Este trabalho foi apoiado pelo apoio do Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e a bolsa DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cambridge. 1. Manutenção de animais <ol><li> Embriões de sapo NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito. <ol><li> Preparar solução de solução Barth&#39;s Solution (MBS) de 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 uM, NaHCO3 24 uM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 , 3,3 μM e CaCl2 a 4,1 uM, pH 7,6 . </li><li> Obter embriões Xenopus laevis por adubação in vitro . <ol><li> Induzir a ovulação em sapos africanos de raparigas africanas ( Xenopus laevis) por injeção com gonadotrofina sérica da maria grávida uma semana (60 UI) e 12 h (500 UI) antes da postura do ovo. </li><li> Recolher oócitos e fertilizá-los in vitro com testículo masculino homogeneizado. </li><li> RaiEmbriões em 0.1x MBS a 16 - 18 ° C. Etapa os embriões de acordo com a tabela Normal de Xenopus laevis 14 . Tome cuidado para selecionar embriões inteiros e vivos para a experiência. </li></ol></li></ol></li><li> Embriões de peixe-zebra NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito. <ol><li> Preparar meio de embrião: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33 mM, MgSO4 0,33 mM e azul de metileno 0,00001%. </li><li> Manter e produzir WT AB cepa Danio rerio a 26,5 ° C. </li><li> Recolher os embriões na manhã da adubação, aumentar até 4 dias após a adubação (dpf) a 28 ° C em meio de embrião preparado como descrito acima, selecionar e andar como descrito anteriormente 15 . </li></ol></li></ol> 2. Indução da hipoxia in vivo </P&gt; <ol><li> Construção da câmara de incubação de gás <ol><li> Use um tanque aquático de reprodução ( Figura 1A ) que é normalmente usado na instalação de peixes para construção de câmara hipóxico. Este tanque deve caber uma placa de 24 poços. </li><li> Prepare uma placa de 24 poços com fundo de malha, conforme descrito na Figura 1 . Remova o fundo de plástico da placa de 24 poços ( Figura 1B ), por exemplo , usando uma fresadora para este fim. </li><li> Preencha o espaço entre o plástico dos poços e as paredes da placa com resina epoxi. Anexe qualquer filtro de nylon ( Figura 1C ) com um diâmetro de malha de 0,1-0,2 mm ao plástico revestido com resina e deixe a placa ser completamente seca. </li><li> Uma vez seco, perfure três ou quatro túneis ( Figura 1D ) de 10 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro nas paredes de placas revestidas com resina e malha. Anexar barras de plástico ou teflon( Figura 1E ) de diâmetro apropriado e 30 mm de comprimento para os túneis e coloque a placa no tanque de escolha. </li><li> Coloque a placa de 24 poços de malha no tanque aquático de escolha. Usando a tubulação de silicone ( Figura 1F ), prenda um tanque de gás ( Figura 1G ) com a mistura O 2 / N 2 desejada ou outra mistura de gás de escolha para uma válvula distribuidora ( Figura 1H ) usando um regulador de gás apropriado (IOC) (BOC 200 Barra). Aqui, use tanques de gás contendo uma mistura de 5% de oxigênio e 95% de N 2 nas experiências de hipóxia apresentadas aqui. </li><li> Ajuste o caudal de oxigênio no meio da câmara para 0,0017-0,0019 metros cúbicos por segundo. Sob esta taxa de fluxo de gás, nenhum perigo do meio deve ser visto nos poços da placa. <ol><li> Utilize o regulador de gás de duas fases de alta pureza para este fim. Defina o regulador para reduzir a pressão interna doE tanque de gás (1000 - 2500 PSI) a uma pressão de entrega de 10 PSI durante todo o experimento. Assim, de acordo com as especificações deste regulador de gás, um fluxo de 0,00189 metros cúbicos por segundo foi alcançado durante todo o experimento. </li></ol></li><li> Conecte a tubulação de silicone e a válvula de distribuição a um difusor de disco cerâmico ( Figura 1J ) dentro do tanque aquático. Feche o tanque aquático e selar com cuidado a tampa, revesti-lo com graxa de silicone ( Figura 1K ) (compare com a Figura 1 ). Se for necessária uma temperatura não-ambiente específica, coloque a câmara hipóxica em uma incubadora de laboratório da temperatura desejada. </li><li> Dependendo do tipo de embriões utilizados no experimento, encha o tanque de câmara hipóxico com o meio de embrião apropriado e comece a difundir a mistura de gás através do difusor de disco cerâmico. Equilibre-se por 10-15 min. </li><li> Após o equilíbrio com oE desejada mistura de oxigênio, medir a concentração de oxigênio na água usando um oximetro ou sonda de oxigênio. Aqui, use um oxímetro com o sensor de temperatura e oxigênio dissolvido em fibra óptica para este fim. </li></ol></li><li> Indução de hipoxia em embriões <ol><li> Selecione cuidadosamente os embriões para o experimento, use embriões inteiros e vivos para a incubação de hipoxia. Aqui, nós embriões de sapo do estágio 38 ou embriões de peixe zebra 4 dpf nos experimentos aqui apresentados. </li><li> Coloque os pratos de embrião na incubadora ( Figura 1K ) contendo a câmara de incubação de gás e deixe-os equilibrar à temperatura da incubadora. </li><li> Transmita cuidadosamente os embriões nos poços da placa de 24 poços mesclado ( Figura 1B ) da câmara de incubação de gás, usando uma pipeta de plástico. Use sempre uma pipeta de plástico para transferência de embriões ao longo do protocolo. NOTA: Cada poço desta placa pode conterPara 5 embriões de sapo do estágio 38 ou até 7 embriões de peixe cebre de 4 dpf. Rotule os poços com cuidado se estiver usando diferentes genótipos. </li><li> Manter a câmara de incubação de gás sob uma infusão constante com a mistura gasosa de escolha por 5 h ou por um período mais longo que se adapte à experiência. Use uma mistura de 5% de O2 e 95% de N2 aqui. </li><li> Transfira cuidadosamente os embriões da câmara de incubação de gás de volta ao meio normoxico correspondente ao tipo de embrião e continue imediatamente com os Passos 3 ou 4. </li><li> Se for necessário um tratamento normoxico adicional, transfira cuidadosamente os embriões para o meio normoxídico correspondente ao tipo de embrião. </li></ol></li></ol> 3. Controle da Indução de hipoxia bem sucedida monitorando os níveis de HIF-1α <ol><li> Preparativos <ol><li> Prepare 0,4 mg / ml de solução de MS222 em 0,1 x MBS. </li><li> Prepare o tampão de homogeneização: Compre o buffer de ensaio Radioimmunoprecipitation (RIPA bUffer) para a homogeneização do tecido e suplementar a quantidade de tampão necessária para a sua experiência com Inibidor de Protease para uma concentração final de 1: 100 v / v. </li><li> Prepare soluções para Western blot. <ol><li> Preparar tampão de carga de gel Laemmli 4x: Tris 425 mM pH 8,0, 40% v / v Glicerol, SDS a 8% v / v, 4% v / v de beta-mercaptoetanol, 0,5% p / v Bromofenol Azul, volume total de 10 mL ddH 2 O. </li><li> Preparar 5x tampão de corrida: 15 g de base de Trizma, 72 g de glicina, 5 g de SDS, volume total de 1 L ddH 2 O. </li><li> Preparar buffer de transferência: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glicina, 200 mL de metanol a 100%, volume total de 1 L ddH 2 O. </li><li> Preparar 10% TBST: 5 ml de Tris 1 M pH 8,0, 30 mL de NaCl 5 M, 2,5 mL de Tween 20, 1 volume total de H 2 O. </li><li> Prepare a solução de bloqueio: 4% p / v de leite em pó desnatado em 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Coleção de tecido <ol><li> Anestesiar os embriões tomando banho na solução MS222 a 0,4 mg / mL16 , 17 e transferi-los para um tubo de reação de plástico preenchido com tampão de homogeneização usando uma pipeta de plástico. Use 20 μL de tampão por embrião. Note-se que pelo menos 5 embriões de rã de estágio 38 ou 7 embriões de peixe-zebra de 4 dpf são necessários para determinar uma alteração significativa nos níveis de proteína HIF1α. </li><li> Homogeneizar o tecido usando um homogeneizador de tecido apropriado ou um sonicador. Remova os restos por centrifugação (15 min; 13,000 xg; 4 ° C). <ol><li> Alternativamente, dissecar as retinas dos embriões de sapo anestesiados 17 e homogeneizar como acima. Use 20 μL de tampão de homogeneização por 10 retinas. </li></ol></li><li> Pegue o sobrenadante utilizando uma pipeta, desnaturar a 85 ° C durante 5 minutos e suplementar com tampão de carga de gel de Laemmli até uma concentração final de 1x v / v ( por exemplo , adicionar 5 μL de tampão 4x Laemmli a 15 μL de homogeneizado). Use este sobrenadante para o WesTern blot ou congelar as amostras a -20 ° C. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Carregue as amostras preparadas como descrito no Passo 3.2 em um gel pré-moldado de 12% em um sistema de eletroforese usando 1x v / v Tampão de corrida. Use uma escada de proteína para determinação do tamanho da proteína. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose (membrana de 0,45 μm) em tampão de transferência durante 1 h embalado em gelo a 4 ° C, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Bloqueie locais de ligação inespecíficos incubando a membrana em tampão de bloqueio durante 60 min. Siga com 3 x 10 min lavagens em 1x TBST. </li><li> Incubar a membrana em soluções de anticorpo anti-HIF-1a de coelho e anti-α-tubulina de rato diluídas 1: 100 v / v e 1: 5000 v / v, respectivamente, em solução de bloqueio, durante 2,5 h à TA. Siga com 3 x 10 min lavagens em 1x TBST. </li><li> Para detecção, incubar em anticorpos de cabra anti-coelho e conjugado anti-camundongo de cabra diluídos 1: 1000 v / v em solução de bloqueio durante 1 h.Siga com 3 x 10 minutos de lavagem em 1x TBST e visualize a coloração HRP usando um kit comercial e uma máquina de revelação de escolha. </li><li> Quantifique a quantidade de proteína HIF1α usando a quantificação digital. </li></ol></li></ol> 4. Monitoramento da proliferação celular na hipóxia <ol><li> Preparativos <ol><li> Prepare solução de EdU 5 mM no meio embrionário de escolha. A solução pode ser usada imediatamente ou dividida em alíquotas e armazenada a -20 ° C por até 6 meses. </li><li> Preparar salina tamponada com fosfato (PBS) ou comprar PBS a partir de recursos comerciais. Autoclave durante 10 minutos a 115 ° C. </li><li> Prepare soluções para a detecção de incorporação de EdU. <ol><li> Preparar solução de fixação: 4% v / v de solução de reserva de formaldeído a 16% em PBS. </li><li> Preparar solução de sacarose: 30% p / v de sacarose em PBS. </li><li> Preparar PBST: 0,1% v / v Triton X-100 em PBS. </li><li> Preparar solução de bloqueio: 10% v / v Soro de cabra inactivado pelo calor (HIGS) no PBST. </li><li> Preparar a solução DAPI: 1: 1000 v / v 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Incubação de embriões em hipoxia para incorporação de EdU <ol><li> Preencha a câmara de incubação de gás com 400-500 mL de solução de EdU 5 mM suplementada com DMSO a 1% v / v. Pré-equilibre a solução com a mesma mistura de gás utilizada no experimento durante 15 minutos antes da experiência. Note-se que o volume da solução de incubação pode ser minimizado através da fixação de varas mais curtas ( Figura 1E ) à placa inferior de malha. </li><li> Conecte o tubo de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de O2 e 95% de N2. Incube a solução por 15 min. </li><li> Transfira os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços e incubar durante 2 h. Cada poço pode acomodar até 5 embriões de sapo do estágio 38 ou até 7 embriões de peixe cebre 4 dpf. </li><li> Analisar o embriãoS para incorporação de EdU. </li></ol></li><li> Curso temporal de incubação embrionária em hipoxia e incorporação de EdU <ol><li> Preencha a câmara de incubação com 500 ml de meio embrionário de escolha. Conecte o tubo de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de O2 e 95% de N 2 e equilibre o meio com a mistura de gás durante 15 min. </li><li> Transfira os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços e incubar durante o período de tempo desejado até 48 h. Durante as últimas 1 h, substitua o meio embrionário com solução EdU 5 mM suplementada com DMSO a 1% v / v. </li><li> Transfira os embriões de volta para o prato normoxic e analise a incorporação de EdU. </li></ol></li><li> Detecção e análise de incorporação de EdU <ol><li> Anestesiar os embriões tomando banho em solução de MS222 a 0,4 mg / mL. </li><li> Transfira os embriões para um frasco de vidro apropriado e conserte incubando na solução de Fixação por 2 haT RT ou O / N a 4 ° C. Siga com 3 x 10 min lavagens em PBS. Transferir cuidadosamente os embriões para a solução de sacarose para a crioproteção tecidual. Incubar durante 4 h ou até que os embriões afundem no fundo do frasco de vidro. </li><li> Incorporar os embriões em meio de incorporação (composto de temperatura de corte ideal). Blocos de criosecção com embriões imediatamente ou armazenar até 14 d a -80 ° C. </li><li> Cryosecção os blocos contendo embriões usando um criostato. Coletar secções de 12 μm (embriões de peixe zebra) ou 16 μm (embriões de sapo) em lâminas de microscópio e deixar secar. Processe criosecções imediatamente ou armazene a -20 ° C por até 3 meses. </li><li> Detectar incorporação de EdU por coloração imunofluorescente usando um kit de química comercial. Prepare a quantidade de EdU Reaction Mix necessária para o número de criosecções no experimento, conforme descrito pelo fabricante. <ol><li> Para 500 μL de EdU Reaction Mix, use 430 μL de 1X EdU reaction buffer, 20 μL de CuSO 4 , 1,2 μL de azida de Alexa Fluor, 50 μL de aditivo de tampão EdU 1X. </li></ol></li><li> Lave as criosecções uma vez com PBS para remover o meio de incorporação e 3 x 5 min com PBST para permeabilizar o tecido. Incubar as criosecções na solução de bloqueio por 30 min. </li><li> Incubar as criosecções com o EdU Reaction Mix por 1 h e seguidas de 3 x 10 min lavagens em PBST. Costeie as criosecções com solução de DAPI durante 15 min, seguido de lavagens de 3 x 10 minutos em PBST. Monte as lâminas com criosecções coloridas em meio de montagem, cubra com lamínulas e deixe secar antes de analisar sob um microscópio fluorescente ou armazenando a 4 ° C por até 1 ano. </li><li> Analise as criosecções com coloração anti-EdU sob um microscópio de varredura confocal invertido e determine o número de células positivas para EdU usando a quantificação digital. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui apresentamos um novo método fácil, mas robusto, para induzir hipoxia que é ajustada para uso com embriões de sapo e zebra, mas também pode ser adequada para outros organismos aquáticos. A principal vantagem deste método reside na sua simplicidade e eficiência de custos. No entanto, os resultados obtidos com este método são muito robustos. Mostramos que a hipoxia pode ser induzida eficientemente na câmara tanto em embriões inteiros quanto em tecido específico - aqui, retinas. Para determinar a eficácia da indução de hipoxia, monitorizamos os níveis de proteína HIF-1α em lisados ​​inteiros de embriões e retina. De acordo com nossos resultados, a indução de hipoxia pode ser vista como bem sucedida, se um aumento dos níveis de HIF-1a pode ser observado após 1 h na câmara hipóxica comparado ao controle normoxico e normalizado aos níveis globais de proteína, por exemplo , usando níveis de α-tubulina Como controle. Confirmamos a atividade de hipoxia no tecido através do monitoramento da proliferação de células-troncoEm retinas pela incorporação de EdU, e poderia mostrar, de acordo com nossos resultados publicados anteriormente 13 , que a hipoxia induzida usando a configuração aqui apresentada leva a uma diminuição da proliferação de células estaminais da retina em embriões de sapo e zebrafish. Uma das etapas críticas deste protocolo é garantir que a câmara hipóxica seja devidamente selada. É realizado usando uma vedação apropriada na tampa do tanque, que era a graxa de silicone no nosso caso. Além disso, a colocação dentro de uma incubadora ajudará a evitar vazamentos de oxigênio atmosférico na câmara, fornecendo uma barreira adicional. Uma medida da concentração de oxigênio com uma sonda ou eletrodo adequado garante também que os níveis de oxigênio hipóxicos sejam mantidos estáveis ​​e sem flutuações. Além disso, deve-se ter cuidado para evitar a abertura da câmara por longos períodos enquanto troca soluções ou amostras entre experimentos. Dado rápido equilTempos de calibração de 10 a 15 min para o estabelecimento da hipoxia, apenas uma pequena quantidade da mistura de gás e um baixo fluxo de gás são necessários para sustentar o sistema mesmo por períodos de tempo mais longos do que os descritos nos resultados representativos (24 h). As soluções utilizadas no experimento devem ser pré-equilibradas para atingir hipoxia durante 15 minutos antes da incubação na câmara (conforme descrito em 4.2.1). Utilizamos a câmara hipóxica durante o período de 48 h de hipóxia constante sem erros, conforme observado em nossas medidas de concentração de oxigênio ( Tabela 1 ). Deve notar-se que a correta difusão de gás deve ser controlada durante tempos de incubação mais longos. Finalmente, deve-se tomar cuidado ao colocar os embriões nos poços (Etapa 2.2.1.) Para evitar a mistura de embriões de diferentes animais mutantes / condições experimentais. Isso é bastante simples de alcançar, dado os muros relativamente altos dos poços individuais da placa. Apesar de ser simples, mas eficazE sistema robusto para indução de hipóxia, o uso da câmara aqui descrita tem uma desvantagem para experimentos que exigem o uso de soluções e meios de incubação caros. O volume mínimo de mídia no tanque da câmara não deve cair abaixo de 400 mL. No entanto, os ajustes podem ser feitos para atender volumes menores: Conseguimos ajustar o comprimento das hastes ( Figura 1E ) anexado à placa (2.1.4 e 4.2.1) para que possamos exigir apenas 50 mL de mídia / solução . Embora não seja ideal para tempos de incubação mais longos, esta configuração pode caber na mesma tubulação de gás e pode ser adequadamente selada para garantir hipoxia suficiente até 8 h. Em conjunto, a nossa configuração da câmara de gás pode ser empregada para uso com qualquer organismo modelo aquático e é separada de outros sistemas similares comercialmente disponíveis por sua simplicidade, rentabilidade e robustez. Uma vez dominado, pode ser usado para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob qualquer desejoD atmosfera de gás, incluindo hipoxia, hiperoxia ou outras misturas de gases.

A pesquisa de hipoxia tem inúmeras aplicações. Estes incluem a investigação da patogênese e o desenvolvimento de tratamentos para condições médicas caracterizadas por hipoxia 1 e doença aguda de alta altitude 2 . O estresse hipóxico causa grandes alterações metabólicas em todos os organismos que necessitam de oxigênio. O estresse hipóxico também influencia o crescimento e desenvolvimento fetal e a patogênese de várias doenças humanas, incluindo a restrição do crescimento intra-uterino 3 . O estresse hipoxico não só pode levar a um menor peso ao nascer, mortalidade fetal e neonatal, mas também pode resultar em muitas complicações na vida adulta, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, obesidade e hipertensão 4 . O estresse hipóxico também é freqüentemente observado durante o desenvolvimento de tumor sólido, quando o tecido tumoral ultrapassa o suprimento de sangue. Por conseguinte, é crucial poder estudar os efeitos da hipóxia in vivo e directamente durante o embrião<html> Desenvolvimento yônico. Entre os métodos mais bem conhecidos que foram empregados para estudar os efeitos da hipoxia durante o desenvolvimento é o uso de cloreto de cobalto no meio de crescimento ou a incubação do organismo em uma câmara hipóxica. O cloreto de cobalto induz artificialmente uma resposta hipóxica sob a concentração normal de oxigênio, devido ao seu papel na estabilização do alfa de factor 1 induzível pela hipoxia (HIF-1a), prevenindo sua degradação proteossômica 5 , 6 , 7 . No entanto, sendo um método conveniente 8 , o uso de cloreto de cobalto, bem como outros miméticos de hipóxia química semelhantes, podem ter efeito deletério inespecífico sobre células e tecidos, por exemplo , apoptose 9 . Portanto, as câmaras hipóxicas são um método melhor para a indução de &quot;hipoxia natural&quot; em organismos vivos ao longo do desenvolvimento normal. Nós nos concentramos no desenvolvimento de um sistema de indução de hipoxia em embriões de animais aquáticos, tanto os sapos quanto o peixe-zebra tornaram-se organismos modelo informativos de vertebrados para estudos de numerosos processos biológicos, bem como modelos para várias doenças humanas. Embriões de sapo e zebra Desenvolver externamente, eliminando a complicação da compensação materna. Além disso, um rápido processo de desenvolvimento permite manipular fatores ambientais e observar as mudanças fenotípicas na formação de órgãos em tempo real. Além disso, muitos componentes das principais direções de transdução de sinal são altamente conservados em Esses organismos modelo e foram caracterizados em detalhes por uma grande quantidade de literatura. A principal vantagem no uso de sapos e embriões de peixe-zebra para estudar os efeitos da hipóxia no desenvolvimento de vertebrados é que todos os processos podem ser monitorados diretamente, já que o oxigênio penetra rapidamente nos embriões. Assim, em sapos e peixe-zebra, como em contraste com outros organismos modelo, comoEmbriões de camundongo, a influência de uma concentração específica de oxigênio pode ser estudada no tecido de interesse, sem levar em consideração a presença ou falta de vasculatura funcional. A maioria das configurações comercialmente disponíveis para incubação hipóxica tem a desvantagem de ser comparativamente grande e ter custos de funcionamento correspondentemente elevados. Além de seu alto custo inicial e consumo de gás, equilíbrio e manutenção de câmaras de hipoxia comuns requer manutenção de atmosfera hipoxica constante contra o gradiente de gás que ocorre naturalmente nestas câmaras devido ao seu maior tamanho e / ou respiração do organismo. Isso requer emprego de ventiladores de gás e um sistema de resfriamento, o que aumenta a quantidade de equipamentos necessários adicionais, impede a destreza do pesquisador e diminui a simplicidade do procedimento experimental. Em contraste, a configuração que apresentamos aqui é comparativamente robusta, mas muito econômica, pequena, fácil de estabelecer e permite que fEquilíbrio de gás, atmosfera hipóxica estável e troca simples de materiais e soluções dentro da câmara. Nosso sistema pode ser empregado para uso com qualquer organismo modelo aquático de interesse. Nós construímos uma câmara hipóxica que é convenientemente pequena e, portanto, pode ser colocada dentro de uma incubadora comum de laboratório, que permite facilmente procedimentos experimentais a qualquer temperatura específica. Fornecer um controle conveniente da temperatura, bem como a concentração de oxigênio no meio, a vantagem do nosso sistema contra as incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis reside no seu pequeno tamanho e eficiência de custos. Assim, nossa configuração pode ser estabelecida usando suprimentos laboratoriais gerais disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa e não exige materiais caros. Além disso, nossa configuração não gera calor, ao contrário das incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis, e permite o uso a temperaturas inferiores à temperatura ambiente colocadas em uma incubadora. A laSt é especialmente crítico para o trabalho com organismos de sangue frio, como sapos e peixes, onde as taxas de desenvolvimento e metabólicas são fortemente dependentes da temperatura. Sendo muito rentável e facilmente construído, a nossa câmara de incubação de gás é, no entanto, muito versátil no estabelecimento de várias condições hipóxicas ou hiperóxicas, além de permitir uma administração rápida e fácil de diferentes meios e soluções para uma grande quantidade de condições experimentais. Além disso, empregando uma placa de 24 poços em vez de pratos comumente usados ​​ou tanques de laboratório 10 , 11 , 12 , nosso sistema permite a observação e tratamento experimental de várias condições mutantes ao mesmo tempo. Para controlar a indução correta de hipoxia, monitoramos os níveis da proteína HIF-1a por detecção de Western Blot. Além disso, o número de células que proliferam antes e depois da incubaçãoN na câmara hipóxica pode ser usado para determinar se a hipóxia foi induzida no tecido. Este método baseia-se nos resultados publicados anteriormente 13 , mostrando que a proliferação no nicho das células-tronco da retina embrionária diminui após a indução da hipoxia. Assim, monitorizamos o nível de proliferação de células estaminais da retina por adição de 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU) ao meio embrionário e medindo sua incorporação no DNA de células que proliferam recentemente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;">NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:167px;">KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td style="width:167px;">NaHCO3 / 0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;">0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td style="width:167px;">MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Calcium nitrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">202967</td>
			<td style="width:167px;">Ca (NO3)2 / 0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:167px;">CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9140</td>
			<td style="width:167px;">Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Pregnant mare serum gonadotropin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10</td>
			<td style="width:167px;">frog fertilization</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Zebrafish breeding tank</td>
			<td style="width:71px;">Carolina</td>
			<td style="width:119px;">161937</td>
			<td style="width:167px;">gas chamber construction</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">142475</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epoxy resin</td>
			<td style="width:71px;">RS Components UK</td>
			<td style="width:119px;">Kit 199-1468</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gas distributor valve</td>
			<td style="width:71px;">WPI Luer Valves</td>
			<td style="width:119px;">Kit 14011</td>
			<td style="width:167px;">aquatic tank attachment (Schema 1, H)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">High precision gas valve</td>
			<td style="width:71px;">BOC&#160;</td>
			<td style="width:119px;">200 bar HiQ C106X/2B</td>
			<td style="width:167px;">gas tank attachment (Schema 1, I)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">5% oxygen and 95% N2 gas tank</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;">226686-L</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic gas mixture</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">ceramic disc diffuser</td>
			<td style="width:71px;">CO2 Art&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td>
			<td style="width:167px;">Schema 1, J</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">silicone grease</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">VAC1100</td>
			<td style="width:167px;">Schema 1, K</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">oxymeter</td>
			<td style="width:71px;">Oxford Optronix&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Oxylite, CP/022/001</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic chamber setup</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">fibre-optic dissolved oxygen sensor</td>
			<td style="width:71px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:119px;">HL_BF/OT/E</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic chamber setup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">plastic pasteur pipette</td>
			<td style="width:71px;">Sterilin</td>
			<td>STS3855604D</td>
			<td style="width:167px;">for embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MS222&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:167px;">embryo anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RIPA buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278-50ML</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Protease inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer, 10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;">SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">beta-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td style="width:167px;">5X Running buffer, Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:167px;">5X Running buffer, Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860</td>
			<td style="width:167px;">Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2287-500ML</td>
			<td style="width:167px;">10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">skim milk powder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td style="width:167px;">Blocking Solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T9661</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">tissue homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">Pellet Pestle Motor Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">pellet pestles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">precast 12% gel</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Biorad</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Mini-ProteinTGX, 456-1043</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">protein ladder</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Amersham</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">nitrocellulose membrane (0.45 &#181;m)</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">anti-HIF-1&#945; antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab2185</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6074</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6789</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97080</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Pierce ECL 2 reagent&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">ECL films Hyperfilm</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Amersham</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine &#160;</td>
			<td style="width:71px;">santa cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS&#160;61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;">EdU, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">BR0014G</td>
			<td style="width:167px;">1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:167px;">Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">S/8600/60</td>
			<td style="width:167px;">Solution solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284-500ML</td>
			<td style="width:167px;">PBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Heat-inactivated Goat Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6767-100ml</td>
			<td style="width:167px;">HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;">DAPI, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C10338</td>
			<td style="width:167px;">DMSO, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass vial</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">98178853</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4563</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium, EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">cryostat Jung Fridgocut 2800E</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3035S</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">J1800AMNZ</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">EdU Click-iT chemistry kit</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C10338</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FluorSave</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">D00170200</td>
			<td style="width:167px;">mounting medium, EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">coverslips</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">fluorescent microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse 80i</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">confocal scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Volocity software</td>
			<td style="width:71px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">Volocity 6.3</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Aqui, apresentamos um novo sistema de indução de hipoxia, que desenvolvemos para estudar os efeitos da hipóxia em organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema compreende uma câmara com uma configuração simples que, no entanto, é robusta para induzir e manter uma concentração específica de oxigênio e temperatura em qualquer solução experimental de escolha. O sistema apresentado é muito econômico, mas altamente funcional, permite a indução e sustentação da hipoxia para experiências diretas in vivo e por vários períodos de tempo até 48 h. Para monitorar e estudar os efeitos da hipóxia, empregamos dois métodos - aferição de níveis de fator 1alpha (HIF-1α) induzível por hipoxia em embriões inteiros ou tecidos específicos e determinação da proliferação de células estaminais da retina por 5-etinil-2&#39;- Incorporação de desoxiuridina (EdU) no DNA. Os níveis de HIF-1α podem servir como marcador de hipoxia geral em todo o embrião ou tecidoDe escolha, aqui retina embrionária. A incorporação de EdU nas células de proliferação da retina embrionária é uma produção específica de indução de hipoxia. Assim, mostramos que os progenitores de retina embrionária hipóxica diminuem a proliferação dentro de 1 h de incubação sob 5% de oxigênio de embriões de sapo e zebrafish. Uma vez dominado, nossa configuração pode ser empregada para uso com pequenos organismos modelo aquáticos, para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob concentração de oxigênio normal, hipóxica ou hiperóxica ou sob qualquer outra mistura de gás.

Empregar o sistema de câmara hipoxica que apresentamos aqui permite o estudo dos efeitos da hipoxia individual e in vivo em animais vivos inteiros. A hipoxia pode ser induzida colocando embriões inteiros de sapo ou zebra na câmara hipóxica ( Figura 1 ), e deve ser realizada em diferentes combinações de condições. Uma imagem da nossa configuração completa da câmara de gás é mostrada na Figura 2 . Nós monitoramos a concentração de oxigênio no meio de incubação usando um sensor de oxigênio de fibra óptica (2.1.9) em diferentes pontos de tempo durante a experiência. Esses dados indicam que induzimos hipoxia estável (6-6,5% de oxigênio dissolvido) ao longo de nossas experiências ( Tabela 1 ). Em primeiro lugar, avaliamos níveis ubíquos e retinianos de HIF-1α na normoxia e na hipoxia induzida em nossa câmara hipóxica. HIF-1αÉ uma proteína estabilizada sob baixas concentrações de oxigênio. Medimos os níveis de HIF-1α em lisados ​​de embriões de sapo inteiro mantidos sob concentração normal de oxigênio ou submetidos a hipoxia a 5% e em lisados ​​de suas retinas isoladas. Conforme mostrado na Figura 3 , HIF-1α é estabilizado sob hipoxia em embriões inteiros e em retinas. A estabilização de HIF-1α é conseguida em diferentes poços da placa de incubação de fundo de malha ( Figura S1 ). Como já mostramos anteriormente, a hipoxia afeta a proliferação de progenitores de células estaminais da retina na Zona Marginal Ciliar (CMZ) da retina 13 . Assim, monitorar a proliferação na CMZ por meio da incorporação de EdU é um bom marcador para a indução bem sucedida de hipoxia. Incubamos embriões em uma câmara hipóxica mantida a 5% de oxigênio e avaliamos a proliferação da retina conforme descrito na Etapa 4.2. Como esperadoAs retinas normoxicas de controle apresentaram coloração EdU intensa na CMZ, onde os progenitores proliferantes residem tanto em sapos ( figuras 4B quanto 4D ) e em embriões de peixe-zebra ( Figuras 5A e 5C ). Após a privação de oxigênio na câmara hipóxica, observou-se uma forte diminuição da proliferação de progenitores CMZ em ambos os embriões de sapo ( Figuras 4C-4D ) e zebrafish (Figuras 5B, 5C). Para determinar a extensão do efeito, realizamos um curso de tempo, incubando os embriões na câmara hipóxica por períodos mais longos de até 24 h, monitorando a proliferação por incorporação de EdU conforme descrito na Etapa 4.3. Poderíamos mostrar que a diminuição da proliferação da progenitores da retina era aguda e maior dentro de 2 h, e persistiu por muitas horas ( Figura 4D ), enquanto que os embriões desenvolveram-se normalmente de acordo com a fase de desenvolvimento. Este resultado sugere que nosso sistema pode induzir de forma eficiente hipoxia em um alvoInteresse, durante tempos curtos de incubação, além de sustentar essas condições por períodos mais longos, ao mesmo tempo em que apoiam o desenvolvimento normal do embrião. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55710/55710fig1.jpg" /> Figura 1: Representação esquemática da configuração experimental da câmara de gás. ( A ) tanque aquático de criação (22 (comprimento) x 10,5 (largura) x 10,5 cm (altura)) ( B ) placa de 24 poços com fundo de malha (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm de diâmetro de poço) ( C ) nylon Filtro com um diâmetro de malha de 0,1-0,2 mm ( D ) túneis de 10 (comprimento) x 5 mm (diâmetro) ( E ) Teflon ou varetas de PVC de diâmetro apropriado e 30 mm de comprimento ( F ) tubo de silicone ( G ) tanque de gás com A válvula desejada de oxigênio / CO 2 ( H ) válvula distribuidora ( I ) válvula de gás ( J ) cerTampa do compartimento do difusor de disco amic ( K ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55710/55710fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55710/55710fig2.jpg" /> Figura 2: Uma imagem da configuração experimental da câmara de gás. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55710/55710fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/55710/55710table1.jpg" /> Tabela 1: Medição da Concentração de Oxigênio em Diferentes Tempos de Incubação na Câmara de Gás. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55710/55710table1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste f</a><html> Igure. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55710/55710fig3.jpg" /> Figura 3: Aumentos de níveis de HIF-1α após a indução de hipoxia em embriões Xenopus e suas retinas. Transferências de Western de lisados ​​de proteínas de embriões inteiros ( A ) ou de retinas embrionárias isoladas ( B ) mantidas sob concentrações normais de oxigênio ou em hipoxia. Blots foram sondados para a subunidade HIF-1a e a-tubulina. Foram obtidos pelo menos 5 embriões ou 22 retinas para cada condição ( n = 5) ( C, D ) Quantificação da Western blot realizada em ( A, B ), respectivamente. Os níveis de proteína de HIF-1α foram normalizados para os níveis de proteína da a-tubulina. As barras de erro representam desvios padrão entre experiências. * P- valor &lt;0,05, *** p- valor &lt;0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55710/55710fig4.jpg" /> Figura 4: A hipoxia diminui a proliferação de progenitores no nicho de células-tronco da retina de embriões de rã. ( A ) Representação esquemática de uma seção transversal através de uma retina Xenopus de 38 estágios, indicando a posição da incorporação EdU da zona marginal ciliar (CM) ( B , C ) medida após um pulso EdU de 2 h em retinas coradas com DAPI de 38 estágios Embriões de sapo mantidos sob normoxia ( B ) ou na câmara hipóxica ( C ). Magenta = mancha DAPI; Gray = EdU mancha. Barras de escala = 50 μm ( D ) Quantificação do experimento realizado em B e C. As barras de erro representam desvios padrão. *** <em&gt; P-valor &lt;0,001; N = 7. Para cada condição, foram quantificadas 10-15 retinas ( G ) Quantificação de células EdU-positivas após uma incorporação de 1 h EdU em retinas de animais após várias épocas de hipoxia (tempo em minutos indicado no eixo dos x). As barras de erro representam desvios padrão de duas experiências independentes ( n = 2). Para cada condição e ponto de tempo, um mínimo de 10 retinas foi quantificado. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55710/55710fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55710/55710fig5.jpg" /> Figura 5: A hipoxia diminui a proliferação de progenitores no nódulo de células estaminais da retina de 4 dpf embriões de peixe-zebra. A incorporação de EdU medida após um pulso de EdU de 2 h em retinas manchadas com DAPI de 4 dpf de embriões de peixe zebra WTe novos mantidos eEr normoxia ( A ) ou na câmara hipóxica ( B ). Magenta: mancha DAPI; Cinza: mancha EdU. Barras de escala = 50 μm ( C ) Quantificação do experimento realizado em B e C. As barras de erro representam desvios padrão. *** p- valor &lt;0,001; N = 7. Para cada condição, foram quantificadas 10-15 retinas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55710/55710fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 1 suplementar" src="/files/ftp_upload/55710/55710S1.jpg" /> Figura 1 suplementar: os níveis de HIF-1α aumentam após a indução de hipoxia consistentemente em diferentes poços da placa e entre experiências diferentes. Transferências de Western de lisados ​​de proteína de embriões Xenopus inteiros mantidos sob concentrações normais de oxigênio ouEm dois poços diferentes da câmara hipóxica sob indução de hipoxia por 2 horas no experimento 1 ( A ) ou no experimento 2 ( B ). Blots foram sondados para a subunidade HIF-1a e a-tubulina. Foram obtidos 5 embriões de sapo do estágio 38 para cada condição. As experiências 1 e 2 são repetições biológicas independentes ( C, D ) Quantificação das transferências de Western realizadas em ( A, B ), respectivamente. Os níveis de proteína de HIF-1α foram normalizados para os níveis de proteína da a-tubulina. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55710/55710S1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

induction-of-hypoxia-in-living-frog-and-zebrafish-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K visualizações.  University of Cambridge.  Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia. 

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...