarizada comparado com o resto da célula. (D-G) Alterações de dinâmica de tensão elétrica em diferentes estágios iniciais dos embriões de peixe-zebra. Estágio de 12-somite (D) . Estágio de 22-somite (E) . (F) 48 horas pós fertilização. (G) 72 horas pós fertilização. e, olhos; ht, coração; NT, notocorda; op, vesícula óptica; ov, vesícula ótica; pf, barbatana peitoral; então, somite; yk, gema. Barra de escala = 250 μm. <a href="/files/ftp_upload/57330/57330fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57330/57330fig4.jpg"> Figura 4: Alterações de tensão elétrica do corpo durante o movimento de embrião de peixe peixe. 2 - dia velho peixe embriões mostrar o neuro-muscular elétrico atividades durante o movimento. (A) - (F) imagem sequencial do embrião mesmo peixe. Alterações de densidade de cor correspondentes para a transdução de sinalização elétrica. O intervalo de tempo entre duas imagens consecutivas é aproximadamente 12,4 milissegundos. As setas vermelhas indicam as posições que tensão alterado durante o período de imagem. As mudanças também são evidentes no filme correspondente (complementar vídeo 2). Todos os painéis estão na mesma escala. Barra de escala = 250 μm. <a href="/files/ftp_upload/57330/57330fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57330/57330fig5.jpg"> Figura 5: Células tumorais tendem a ser mais polarizada. Um peixe de 10 meses de idade (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) desenvolveu um tumor de bainha de nervo periférico maligna no abdômen. (A) & Bright (C) imagem de campo. (B) e (D) imagem com canal de GFP. (A) e (B) peixe intacta. (C) & abdômen (D) tumor foi dissecada para fora. Células tumorais são mais polarizada (mais brilhante verde) comparado ao redor de tecidos (verde escuro). Cabeças de seta mostram os tumores. Todos os painéis estão na mesma escala. Barra de escala = 25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57330/57330fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo complementar 1 . Imagem de epifluorescente de sinalização eléctrica durante estágios de clivagem em Tg (ubi: ASAP1) embrião de peixe. Este filme foi gravado do vista do polo animal. A fluorescência de ASAP1 está associada com a formação de um sulco de clivagem de célula, uma estrutura temporária durante a divisão celular. <a href="/files/ftp_upload/57330/Supplementary_Video_1.wmv">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo complementar 2 . Epifluorescente imagem de sinalização eléctrica durante 2 - velho dia Tg (ubi: ASAP1) movimento de embrião de peixe. O movimento foi gravado do vista lateral do embrião peixe 2 - velho dia após anesthetization. O ASAP1 alterações de fluorescência são evidentes no tecido neuromuscular durante o processo de mudança. <a href="/files/ftp_upload/57330/Supplementary_Video_2.wmv">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K visualizações.  Purdue University. Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Vídeo: Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...