Agradecemos a Taylor AuBuchon-anciano, Jordania Teisher y Kristina Zudock asistencia en ejemplares de herbario de muestreo y el jardín botánico de Missouri para el acceso a los especímenes de herbario para muestreo destructivo. Este trabajo fue el apoyo de una beca de la National Science Foundation (DEB-1457748).

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

El protocolo presentado aquí es un método integral y robusto para aislamiento de DNA y la secuencia de preparación de biblioteca de muestras de la planta seca. La consistencia del método y mínima necesidad de alterarlo según el ejemplar calidad hacen que escalable para proyectos grandes secuenciación basada en herbario. La inclusión de un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento permite la inclusión de baja calidad, baja cantidad, rara o históricamente importantes muestras que de lo contrario no sería convenientes para la secuencia.
Importancia de la producción de ADN inicial de DNA derivado herbario se a menudo degrada como consecuencia inicial de la muestra preservación11, con el ADN de las muestras menos de 300 años de edad como degradado como ADN de restos de animales que son varios cientos de miles de años31 , 32. en consecuencia, es vital en la obtención de suficiente dsDNA de alta calidad para la preparación de la biblioteca de secuenciación exitosa optimización de rendimiento de ADN inicial. Para especies de gramíneas, un rendimiento óptimo se consigue mediante el uso combinado de arena esterilizada y nitrógeno líquido en la molienda inicial paso, proporcionando una más completa destrucción de las paredes celulares y la liberación de los ácidos nucleicos. Este enfoque aumenta dsDNA más deseable y fragmentos más pequeños no deseados (figura 1, suplementario Figura 1, tabla 2, suplemento tabla 1). Pasos de limpieza de grano posterior aislar y enriquecen para fragmentos de un tamaño adecuado para la secuencia (300 – 500 pares de bases), reduciendo enormemente la recuperación pero también enriqueciendo de más fragmentos (tabla 2, suplemento tabla 1). Alteraciones en los pasos de aislamiento de ADN iniciales pueden ser necesarios basado en el linaje de ser muestreado para reducir los efectos de metabolitos secundarios en procesamiento descendente18.
Optimización de los adaptadores de la biblioteca La concentración de los adaptadores utilizados para ligadura tiene un efecto directo sobre la cantidad de dímero de adaptador en bibliotecas terminadas. Adaptador dímeros como resultado de la uno mismo-ligadura de adaptador cuando muestra insuficiente y contaminan la secuencia funciona33. El dsDNA total relativamente baja de especímenes de herbario requiere dilución de adaptadores antes de la ligadura. Adaptadores pueden ser diluidos 50 veces de la concentración stock de 15 μm (véase la Sección de protocolo) facilitar preparación de biblioteca de alto rendimiento sin la necesidad de medir individualmente y diluir adaptador para cada muestra (tabla 2, tabla suplementaria 1). aunque en principio saturación de adaptadores podría disminuir producción Biblioteca General, es poco probable que especímenes de herbario cederá dsDNA en tal exceso de adaptador.
Variación en los pasos de limpieza para un mayor rendimiento de grano Preselección en la preparación de quimiotecas de secuenciación se realiza después de la ligadura del adaptador, que permite la amplificación de fragmentos principalmente dentro de la gama del tamaño deseado; Esto se hace mediante la eliminación de fragmentos que son más grandes y más pequeños que el tamaño deseado. La baja cantidad de dsDNA derivado herbario para la preparación de la biblioteca se exacerba después de la preselección en este paso, lo que opinaban baja dsDNA total y, en definitiva, bajo rendimiento en la biblioteca final. Mediante la realización de un paso de limpieza de grano estándar usando 90% volumen granos después de la ligadura, más dsDNA total sigue siendo para el enriquecimiento en la etapa de AMPLIFICACION. Extremadamente pequeños fragmentos de ADN se extraen preferentemente usando 90% volumen granos. Selección del tamaño se lleva a cabo en el paso final en la biblioteca amplificado, que garantiza el enriquecimiento de los tamaños del fragmento deseado. Volumen total de granos puede ajustarse para seleccionar el rango deseado, aunque los volúmenes de dos etapas de 25 μl y 6 μl de granos están optimizados para obtener las bibliotecas de 400-500 pares insertos dentro de este protocolo (figura 1B, suplementario Figura 2).
Rescate de la muestra a través de Reamplificación de bibliotecas A pesar de las mejores prácticas en preparación de biblioteca y de ADN, concentraciones finales de las bibliotecas de la secuencia pueden ser insuficientes para seguir la secuencia. La naturaleza destructiva de muestreo y a menudo limitado material de uso de especímenes de herbario no siempre permite repetición de ADN. Por reamplifying la biblioteca hasta 12 ciclos adicionales de PCR, incluso excepcionalmente pobres bibliotecas pueden guardarse. Un par de primer estándar se utiliza para la amplificación, que es compatible con cualquiera de los dos protocolos de biblioteca indexadas doble o individual. Una preocupación primaria para Reamplificación es la introducción de sesgo, a menudo mediante la reducción de las porciones ricas en GC del genoma20. Mediante el uso de una polimerasa de alta fidelidad (véase Tabla de materiales), potencialmente se evitan los sesgos potenciales. Esto es demostrado a través de la mínima variación de contenido de GC de las bibliotecas de secuenciadas TK686 y TK686-R (tabla 3). Como segunda verificación, el contenido de transposon de TK686 y TK686-R fue estimado y no mostró ninguna diferencia apreciable (tabla 3). Por último, el genoma del cloroplasto todo de esta adhesión fue montado de TK686 y TK686-R, que dio lugar a secuencias idénticas después de la inspección cerca de variación SNP entre los dos conjuntos (figura 2, tabla 3). Estas pruebas sugieren métricas estándar de genómica, tales como contenido de GC y composición de transposon y la capacidad para ensamblar genomas completos del cloroplasto, no pueden verse afectadas por la Reamplificación. Esto abre la posibilidad de incorporar herbario muestras cree que se degrada demasiado o falta de material en phylogenomic estudios sin preocupación por el sesgo introducido por PCR. Estas bibliotecas reamplified podrían utilizarse también para la secuencia de captura34, aunque sería necesario comprobar llamadas SNP es parcial. Se recomienda que las pruebas a pequeña escala de sesgo realizar con cada proyecto para verificar que bias no es introducido en las bibliotecas de la secuencia.
Limitaciones y posibles modificaciones Aunque este protocolo ha trabajado en cientos de ejemplares de herbario, mal conservado tejidos todavía pueden fallar en cualquier paso. Sin embargo, es excesivamente raro para las bibliotecas no de tejidos con extracciones exitosas de ADN, especialmente después del rescate de la biblioteca a través de Reamplificación. Los pasos de selección de tamaño se pueden modificar a fragmentos de tamaño diferentes o para reducir la amplia gama de fragmentos vistos en algunas bibliotecas finales. Como con todos los protocolos de extracción basados en plantas, pasos pueden ser necesaria para eliminar el linaje-específicas compuestos secundarios que pueden impedir el protocolo general. Tal como se presenta, este protocolo proporciona un método estándar para la preparación de ADN aislamiento y alto rendimiento de biblioteca para especímenes de herbario hierba y a través de verificación y experimentación es probable que sea modificable a otros linajes de la planta.

Colecciones de herbario son una fuente potencialmente valiosa de especies y diversidad genómica de estudios incluyendo phylogenetics1,2,3, genética de poblaciones4,5, conservación Biología6, de la biología de las especies invasoras7y rasgo evolución8. La capacidad para obtener una rica diversidad de especies, poblaciones, regiones geográficas y momentos destaca el "tesoro"9 que es el herbario. Históricamente, la naturaleza degradada del ADN derivado de herbario ha obstaculizado los proyectos basados en PCR, a menudo relegando los investigadores a usar sólo los marcadores encontrados en copia alta, como las regiones del genoma de cloroplasto o el espaciador transcrito interno (ITS) de la ribosomal ARN. Calidad de las muestras y ADN varían ampliamente en base a métodos de conservación9,10, con las roturas de doble hebra y fragmentación de calor utilizado en el proceso de secado siendo las formas más comunes de daños, la creación de la supuesto 90% ADN calabozo que ha gravado estudios basados en PCR11. Aparte de fragmentación, lo segundo más frecuente en la genómica de herbario es contaminación, tales como que derivado de los hongos endófitos13 u hongos adquirieron post mortem después de la recolección, pero antes de montar en el herbario12, aunque este problema puede ser solucionado bioinformatically dado la derecha fungicida base de datos (véase abajo). Un problema terceros y menos común, es modificación de la secuencia a través de citosina desaminación (G→T/C/A)14, aunque se estima que bajo (~ 0,03%) en ejemplares de herbario11. Con el advenimiento de secuenciación de alto rendimiento (HTS), la cuestión de la fragmentación puede superarse con lecturas cortas y secuenciación profundidad12,15, permitiendo la adquisición de datos de nivel genómico de numerosas muestras con baja calidad ADN e incluso a veces permitiendo que todo el genoma secuencia15.
Muestras de herbario son cada vez más frecuente y son un componente más grande de proyectos filogenética16. Un reto actual de la utilización de especímenes de herbario para HTS constantemente es obtener suficiente ADN de trenzado doble, un requisito previo necesario para los protocolos de la secuencia, de numerosas especies de manera oportuna, sin necesidad de optimizar los métodos para el individuo muestras. En este documento, un protocolo para la extracción de ADN y biblioteca preparación de especímenes de herbario se demuestra que se aprovecha de los métodos existentes y modifica para permitir resultados rápidos y reproducibles. Este método permite el completo procesamiento del espécimen a una biblioteca de 24 muestras 13 h, con el tiempo práctico 8 h o 16 h, con tiempo práctica 9 h, cuando se requiere el paso de Reamplificación opcional. Proceso simultáneo de muestras más es factible, aunque el factor limitante es la centrifugadora de la capacidad y habilidad técnica. El protocolo está diseñado para requerir sólo típico equipo de laboratorio (termociclador, centrífuga y soportes magnéticos) en lugar de equipo especializado, como un nebulizador o un sonicador, para el corte de ADN.
Calidad de ADN, el tamaño de fragmento y cantidad son limitantes para el uso de ejemplares de herbario en experimentos de secuenciación de alto rendimiento. Otros métodos para aislar ADN de herbario y crear bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento han demostrado la utilidad de utilizar tan poco como 10 ng de ADN16; sin embargo necesitan determinar experimentalmente el número óptimo de PCR ciclos necesarios para la preparación de la biblioteca. Esto se hace impracticable cuando tratar con muy pequeñas cantidades de viable doble trenzado DNA (dsDNA), como algunos ejemplares de herbario producen sólo suficiente ADN para la preparación de una sola biblioteca. El método presentado aquí utiliza un número de ciclos independientemente de la calidad de la muestra, por lo que no hay ADN se pierde en los pasos de optimización biblioteca. En cambio, un paso de Reamplificación se invoca cuando las bibliotecas no cumplen con los montos mínimos necesarios para la secuencia. Muchas muestras de herbario son raras y poseen poco material, lo que hace difícil justificar muestreo destructivo en muchos casos. Para contrarrestar esto, el protocolo presentado permite dsDNA entrada tamaños menos de 1.25 ng en el proceso de preparación de la biblioteca, ampliando el alcance de las muestras viables de alto rendimiento de secuenciación y minimizando la necesidad de muestreo destructivo de muestras.
El siguiente protocolo ha sido optimizado para las hierbas y probado en cientos de diferentes especies de muestras de herbario, aunque esperamos que el protocolo se puede aplicar a muchos otros grupos de plantas. Incluye un paso de recuperación opcional que puede utilizarse para salvar a baja calidad o especímenes raros. Basado en más de 200 especímenes de herbario probados, este protocolo trabaja en especímenes con entrada baja de tejido y calidad, lo que permite la preservación de especímenes raros a través de un mínimo muestreo destructivo. Aquí se demuestra que este protocolo puede proporcionar bibliotecas de alta calidad que pueden ser secuenciadas para proyectos basados en la filogenómica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">4452300</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:180px;">Azure Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">c300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microfuge 20 Series</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">B30137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Digital Dry Bath</td>
			<td style="width:180px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:104px;">BSH1001</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:180px;">EasyCast</td>
			<td style="width:104px;">B2</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td>
			<td style="width:180px;">ELGA&#160;</td>
			<td style="width:104px;">89204-092</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DNA LoBind Tube&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td style="width:147px;">2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mini centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-006-901</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-812</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mortar</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02591</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pestle</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02595</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">21-403-161</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microwave</td>
			<td style="width:180px;">Kenmore</td>
			<td style="width:104px;">405.7309231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">20170-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32866</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Balance</td>
			<td style="width:180px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:104px;">PM2000</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen Short-term Storage</td>
			<td style="width:180px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">F9401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Magnetic-Ring Stand&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">AM10050</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Water Bath</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">89032-210</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hot Plate Stirrers</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">97042-754</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:180px;">Airgas</td>
			<td style="width:104px;">UN1977</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1 X TE Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Ambion</td>
			<td style="width:104px;">AM9849</td>
			<td style="width:147px;">pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CTAB</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0833-500G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2-MERCAPTOETHANOL</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0482-200ML</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ribonuclease A</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">E866-5ML</td>
			<td style="width:147px;">10 mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63882</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">705744</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">40970004-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nuclease Free water</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">42300012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">A393-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">s608-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:180px;">GeneMate</td>
			<td style="width:104px;">E-3120-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">100bp PLUS DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:104px;">D003-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, Disodium Salt</td>
			<td style="width:180px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:104px;">IB70182</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">TRIS</td>
			<td style="width:180px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:104px;">103133</td>
			<td style="width:147px;">ultra pure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Loading Dye Purple (6 X)</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">B7024S</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0348L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&#160;</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7645L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7600S</td>
			<td style="width:147px;">Dual Index Primers Set 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0543L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mag-Bind RXNPure Plus</td>
			<td style="width:180px;">Omega bio-tek</td>
			<td style="width:104px;">M1386-02</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">GelRed 10000 X</td>
			<td style="width:180px;">Pheonix Research</td>
			<td style="width:104px;">41003-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:104px;">P4557-400ml</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVP40</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">PVP40-50G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Chloroform</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">EM8.22265.2500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ethanol</td>
			<td style="width:180px;">Koptec</td>
			<td style="width:104px;">V1016</td>
			<td style="width:147px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silica sand</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">14808-60-7</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reamplification primers</td>
			<td colspan="2">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>see text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sequencher v.5.0.1</td>
			<td style="width:180px;">GeneCodes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

Herbarios son una fuente valiosa de material vegetal que se puede utilizar en una variedad de estudios biológicos. El uso de especímenes de herbario está asociado con un número de desafíos, incluyendo calidad de preservación de la muestra ADN degradado y muestreo destructivo de especímenes raros. Para utilizar más eficazmente material de herbario en proyectos grandes de la secuencia, es necesario un método confiable y escalable de ADN aislamiento y biblioteca de preparación. Este documento muestra un protocolo robusto, de principio a fin para ADN aislamiento y alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario que requieren modificación para muestras individuales. Este protocolo se adapta para baja calidad secado planta material y toma ventaja de los métodos existentes mediante la optimización de tejido pulido, modificar la selección de tamaño de la biblioteca y presentando un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento. Reamplificación de bibliotecas de ADN de bajo rendimiento puede rescatar muestras derivadas de especímenes de herbario insustituible y potencialmente valiosa, negando la necesidad de muestreo destructivo adicional y sin introducir sesgo de secuencia perceptible común aplicaciones filogenéticas. El protocolo ha sido probado en cientos de especies de gramíneas, pero se espera que sea adaptable para el uso en otros linajes de la planta después de la verificación. Este protocolo puede ser limitada por ADN muy degradado, donde fragmentos no existen en la gama del tamaño deseado, y por metabolitos secundarios presentes en un material de planta que inhiben el aislamiento de ADN limpio. En general, este protocolo presenta un método rápido y completo que permite la extracción de ADN y preparación de la biblioteca de 24 muestras en menos de 13 horas, con solo 8 h de tiempo práctica activa con modificaciones mínimas.

Aislamiento de ADN y rendimiento Final de la biblioteca En este estudio, se demostró la eficacia del protocolo para el aislamiento de la DNA del herbario y la recuperación de las bibliotecas de la secuencia de alta calidad con cincuenta muestras diferentes la más antigua de 1920 y el más joven de 2012 (tabla 2). Para cada muestra, se utilizó aproximadamente 10 mg de tejido foliar para el aislamiento de ADN. Tejido foliar más verde se vio favorecido si está disponible, y no tejido con evidente contaminación fúngica fue seleccionado. Éxito aislamientos se pueden hacer con tejido amarillo o marrón, aunque rendimiento debe esperarse que sea menor. Total doble trenzado DNA (dsDNA) desde el aislamiento inicial varió de 3,56 ng a 2.610 ng. Como era de esperar, ADN obtenido de muestras de herbario fue altamente degradada (figura 1A, suplementales figura 1). Una porción de estos aislamientos fueron utilizados para el corte enzimático (GN 1.26-464). Aunque herbario ADN ya está cortado a través del proceso de preservación, optimización del protocolo requiere de corte adicional para mejorar el rendimiento de la Biblioteca General. La recuperación total del dsDNA la corte varió de < 1% a 51% de entrada dsDNA, resultando en un mínimo de menos de 1.25 ng de DNA de partida para la preparación de biblioteca y un máximo de 328 ng. La extrema pérdida de ADN en algunas muestras puede atribuirse al tamaño ya pequeño fragmento de gran parte de la DNA antes enzimática corte (figura 1A, suplementario Figura 1). El uso de una limpieza de grano 90% del volumen en la DNA esquilada quitado deliberadamente los fragmentos más pequeño del ADN para enriquecer para los tamaños del fragmento más grande, más deseable. Estos pequeños fragmentos se observaron especialmente en muestras de TK463, TK657 y TK694, como se indica por una señal intensa en la marca de 100 pares (figura 1A).
La cantidad total de la selección de tamaño de mensaje de biblioteca oscilan entre 1.425 ng a 942.5 ng (tabla 2, suplemento tabla 1). Para 23 de las muestras, la preparación inicial de la extracción y la biblioteca no dió una cantidad adecuada de biblioteca (< 10 nM; Suplemento tabla 1 tabla 2), por lo que estas muestras se sometieron a las Reamplificación y recuperación los pasos del Protocolo, dando por resultado un 14 – 680 x aumento de biblioteca total (tabla 2, suplemento tabla 1). Bibliotecas finales dio lugar a una banda de entre 350 y 500 pares de bases (figura 1B, suplementales figura 2). A veces, se observó una segunda banda que era más grande que el tamaño esperado de la biblioteca (figura 1B, suplementales figura 2). Esto ocurrió cuando la Reamplificación PCR había agotado cartillas disponibles y comenzó recocido adaptadores biblioteca de fragmentos de ADN no homólogos. Esto crea una molécula donde los extremos (los adaptadores) fueron correctamente recocido, pero no el inserto de DNA. Esta molécula "burbujas" parecía más grande en un gel, como se movió más lentamente a través de la matriz de gel. Estos errores de recocido se fijaron preparando otra reacción de Reamplificación de la biblioteca ya reamplified y funcionando para un solo ciclo. Este ciclo solo proporciona cartillas para recocido correcto y amplificación, quitando la segunda banda (suplementario Figura 3).
Reamplificación de bibliotecas facilita concentraciones biblioteca final de menos de 10 nM. Estas concentraciones permitidas bibliotecas diluir igual molaridad y agrupados en una representación equitativa, ayudando a negar cuestiones que habrían surgido con la calidad de la muestra desigual y secuenciación de rendimiento de la biblioteca. Si el objetivo del proyecto es genoma de cloroplasto secuenciación, entonces la cantidad total de la secuencia necesaria variará como diversos linajes y tejidos difieren en el porcentaje total de Lee que se originan del cloroplasto DNA19. Por lo general, 50 – 100 x cobertura proyectada del genoma del cloroplasto es suficiente para el montaje, y ejecuta la secuencia puede combinarse para incluir a tantos como 70 personas según especies y el método de secuenciación.
Pruebas de contaminación, sesgo y variación causada por Reamplificación Una notable preocupación por secuenciación de HTS es introducción de sesgo en las bibliotecas a través de extensa de amplificación PCR20. Para probar los efectos de Reamplificación e identificar posibles aplicaciones en común phylogenetic sesgos de material de herbario, comparamos una biblioteca con éxito secuenciada (TK686) con la misma biblioteca diluido 1:5 y reamplificado (designado TK686-R). Tanto TK686 y TK686-R fueron ordenados en un Illumina HiSeq4000 en el centro de biotecnología de la Universidad de Illinois Roy J. Carver y la Michigan estado Universidad de tecnología de apoyo Centro de investigación, respectivamente, utilizando 150 pares emparejados final Lee (ver Tabla 3 para los detalles de la secuencia). Lee cruda ha sido depositada en la SRA NCBI (SRP128083). Lee fueron limpiada usando Trimmomatic v.0.3621 incluyendo ajuste del adaptador utilizando NEB adaptador secuencia, calidad de filtrado para una puntuación promedio phred de 20 para un par de base 10 ventana de desplazamiento, y un mínimo corte tamaño de 40 pares de bases. Como uno de los temas principales con ejemplares de herbario contaminación fúngica, la contaminación se estimó mediante la asignación de lecturas contra una porción del JGI MycoCosm hongos genoma base de datos22 (312 genoma nuclear y genoma mitocondrial 79) con bowtie2 v . 2.2.923 usando el parámetro "muy-sensible-local". Bibliotecas de TK686 y TK686-R eran indistinguibles en la contaminación de hongos nuclear (9.24% y 9,68%, respectivamente) y la contaminación fúngica mitocondrial (0.94% y 0,8%) (Tabla 3). Aunque esto es sólo un ejemplo, sugieren que la contaminación fúngica de muestras de herbario no es despreciable y debe quitarse antes de usar datos de la secuencia de origen herbario. La base de datos y comandos utilizados para identificar y eliminar la contaminación fúngica pueden encontrarse en el repositorio de GitHub de M. R. McKain herbario genómica24.
Secuenciación del genoma del cloroplasto es comúnmente utilizado para los análisis filogenéticos, y ejemplares de herbario se utilizan cada vez más como material de fuente12. Para probar la fidelidad de Reamplificación en la Asamblea del genoma de cloroplasto, genoma de cloroplasto para TK686 y TK686-R fueron ensamblada con rápido-Plast v.1.2.525 bajo por defecto con el índice de bowtie en Poales. Se obtuvo un genoma de cloroplasto completo para TK686-R, pero el genoma del cloroplasto TK686 fue montado en siete contigs debido a la menor profundidad de lectura. Los contigs de TK686 fueron montadas manualmente siguiendo McKain et al. 26 genomas completamente montado cloroplasto fueron alineados uno al otro en un software de alineación basadas en GUI (véase Tabla de materiales) y se evaluó la variación entre asambleas. Se identificó un total de 12 SNP y un indel entre las Asambleas de cloroplasto para TK686 y TK686-R. Para cada variante, se evaluó la cobertura en sistemas de lectura de TK686 y TK686-R. En todos los casos, la variante más común era el mismo entre las dos bibliotecas. TK686 demostró una T→C, una G→A, un G→T, uno G→-, una C→A, una T→A y cuatro variantes C→A. Cinco de estas variantes se produjo dentro de una cadena de homopolímero, lo que sugiere que su incorporación a la Asamblea pudo haber sido el resultado de error de secuencia y baja cobertura total. Los otros pueden haber sido el resultado de la variación de haplotipo de cloroplasto, error de la secuencia o desaminación de la citosina, o alguna combinación de estos factores. TK686-R tenía un C→T, una G→T y una A→G. Las variantes C→T y G→T fueron encontradas en un homopolímero como arriba. En última instancia, se identificaron genoma de cloroplasto completo idéntico de ambos conjuntos leerlas. Un genoma de cloroplasto único de TK686 fue anotado usando verde21 y Comparado con otros miembros de la tribu Andropogoneae. Todas las características estándar del cloroplasto fueron anotadas: 8 rRNAs y 38 tRNAs 84 genes de codificación de la proteína. El genoma del cloroplasto completo está disponible en GenBank (MF170217) y verdes27.
Posibles sesgos de la Reamplificación de las bibliotecas se determinan a través de la estimación del % GC y contenido total estimado transposon. Porcentaje GC se estimó mediante una secuencia de comandos personalizada24. Las diferencias en el contenido de GC de las dos muestras fueron insignificantes, con 49,7% GC en TK686 y 51.2% GC en TK686-R. Composición de Transposon se estimó mediante Transposome28. Para ambas bibliotecas, 100.000 lecturas fueron aleatoriamente subsampled composición transposon se estimó mediante una identidad por ciento de los 90, una cobertura de fracción de 0.55, un tamaño de cluster de 100 y la referencia repetida RepBase 21.10 hierba conjunto29. Esto fue repetido 100 veces para realizar arranque en estimación de transposon de estos conjuntos de datos. Porcentajes de genoma total de subfamilias principales de transposones se extrajeron de salida Transposome, y se calcularon la media y desviación estándar de éstos para las 100 repeticiones. Todos los scripts usados para generar estas salidas se pueden encontrar en el repositorio de Github de M. R. McKain transposones30, y todos los resultados han sido depositados en Dríade (doi:10.5061/dryad.r8t2m). Utilizando las dos subfamilias de transposones más prevalentes como indicadores (Copia y gitana terminal larga repetición de retrotransposones), los resultados fueron casi idénticos con Copia a 33,52 ± 4.00% y 31,68 ± 2.94% y gitana en 24.83 ± 2.72% y 24.00 ± 2,35% en TK686 y TK686-R, respectivamente (tabla 3). Estos resultados de las pruebas sugieren que el paso de Reamplificación del presente Protocolo no creó sesgo de secuencia significativa para métricas de alto nivel del genoma. Sin embargo, cabe señalar que este ejemplo solo puede no ser totalmente representativo de todas las bibliotecas reamplified. Esta prueba solo demuestra que el paso de Reamplificación no fue inherentemente de polarización métricas del genoma en TK686/TK686-R. Sesgo introducido no afectaría a la Asamblea de una dado suficiente cobertura de secuenciación del genoma de cloroplasto, pero es recomendable que, como se presenta en este estudio con TK686/TK686-R, son experimentos en linajes de destino para verificar que el sesgo no es que ocurre durante los estudios que investigan la diversidad de elementos transponibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig1.jpg"> Figura 1: imágenes de gel de agarosa del) de ADN y la secuencia B) final bibliotecas de diez ejemplares de herbario. Para cada carril, se usó 3 μl de ADN o una biblioteca. (A) ADN fue degradado en todos los aislamientos de herbario en el borrón de transferencia general. Bibliotecas de secuencia Final (B) representan un grupo primario de 300-500 pares de bases con una distribución más amplia de 200-1.000 pares de bases; Este último es más frecuente en bibliotecas reamplificadas. Carriles para ambos (A) y (B) se identificaron por la muestra y puede ser comparado con resultados en la tabla 2. Tamaño de la escalera fue representado en pares de bases (PB). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2.jpg"> Figura 2 : Parcela circular de Schizachyrium scoparium Genoma de cloroplasto (TK686) con anotación de. El genoma completamente ensamblado de secuencia de escopeta de la DNA derivados herbario exhibió una longitud total de 139.296 pares de bases (bp), una región de gran copia (LSC) de 81.401 bp, una región de repetición invertida (IR) de 22.669 bp y una región pequeña sola copia (SSC) de 12.557 BP. Se identificaron todos los genes de codificación de proteínas estándar, tRNAs y rRNAs para miembros de la tribu Andropogoneae en la anotación. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 2: Resultados de preparación de DNA extracción y biblioteca diez muestras de herbario y cuatro bibliotecas reamplificadas. El total doble trenzado DNA en varios pasos en el protocolo puede ser demostrada calidad como variable, especialmente cuando filtra por tamaño. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: estadísticas de secuenciación para el TK686 y el TK686R reamplified. Reamplificación no afecta la incidencia global de contaminación micótica genoma, estimación de contenido de GC, estimación de composición de transposon o la capacidad para ensamblar genomas enteros cloroplasto. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table3_Sequencing_Statistics_TK686.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Suplemento tabla 1: resultados de ADN extracción y biblioteca de preparación de cuarenta muestras de herbario adicionales, incluyendo veinte bibliotecas reamplificadas. Total doble trenzado DNA en varios pasos en el protocolo puede ser demostrada calidad como variable, especialmente cuando filtra por tamaño. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Table1_Data.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Suplementario Figura 1: imágenes de gel de agarosa de cuarenta aislamientos adicionales de ADN de ejemplares de herbario. Ambos (A) y (B) representar veinte aislamientos separados de ADN y demostrar la degradación característica de la DNA derivados herbario. Para cada carril, 3 μl de ADN se utilizó. Carriles para ambos (A) y (B) se identificaron por la muestra y puede ser comparado con resultados en la tabla adicional 1. Tamaño de la escalera se representa en pares de bases (PB). Blanco manchas en la imagen se deben a artefactos en el reproductor de imágenes de gel que no se pudo quitar con la limpieza. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure1_DNA_Isolation.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario Figura 2: imágenes de gel de agarosa de cuarenta bibliotecas de adicional de la secuencia de la DNA derivados herbario. Para cada carril, 3 μl de biblioteca fue utilizado. Bibliotecas de la secuencia final se encuentran en ambos (A) y (B) con un tamaño promedio de 300-500 pares de bases. Bandas secundarias en algunas muestras amplificadas sugieren "burbujas" de las bibliotecas. Carriles para ambos (A) y (B) se identifican por la muestra y puede ser comparado con resultados en la tabla adicional 1. Tamaño de la escalera se representa en pares de bases (PB). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Figure_2_Library_Prep.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario Figura 3: imagen de gel de agarosa del retiro de la banda secundaria con un paso de la polimerización en cadena de ciclo único adicional. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure3_Single_Cycle_Clean.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

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Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Este artículo muestra un protocolo detallado para el aislamiento de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de material de herbario incluyendo rescate del ADN de muy mala calidad.

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K vistas.  Donald Danforth Plant Science Center. Este artículo muestra un protocolo detallado para el aislamiento de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de material de herbario incluyendo rescate del ADN de muy mala calidad.

Video: Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Investigación

Genética

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...