Agradecemos a Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher e Kristina Zudock para assistência em espécimes de herbário de amostragem e o jardim botânico de Missouri para o acesso aos espécimes de herbário para amostragem destrutiva. Este trabalho foi apoio por um subsídio da Fundação Nacional de ciência (DEB-1457748).

<ol>
	<li>Savolainen, V., Cu&#233;noud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Cr&#232;vecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+herbarium+specimens+in+DNA+phylogenetics:+Evaluation+and+improvement.">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li><li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. 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Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+(Asparagaceae).">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li><li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. 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Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

O protocolo aqui apresentado é um método abrangente e robusto para isolamento de DNA e sequenciamento de preparação da biblioteca de amostras de planta seca. A consistência do método e necessidade mínima de alterá-lo baseado em amostra qualidade fazer escalável para projetos de sequenciamento de grande baseada no herbário. A inclusão de uma etapa opcional reamplification para baixo rendimento bibliotecas permite a inclusão de baixa qualidade, baixa quantidade, rara ou historicamente importantes amostras que não seriam apropriadas para o sequenciamento.
Importância do rendimento do ADN inicial Herbário-derivada de ADN é frequentemente degradada em consequência da preservação espécime inicial11, com DNA de espécimes menos de 300 anos velho sendo tão degradado como DNA isolado de ossos de animais que são várias centenas de milhares de anos de idade31 , 32. consequentemente, otimização do rendimento inicial do ADN é vital na obtenção suficiente dsDNA de alta qualidade para a preparação de biblioteca de sequenciamento de sucesso. Para as espécies de grama, um rendimento ideal é conseguido através do uso combinado de areia esterilizada e nitrogênio líquido na moagem inicial passo, proporcionando uma mais profunda destruição das paredes celulares e liberação de ácidos nucleicos. Essa abordagem aumenta tanto desejável maior dsDNA e fragmentos menores indesejáveis (Figura 1, figura suplementar 1, tabela 2, suplementar a tabela 1). Etapas de limpeza subsequente do grânulo isolar e enriquecem por fragmentos de um tamanho adequado para sequenciamento (300-500 pares de bases), reduzindo a recuperação, mas também enriquecedor para mais fragmentos (tabela 2, suplementar a tabela 1). Alterações para os passos iniciais de isolamento de DNA podem ser necessárias com base na linhagem sendo amostrada para reduzir os efeitos dos metabólitos secundários em processamento a jusante18.
Otimização de adaptadores de biblioteca A concentração de adaptadores utilizados para ligadura tem um efeito direto sobre a quantidade de dímero de adaptador em bibliotecas acabadas. Dímeros de adaptador resultam de ligadura auto adaptador quando houver amostra insuficiente e contaminam o sequenciamento execuções33. A relativamente baixa dsDNA total disponível a partir de espécimes de herbário exige diluição de adaptadores antes da ligadura. Adaptadores podem ser diluídas 50-fold resultantes da concentração das ações de 15 µM (consulte a Seção de protocolo) facilitar preparação de biblioteca de alta produtividade sem a necessidade de individualmente medir e diluir o adaptador para cada amostra (tabela 2, tabela suplementar de 1). embora a saturação de adaptadores poderia, em princípio, diminuir rendimento global biblioteca, é improvável que espécimes de herbário cederá dsDNA em tal excesso de adaptador.
Variação no grânulo de etapas de limpeza para rendimentos mais elevados Seleção de tamanho na preparação das bibliotecas de sequenciamento é feita geralmente após a ligadura do adaptador, permitindo a amplificação de fragmentos principalmente dentro da escala do tamanho desejado; Isto é feito através da remoção de fragmentos maiores e menores que o tamanho do alvo. A baixa quantidade de dsDNA herbário-derivado para a preparação de biblioteca é agravada após a seleção de tamanho neste passo, resultando em baixa improdutivo dsDNA total e, finalmente, baixo rendimento na biblioteca final. Conduzindo um passo do grânulo-limpeza padrão usando contas de volume 90% depois da ligadura, mais dsDNA total permanece para enriquecimento na etapa de amplificação. Extremamente pequenos fragmentos de DNA são removidos preferencialmente usando 90% volume grânulos. Seleção de tamanho é realizada na etapa final na biblioteca de amplificado, o que garante o enriquecimento de tamanhos do fragmento desejado. Volumes totais de grânulos podem ser ajustados para selecionar o intervalo desejado, embora os volumes de duas etapas de 25 µ l e 6 µ l dos grânulos são otimizados para recuperar bibliotecas de inserções de 400-500 pares de base no âmbito do presente protocolo (figura 1B, complementar a Figura 2).
Resgate de amostra através de Reamplification de bibliotecas Apesar das melhores práticas de isolamento de DNA e preparação de biblioteca, concentrações finais de bibliotecas de sequenciamento podem ser inadequadas para sequenciamento ainda mais. A natureza destrutiva da amostragem e muitas vezes limitado material descartável de espécimes de herbário não permite sempre repetindo o isolamento do DNA. Por amplificar a biblioteca até 12 ciclos adicionais de PCR, mesmo extremamente pobres bibliotecas podem ser salvos. Um par de primer padrão é usado para a amplificação, que é compatível com protocolos de qualquer biblioteca indexada dual ou single. A principal preocupação da reamplification é a introdução de viés, muitas vezes através da redução em porções de GC-ricos do genoma20. Usando um polymerase de alta-fidelidade (ver Tabela de materiais), estes potenciais vieses potencialmente são evitados. Isso é demonstrado através da variação mínima de conteúdo GC das bibliotecas sequenciados TK686 e TK686-R (tabela 3). Como uma segunda verificação, o conteúdo de transposon de TK686 e de TK686-R foi estimado e não mostrou nenhuma diferença discernível (tabela 3). Finalmente, o genoma do cloroplasto toda esta adesão foi montado a partir de TK686 e TK686-R, que resultou em sequências idênticas após uma inspeção rigorosa de variação de SNP entre os dois assemblies (Figura 2, tabela 3). Estes testes sugerem esse padrão genômica métricas, tais como conteúdo GC e composição de transposon e a capacidade de montar genomas completos cloroplasto, não podem ser afetados por reamplification. Isto abre a possibilidade de incorporando herbário espécimes pensado para ser demasiado degradados ou falta de material para estudos filogenéticas sem a preocupação de viés introduzido através do PCR. Essas bibliotecas reamplified também podem ser usadas para captura de sequência34, embora seja necessário testar se chamando de SNP é tendencioso. É recomendado que testes de pequena escala de preconceito sejam conduzidos com cada projeto para verificar que o preconceito não seja introduzido na bibliotecas de sequenciamento.
Limitações e possíveis modificações Mesmo que este protocolo já trabalhou em centenas de espécimes de herbário, mal preservados os tecidos ainda podem falhar em qualquer etapa. É, no entanto, extremamente raro bibliotecas falhar de tecidos com sucesso extrações de DNA, especialmente depois do resgate da biblioteca através de reamplification. As etapas de seleção de tamanho podem ser modificadas para diferentes tamanhos de fragmentos de destino ou para reduzir a grande variedade de fragmentos visto em algumas bibliotecas finais. Como com todos os protocolos de extração vegetal, as etapas podem ser necessários para remover a linhagem-específicos compostos secundários que podem impedir o protocolo geral. Conforme apresentado, este protocolo fornece um método padrão para a preparação de biblioteca isolamento e elevado-throughput DNA para espécimes de herbário de grama e através da verificação e experimentação, é provável que seja alteráveis para outras linhagens da planta.

Coleções de herbário são uma fonte potencialmente valiosa de espécies e diversidade genômica para estudos incluindo filogenética1,2,3, genética de populações4,5, conservação Biologia6, espécies invasoras biologia7e de evolução do traço8. A capacidade de obter uma rica diversidade de espécies, populações, localizações geográficas e pontos de tempo destaca o "tesouro"9 que é o herbário. Historicamente, a natureza degradada do herbário-derivada de ADN tem prejudicado projetos baseados em PCR, muitas vezes relegando pesquisadores usando apenas marcadores encontrados em cópia elevada, tais como regiões do genoma do cloroplasto ou do espaçador transcrito interno (ITS) do ribossômico RNA. Qualidade dos espécimes e DNA variam amplamente baseado em métodos de preservação9,10, com quebras de dupla-hélice e fragmentação do calor usado no processo de secagem, sendo as formas mais comuns de danos, criando o so-called 90% DNA de lock-up que tem hipotecada estudos baseados em PCR11. Além de fragmentação, a questão segundo mais prevalente no herbário genómica é contaminação, tais como que derivado de fungos endofíticos13 ou fungos adquiriram após a morte, após a colheita, mas antes de montar no herbário12, embora Este problema pode ser resolvido bioinformatically dado do banco de dados bem fúngico (veja abaixo). Um terceiro e menos comum, o problema é a modificação de sequência a citosina desaminação (C/G→T/A)14, embora estima estar baixa (~ 0,03%) em espécimes de herbário11. Com o advento do sequenciamento de alto rendimento (HTS), a questão da fragmentação pode ser superada com leituras curtas e sequenciamento profundidade12,15, permitindo a aquisição de dados de nível de genômica de numerosos espécimes com baixa qualidade DNA e por vezes mesmo permitindo de sequenciamento do genoma inteiro15.
Amostras de herbário são cada vez mais frequentemente utilizadas e são um componente maior de projetos filogenética16. Um desafio atual da utilização de espécimes de herbário para HTS é consistentemente a obtenção suficiente DNA encalhado dobro, uma condição prévia necessária para protocolos de sequenciamento, de inúmeras espécies em tempo hábil, sem a necessidade de otimizar métodos para indivíduo espécimes. Neste trabalho, um protocolo para extração de DNA e preparação da biblioteca de espécimes de herbário é demonstrado que tira proveito dos métodos existentes e modifica-los para permitir resultados rápidos e replicáveis. Este método permite a completo de processamento de amostra para uma biblioteca de 24 amostras em 13 h, com tempo de hands-on de 8 h, ou 16 h, com tempo de hands-on 9 h, quando a etapa opcional reamplification é necessária. Processamento simultâneo de mais amostras é viável, embora o fator limitante é centrífuga capacidade e habilidade técnica. O protocolo é projetado para exigir apenas típico equipamento de laboratório (thermocycler, centrífuga e suportes magnéticos) em vez de equipamentos especializados, tais como um nebulizador ou sonicador, para a tosquia de DNA.
Qualidade de DNA, tamanho do fragmento e a quantidade estão limitando fatores para a utilização de espécimes de herbário em experimentos de sequenciamento de alto rendimento. Outros métodos para isolar o DNA de herbário e criar bibliotecas de sequenciamento de alta produtividade têm demonstrado a utilidade de usar tão pouco quanto 10 ng de DNA16; no entanto eles exigem experimentalmente determinando o número ideal de PCR ciclos necessários para a preparação de biblioteca. Isso se torna impraticável quando lidar com quantidades extremamente pequenas de duplo viável encalhado DNA (dsDNA), como alguns espécimes de herbário produzem DNA apenas suficiente para uma preparação única biblioteca. O método aqui apresentado usa um único número de ciclos, independentemente da qualidade da amostra, para que nenhum DNA é perdido em passos de otimização de biblioteca. Em vez disso, um passo de reamplification é invocado quando bibliotecas não respeitem os valores mínimos necessários para sequenciamento. Muitas amostras de herbário são raras e possuem pouco material, tornando-se difícil justificar a amostragem destrutiva em muitos casos. Para combater isso, o protocolo apresentado permite dsDNA entrada tamanhos menos de 1.25 ng para o processo de preparação de biblioteca, ampliando o escopo das amostras viáveis para alta produtividade de sequenciamento e minimizando a necessidade de amostragem destrutiva de espécimes.
O protocolo seguinte foi otimizado para gramíneas e testado em centenas de espécies diferentes de amostras de herbário, embora esperamos que o protocolo pode ser aplicado a muitos outros grupos de plantas. Ele inclui uma etapa de recuperação opcional que pode ser usada para salvar a baixa qualidade e/ou espécimes raros. Este protocolo baseado em mais de 200 espécimes de herbário testados, funciona em espécimes com tecido baixa entrada e qualidade, permitindo a preservação de espécimes raros através de amostragem destrutiva mínima. Aqui é mostrado que este protocolo pode fornecer bibliotecas de alta qualidade que podem ser sequenciadas para projetos baseados em phylogenomics.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">4452300</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:180px;">Azure Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">c300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microfuge 20 Series</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">B30137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Digital Dry Bath</td>
			<td style="width:180px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:104px;">BSH1001</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:180px;">EasyCast</td>
			<td style="width:104px;">B2</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td>
			<td style="width:180px;">ELGA&#160;</td>
			<td style="width:104px;">89204-092</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DNA LoBind Tube&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td style="width:147px;">2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mini centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-006-901</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-812</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mortar</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02591</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pestle</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02595</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">21-403-161</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microwave</td>
			<td style="width:180px;">Kenmore</td>
			<td style="width:104px;">405.7309231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">20170-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32866</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Balance</td>
			<td style="width:180px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:104px;">PM2000</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen Short-term Storage</td>
			<td style="width:180px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">F9401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Magnetic-Ring Stand&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">AM10050</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Water Bath</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">89032-210</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hot Plate Stirrers</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">97042-754</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:180px;">Airgas</td>
			<td style="width:104px;">UN1977</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1 X TE Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Ambion</td>
			<td style="width:104px;">AM9849</td>
			<td style="width:147px;">pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CTAB</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0833-500G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2-MERCAPTOETHANOL</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0482-200ML</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ribonuclease A</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">E866-5ML</td>
			<td style="width:147px;">10 mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63882</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">705744</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">40970004-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nuclease Free water</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">42300012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">A393-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">s608-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:180px;">GeneMate</td>
			<td style="width:104px;">E-3120-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">100bp PLUS DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:104px;">D003-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, Disodium Salt</td>
			<td style="width:180px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:104px;">IB70182</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">TRIS</td>
			<td style="width:180px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:104px;">103133</td>
			<td style="width:147px;">ultra pure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Loading Dye Purple (6 X)</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">B7024S</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0348L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&#160;</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7645L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7600S</td>
			<td style="width:147px;">Dual Index Primers Set 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0543L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mag-Bind RXNPure Plus</td>
			<td style="width:180px;">Omega bio-tek</td>
			<td style="width:104px;">M1386-02</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">GelRed 10000 X</td>
			<td style="width:180px;">Pheonix Research</td>
			<td style="width:104px;">41003-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:104px;">P4557-400ml</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVP40</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">PVP40-50G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Chloroform</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">EM8.22265.2500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ethanol</td>
			<td style="width:180px;">Koptec</td>
			<td style="width:104px;">V1016</td>
			<td style="width:147px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silica sand</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">14808-60-7</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reamplification primers</td>
			<td colspan="2">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>see text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sequencher v.5.0.1</td>
			<td style="width:180px;">GeneCodes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

Herbários são uma fonte inestimável de materiais vegetais que podem ser usados em uma variedade de estudos biológicos. A utilização de espécimes de herbário é associada com um número de desafios, incluindo a qualidade de preservação de amostra, DNA degradado e amostragem destrutiva de espécimes raros. Para utilizar mais eficazmente o material de herbário em projetos de sequenciamento de grande, é necessário um método confiável e escalável de preparação de isolamento e biblioteca de DNA. Este artigo demonstra um protocolo robusto, início-a-ponta para DNA isolamento e elevado-throughput construção da biblioteca de amostras botânicas que não exige modificação para amostras individuais. Este protocolo é adaptado para planta baixa qualidade secada material e leva vantagem de métodos existentes através da otimização de moagem de tecido, modificando a seleção de tamanho de biblioteca e introduzindo um passo opcional reamplification para bibliotecas de baixo rendimento. Reamplification de bibliotecas de DNA de baixo rendimento pode salvar amostras provenientes de espécimes de herbário potencialmente valioso e insubstituível, eliminando a necessidade de amostragem destrutiva adicional e sem a introdução de viés de sequenciamento discernível para comum aplicações filogenéticas. O protocolo foi testado em centenas de espécies de gramíneas, mas é esperado para ser adaptável para o uso em outras linhagens de planta após verificação. Este protocolo pode ser limitado por DNA extremamente degradado, onde não existem fragmentos na faixa de tamanho desejado, e por metabólitos secundários presentes em alguns materiais vegetais que inibem limpo isolamento do DNA. Em geral, este protocolo introduz um método rápido e abrangente que permite o isolamento de DNA e preparação da biblioteca de 24 amostras em menos de 13 h, com apenas 8 h de tempo ativo de hands-on com modificações mínimas.

Isolamento de DNA e o rendimento Final da biblioteca Neste estudo, demonstrou-se a eficácia do protocolo para o isolamento do DNA de herbário e a recuperação das bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade usando 50 amostras diferentes com os mais antigos de 1920 e o mais novo a partir de 2012 (tabela 2). Para cada amostra, cerca de 10 mg de tecido foliar foi usado para isolamento de DNA. Tecido de folha verde foi favorecido, se disponível, e não tecido, com evidente contaminação fúngica foi selecionado. Isolamentos de sucesso podem ser feitos usando tecido amarelo ou marrom, embora o rendimento deve ser esperado para ser menor. Duplo total encalhado DNA (dsDNA) do isolamento inicial variou de 3,56 ng para 2.610 ng. Como esperado, DNA obtido a partir de espécimes de herbário foi altamente degradada (figura 1A, suplementar , Figura 1). Uma parte desses isolamentos foram usados para a tosquia enzimática (GN 1.26 – 464). Apesar de herbário DNA já é cortado através do processo de preservação, otimização do protocolo requer tosquia adicionais para melhorar o rendimento global de biblioteca. A recuperação total do dsDNA pós-corte variou de < 1 a 51% da entrada dsDNA, resultando em um mínimo de menos de 1.25 ng de DNA de partida para a preparação de biblioteca e um máximo de 328 ng. A perda extrema em algumas amostras de DNA pode ser atribuída ao tamanho já pequeno fragmento de grande parte do DNA antes da enzimática corte (figura 1A, suplementar a Figura 1). O uso de uma limpeza de grânulo de 90% do volume no ADN distorcida propositadamente removido os menores fragmentos de DNA para enriquecer para tamanhos maiores, mais desejável do fragmento. Estes pequenos fragmentos foram especialmente vistos em amostras TK463, TK657 e TK694, como indicado por um sinal intenso na marca de 100 pares de base (figura 1A).
A quantidade total da seleção biblioteca post tamanho variou de 1.425 ng para 942.5 ng (tabela 2, suplementar a tabela 1). A preparação inicial de extração e biblioteca de 23 das amostras, não deu uma quantidade adequada de biblioteca (< 10 nM; Tabela 2, suplementar a tabela 1), então estas amostras foram submetidas às etapas de recuperação e reamplification do protocolo, resultando em um x 14 – 680 aumentar na biblioteca total (tabela 2, suplementar a tabela 1). Bibliotecas finais resultaram em uma banda entre 350 e 500 pares de base (figura 1B, suplementar a Figura 2). Às vezes, uma segunda banda que era maior que o tamanho esperado biblioteca foi vista (figura 1B, suplementar a Figura 2). Isto ocorreu quando a reamplification PCR exausto cartilhas disponíveis e começou o recozimento adaptadores biblioteca de fragmentos de DNA não-homólogos. Isso cria uma molécula onde as extremidades (os adaptadores de rede) foram devidamente recozimento, mas a inserção de DNA não. Esta molécula "bubbled" apareceu maior em um gel, enquanto se movia mais lentamente através da matriz do gel. Esses erros de recozimento foram fixados por preparando outra reação de reamplification da biblioteca já reamplified e executá-lo para um único ciclo. Este ciclo único fornecido cartilhas para recozimento adequada e amplificação, removendo a segunda banda (Supplemental Figura 3).
Reamplification de bibliotecas facilitou as concentrações finais de biblioteca de pelo menos 10 nM. Essas concentrações permitidas bibliotecas ser diluído para igual a molaridade e agrupado em igualdade de representação, ajudando a anular questões que teria surgido com a qualidade da amostra desiguais e sequenciamento de rendimento de biblioteca. Se o objetivo do projeto é o genoma do cloroplasto sequenciamento, então a quantidade total de sequenciamento necessário variará como diferentes linhagens e tecidos diferem quanto a porcentagem total de leituras que se originam de DNA de cloroplasto19. Normalmente, 50 – 100 x cobertura projetada do genoma do cloroplasto é suficiente para a montagem e sequenciamento é executado pode ser agrupado para incluir até 70 indivíduos, dependendo da espécie e método de sequenciamento.
Teste de contaminação, viés e variação causada por Reamplification Uma notável preocupação para sequenciamento de HTS é a introdução de viés em bibliotecas através de extensa PCR amplificação20. Para testar os efeitos de reamplification e identificar potenciais aplicações em comum filogenéticas viés de material de herbário, comparamos uma biblioteca com êxito sequenciada (TK686) com a mesma biblioteca diluída 1:5 e reamplified (designado TK686-R). Ambos os TK686 e TK686-R foram sequenciados em um Illumina HiSeq4000 no centro de biotecnologia da Universidade de Illinois Roy J. Carver e o recurso de suporte de tecnologia do Michigan estado Universidade pesquisa, respectivamente, usar 150 pares de base final emparelhados lê (consulte Tabela 3 para obter detalhes de sequenciamento). -Primas leituras tenham sido depositadas em NCBI SRA (SRP128083). Leituras foram limpos usando Trimmomatic v.0.3621 , incluindo filtragem de adaptador usando NEB adaptador sequência, qualidade de filtragem para uma pontuação média de PQV de 20 para um par de base 10, deslizando a janela, e um mínimo corte tamanho de 40 pares de bases. Como um dos principais problemas com espécimes de herbário é contaminação fúngica, contaminação foi estimada pelo mapeamento leituras contra uma porção do JGI MycoCosm genoma fúngico de banco de dados22 (312 genomas nucleares e 79 genomas mitocondriais) usando o bowtie2 v . 2.2.923 usando o parâmetro "muito sensível-local" definido. TK686 e TK686-R bibliotecas eram indistinguíveis na contaminação fúngica nuclear (9,24% e 9.68%, respectivamente) e contaminação fúngica mitocondrial (0,94% e 0,8%) (Tabela 3). Que este é apenas um exemplo, ela sugere que a contaminação fúngica das amostras de herbário não é insignificante e deve ser removida antes de utilizar dados de sequência de herbário-derivado. O banco de dados e comandos usados para identificar e remover a contaminação fúngica podem ser encontrados no repositório GitHub de M. R. McKain herbário genómica24.
Sequenciamento de genoma do cloroplasto é comumente utilizado para análises filogenéticas, e espécimes de herbário são cada vez mais usados como material de fonte12. A fim de testar a fidelidade do reamplification na Assembleia de genoma do cloroplasto, genomas de cloroplasto para TK686 e TK686-R foram montadas com Fast-Plast v.1.2.525 sob as configurações padrão com o índice de bowtie definido como Poales. Obteve-se um genoma completo do cloroplasto para o TK686-R, mas o genoma do cloroplasto TK686 foi montado em sete contigs devido a baixa profundidade de leitura. Os TK686 contigs foram montados manualmente seguindo McKain et al 26 totalmente montados cloroplasto genomas foram alinhadas uns aos outros em um software de alinhamento baseado em GUI (ver Tabela de materiais) e a variação entre módulos (assemblies) foi avaliada. Um total de 12 SNPs e um indel foram identificados entre os conjuntos de cloroplasto de TK686 e TK686-R. Para cada variante, a cobertura foi avaliada em leitura de moda de TK686 e TK686-R. Em todos os casos, a variante mais comum era a mesma entre as duas bibliotecas. TK686 demonstrou um T→C, um G→A, um G→T, um G→-, um C→A, um T→A e quatro variantes C→A. Cinco dessas variantes ocorreu dentro de uma sequência de homopolímero, sugerindo que sua incorporação do assembly pode ter sido o resultado de erro de sequenciamento e baixa cobertura global. Os outros podem ter sido o resultado de variação de haplótipo do cloroplasto, erro de sequenciamento ou desaminação citosina, ou alguma combinação destes fatores. TK686-R teve um C→T, um G→T e um A→G. As variantes C→T e G→T foram encontradas em um homopolímero como acima. Em última análise, identificaram-se genomas idênticos cloroplasto completa de ambos os conjuntos de leitura. Um genoma único cloroplasto de TK686 foi anotado usando verdejante21 e em comparação com outros membros da tribo Andropogoneae. Todos os recursos padrão do cloroplasto foram anotados: 84 genes codificação de proteína, 38 tRNAs e 8 rRNAs. O genoma do cloroplasto completa está disponível do GenBank (MF170217) e verdejante27.
Potencial viés da reamplification das bibliotecas também foi determinada através da estimativa da % GC e o conteúdo total estimado transposon. Percentual GC foi estimada utilizando um script personalizado24. Diferenças de conteúdo GC das duas amostras foram negligenciáveis, com 49,7% GC em TK686 e 51,2% GC em TK686-R. Composição de Transposon foi estimada usando Transposome28. Para ambas as bibliotecas, 100.000 leituras foram aleatoriamente subsampled composição transposon foi estimada usando uma identidade por cento de 90, uma cobertura de fração de 0,55, um tamanho do cluster de 100 e a referência de repetição RepBase 21,10 grama conjunto29. Isso foi repetido 100 vezes para executar inicialização na estimativa de transposon partir esses conjuntos de dados. Percentagens do total do genoma para principais subfamílias de transposões foram extraídas de saída de Transposome, e a média e o desvio padrão desses para as 100 repetições foram estimados. Todos os scripts usados para gerar essas saídas podem ser encontrados no repositório Github de M. R. de McKain Transposons30, e todos os resultados tenham sido depositados em dríade (doi:10.5061/dryad.r8t2m). Usando as duas subfamílias mais prevalentes de transposon como indicadores (terminal longoCopia e cigano repetir retrotransposons), os resultados eram quase idênticos com Copia em 33,52 ± 4,00% e 31,68 ± 2,94% e cigano a 24.83 ± 2,72% e 24,00 ± 2,35% em TK686 e TK686-R, respectivamente (tabela 3). Os resultados dos testes sugerem que a etapa de reamplification do presente protocolo não criar preconceito de sequenciamento significativo para métricas de genoma de alto nível. No entanto, deve notar-se que este exemplo único não pode ser plenamente representativo de todas as bibliotecas de reamplified. Este teste simples demonstra que a etapa de reamplification não era inerentemente polarização métricas do genoma em TK686/TK686-R. Viés introduzido não afetaria a montagem de um genoma do cloroplasto dado cobertura suficiente de sequenciamento, mas é recomendável que as experiências, conforme apresentado neste estudo com TK686/TK686-R, são realizadas em linhagens de destino para verificar se o preconceito não é ocorrendo durante estudos investigando a diversidade de elemento transponíveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig1.jpg"> Figura 1: imagens de gel de Agarose da) isolamento de DNA e bibliotecas de sequenciamento B) final de dez espécimes de herbário. Para cada raia, utilizou-se a 3 µ l de DNA ou biblioteca. (A) DNA foi degradada em todos os isolamentos de herbário, como visto pela mancha geral. (B) bibliotecas de sequenciamento Final retratam uma banda principal de 300-500 pares de bases com uma distribuição mais ampla de 200-1.000 pares de bases; o último é mais prevalente em bibliotecas de reamplified. Pistas para ambos (A) e (B) foram identificados pela amostra e pode ser comparado com os resultados na tabela 2. Tamanho da escada foi retratado em pares de bases (bp). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2.jpg"> Figura 2 : Trama circular de Schizachyrium scoparium Genoma do cloroplasto (TK686) com anotação. O genoma totalmente montado de sequenciamento de espingarda de DNA derivado de herbário exibiu um comprimento total de 139.296 pares de bases (bp), uma região de grande cópia única (LSC) de 81.401 bp, uma região de repetição invertida (IR) de 22.669 bp e uma região pequena de cópia única (CCD) de 12.557 BP. Todos padrão genes codificantes de proteínas, os tRNAs e rRNAs por membros da tribo Andropogoneae foram identificados na anotação. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 2: Resultados de preparação extração e biblioteca de DNA para dez amostras de herbário e quatro bibliotecas reamplified. O total ADN encalhado dobro em diversas etapas no protocolo demonstrada qualidade como variável pode ser, especialmente quando filtrada para o tamanho. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: estatísticas de sequenciamento para TK686 e o TK686R reamplified. Reamplification não afeta a incidência global de contaminação fúngica do genoma, estimativa de conteúdo GC, estimativa de composição do transposon ou a capacidade de montar genomas toda cloroplasto. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table3_Sequencing_Statistics_TK686.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementar tabela 1: extração e biblioteca preparação de DNA para 40 amostras de herbário adicionais, incluindo vinte bibliotecas reamplified. Total ADN encalhado dobro em diversas etapas no protocolo demonstrada qualidade como variável pode ser, especialmente quando filtrada para o tamanho. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Table1_Data.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementar Figura 1: imagens de gel de Agarose de quarenta isolamentos adicionais do DNA de amostras botânicas. Ambos (A) e (B) retratam os isolamentos de DNA separados vinte e demonstrar a degradação característica de DNA derivado de herbário. Para cada raia, utilizou-se a 3 µ l de DNA. Pistas para ambos (A) e (B) foram identificados pela amostra e pode ser comparado com os resultados no quadro suplementar 1. Tamanho da escada é retratado em pares de bases (bp). Branco manchas na imagem são devido a artefactos no tonalizador de gel que não pôde ser removido com a limpeza. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure1_DNA_Isolation.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Suplementar Figura 2: imagens de gel de Agarose de quarenta bibliotecas adicionais de sequenciamento de DNA derivado de herbário. Para cada raia, utilizou-se a 3 µ l de biblioteca. Bibliotecas final sequenciamento são encontradas em ambos os (A) e (B) com um tamanho médio de 300-500 pares de bases. Bandas secundárias vistas em algumas amostras amplificadas sugerem "borbulhando" das bibliotecas. Pistas para ambos (A) e (B) são identificados por amostra e pode ser comparado com os resultados no quadro suplementar 1. Tamanho da escada é retratado em pares de bases (bp). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Figure_2_Library_Prep.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Suplementar Figura 3: imagem de gel de Agarose de remoção de banda secundário com um passo PCR de ciclo único adicionais. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure3_Single_Cycle_Clean.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>

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Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Este artigo demonstra um protocolo detalhado para isolamento de DNA e construção de biblioteca de sequenciamento da elevado-produção de material de herbário, incluindo resgate de má qualidade excepcionalmente DNA.

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K visualizações.  Donald Danforth Plant Science Center. Este artigo demonstra um protocolo detalhado para isolamento de DNA e construção de biblioteca de sequenciamento da elevado-produção de material de herbário, incluindo resgate de má qualidade excepcionalmente DNA.

Vídeo: Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genética

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Purificação de DNA de alto peso molecular genômico de oídio de longo Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...