Wir danken Taylor AuBuchon-Holunder, Jordan Teisher und Kristina Zudock um Hilfe bei der Probenahme Herbar und Missouri Botanical Garden Zugang zum Herbar für destruktive Probenahme. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (DEB-1457748).

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Die hier vorgestellten Protokoll ist eine umfassende und solide Methode zur DNA-Isolierung und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von getrockneten Pflanzen. Die Konsistenz des Verfahrens und des minimalen Notwendigkeit, es zu ändern basierend auf Probe Qualität machen es skalierbar für große Herbarium-basierte Sequenzierung Projekte. Die Einbeziehung eines optionalen Reamplification Schritts für geringe Ausbeute Bibliotheken ermöglicht die Aufnahme von geringer Qualität, geringe Menge, selten, oder historisch wichtigen Proben, die sonst nicht geeignet für die Sequenzierung.
Bedeutung der ersten DNA-Ertrag Herbarium-abgeleitete DNA wird oft als Folge der ersten Probe Erhaltung11mit DNA-Proben weniger als 300 Jahre alte abgebaut als abgebaut als DNA isoliert von Tierresten, die mehrere hundert bis tausend Jahre alt31 , 32. Optimierung der ersten DNA-Ertrag deshalb wichtig genug qualitativ hochwertige DsDNA für erfolgreiche Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung zu erhalten. Für Grasarten ein optimaler Ertrag wird erreicht durch den kombinierten Einsatz von sterilisierten Sand und flüssiger Stickstoff in das erste Schleifen Schritt, für eine tiefer gehende Zerstörung der Zellwände und Freisetzung von Nukleinsäuren. Diese Vorgehensweise erhöht wünschenswert größere DsDNA und unerwünschte kleinere Fragmente (Abbildung 1, ergänzende Abbildung1, Tabelle 2, zusätzliche Tabelle1). Nachfolgende Wulst Reinigungsschritte isolieren und bereichern für Fragmente einer Größe für Sequenzierung (300 – 500 Basenpaare), stark reduziert Erholung aber auch bereichernd für längere Fragmente (Tabelle 2, zusätzliche Tabelle1). Änderungen an den ersten Schritten der DNA-Isolierung kann basierend auf der Linie wird abgetastet, um die Auswirkungen von Sekundärmetaboliten auf downstream-Processing18reduzieren notwendig.
Optimierung der Bibliothek-Adapter Die Konzentration von Adaptern zur Unterbindung hat einen direkten Einfluss auf die Höhe der Adapter Dimer in fertige Bibliotheken. Adapter Dimere vom Adapter selbst Ligatur führen, wenn nicht genügend Probe vorhanden ist und Sequenzierung läuft33verunreinigen. Die relativ niedrigen total DsDNA Herbarbelege ab erfordert Verdünnung der Adapter vor der Ligatur. Adapter können 50-fach verdünnt werden aus dem Lager Konzentration von 15 µM (siehe Protokoll) Erleichterung Hochdurchsatz-Bibliothek-Vorbereitung ohne die Notwendigkeit, einzeln messen und verdünnen Sie Adapter für jede Probe (Tabelle 2, zusätzliche Tabelle 1). Obwohl Sättigung der Adapter im Prinzip allgemeine Bibliothek Ertrag verringern könnte, ist es unwahrscheinlich, dass Herbar DsDNA in dieser Überschuss des Adapters erbringt.
Variation in Perle Reinigungsschritte für höhere Erträge Größenauswahl bei Vorbereitung der Sequenzierung Bibliotheken erfolgt in der Regel nach Adapter Ligation, Verstärkung der Fragmente in erster Linie im Bereich gewünschte Größe ermöglicht; Dies geschieht durch Entfernen von Fragmenten, die sowohl größer als auch kleiner als die Zielgröße sind. Die geringe Menge an Herbarium abgeleitet DsDNA Vorbereitung Bibliothek wird nach Größenauswahl bei diesem Schritt, was zu unworkably niedrigen total DsDNA verschärft und letztlich geringe Ausbeute in der endgültigen Bibliothek. Durch die Durchführung eines standard Wulst-Reinigung Schritt mit 90 % Volumen Perlen nach Ligation, bleibt mehr total DsDNA Bereicherung in der Verstärkung Schritt. Extrem kleine DNA-Fragmente werden bevorzugt mit 90 % Volumen Perlen entfernt. Größenauswahl erfolgt im letzten Schritt auf der verstärkten Bibliothek, die Bereicherung der gewünschte Fragment Größen gewährleistet. Gesamtmengen von Perlen können eingestellt werden, um den gewünschten Bereich auszuwählen, obwohl die zweistufigen Mengen 25 µL und 6 µL Perlen, zum Abrufen von Bibliotheken von 400-500 Basenpaaren Einsätze innerhalb dieses Protokoll (optimiert sindAbbildung 1 b, ergänzende Abbildung2).
Probe-Rettung durch Reamplification der Bibliotheken Endkonzentrationen der Sequenzierung Bibliotheken können trotz best Practices in DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung für weitere Sequenzierung nicht ausreichend sein. Der zerstörerische Charakter der Probenahme und oft begrenzten Verbrauchsmaterial von Herbar erlaubt nicht immer wiederholenden DNA-Isolierung. Von der Bibliothek bis zu reamplifying können 12 zusätzliche PCR-Zyklen auch außergewöhnlich schlechte Bibliotheken gespeichert werden. Ein standard Primerpaar dient zur Verstärkung, die mit entweder doppelte oder einzelne indizierte Bibliothek-Protokollen kompatibel ist. Ein Hauptanliegen für Reamplification ist die Einführung von Bias, oft durch Reduzierung der GC-reiche Abschnitte des Genoms20. Durch die Verwendung einer High Fidelity Polymerase (siehe Tabelle der Materialien), diese mögliche Vorurteile sind potenziell vermieden. Dies wird durch die minimale Variation der GC-Gehalt der sequenzierten Bibliotheken TK686 und TK686-R (Tabelle 3) gezeigt. Als eine zweite Überprüfung war der Transposon-Inhalt der TK686 und TK686-R geschätzt und zeigte keine erkennbaren Unterschiede (Tabelle 3). Schließlich wurde das ganze Chloroplast Genom dieses Beitritts zusammengestellt, von TK686 und TK686-R, die identische Sequenzen nach näherer Betrachtung der SNP Variation zwischen den beiden Versammlungen (Abbildung 2, Tabelle 3) geführt. Diese Tests deuten darauf hin, dass standard-genomischen Metriken, wie z. B. GC-Gehalt und Transposon-Zusammensetzung und die Fähigkeit zu montieren komplette Chloroplasten Genome, nicht durch Reamplification beeinträchtigt werden. Dies eröffnet die Möglichkeit der Einbeziehung Herbarium dachte Exemplare auch abgebaut werden oder fehlt es an Material in Phylogenomic Studien ohne Rücksicht auf eingeführten Bias durch PCR. Diese reamplified Bibliotheken könnten auch für Sequenz Capture34, verwendet werden, obwohl es wäre notwendig, um zu testen ob SNP Berufung voreingenommen ist. Es wird empfohlen, dass kleinere Tests der Voreingenommenheit durchgeführt werden, mit jedem Projekt um sicherzustellen, dass Vorurteile nicht in Sequenzierung Bibliotheken eingeführt wird.
Einschränkungen und mögliche Änderungen Obwohl dieses Protokoll gearbeitet hat können Hunderte von Herbar, schlecht erhaltenen Gewebe noch bei jedem Schritt fehlschlagen. Es ist jedoch äußerst selten vor, dass Bibliotheken aus Geweben mit erfolgreichen DNA Extraktionen, vor allem nach Bibliothek Rettung durch Reamplification fehlschlagen. Die Größe Auswahl Schritte können auf verschiedene große Fragmente oder reduzieren Sie die breite Palette von Fragmenten gesehen in einigen abschließenden Bibliotheken geändert werden. Wie bei allen pflanzlichen Gewinnung Protokollen Schritte erforderlich sein, um Geschlecht-spezifische sekundäre Verbindungen zu entfernen, die das gesamte Protokoll behindern können. Wie dargestellt, dieses Protokoll bietet eine Standardmethode für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Bibliothek Vorbereitung für Rasen Herbar und durch Überprüfung und Erprobung wird voraussichtlich amendable zu anderen pflanzlichen Linien.

Herbarium Sammlungen sind potentiell wertvolle Arten und genomische Diversität für Studien einschließlich Phylogenetik1,2,3, Populationsgenetik4,5, Erhaltung Biologie6, invasive Arten Biologie7und Merkmal Evolution8. Die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Arten, Populationen, geografische Orte und Zeitpunkte zu erhalten unterstreicht die "Schatztruhe"9 , die das Herbarium. Historisch, hat degradierten Artder Herbarium abgeleitet DNA PCR-basierten Projekten, oft verwies Forscher mittels nur Marker gefunden in hohe Kopie, wie Regionen von Chloroplast Genom oder die interne transkribierten Distanzstück (ITS) aus der ribosomalen behindert. RNA. Qualität der Proben und DNA variieren ausgiebig basierend auf Methoden der Konservierung9,10, mit Doppelstrang-Brüche und Fragmentierung von Wärme in der Trocknung werden die häufigsten Formen von Schäden, die Schaffung der so genannte 90 % DNA Überbrückungskupplung, die PCR-basierten Studien11belastet hat. Abgesehen von Fragmentierung ist das zweithäufigste Problem im Herbarium Genomics Verunreinigungen, wie z. B. die endophytische Pilze13 abgeleitet oder Pilze Obduktion erworben nach Sammlung aber vor dem Einbau in das Herbarium12, obwohl dieses Problem kann gelöst Bioinformatically rechts Pilze Datenbank (s.u.) gegeben werden. Eine dritte, und weniger üblich, Problem ist Sequenz Modifikation durch Cytosin Deamination (C/G→T/A)14, obwohl es wird geschätzt (~ 0,03 %) niedrig sein Herbarium Exemplare11. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) kann das Problem der Fragmentierung mit kurzen Lese- und Sequenzierung Tiefe12,15, so dass Genomebene Datenerfassung aus zahlreichen Proben mit niedriger Qualität überwunden werden DNA, und manchmal sogar ganze Genom-Sequenzierung15erlaubt.
Herbarium Proben werden immer häufiger verwendet und sind ein größerer Bestandteil der phylogenetische Projekte16. Eine aktuelle Herausforderung für HTS Herbar zu verwenden ist konsequent ausreichend Doppel stranded DNA, eine notwendige Voraussetzung für die Sequenzierung Protokolle, von zahlreichen Tierarten in einer fristgerechten Weise erhalten ohne Methoden zur individuellen Optimierung Proben. In diesem Papier wird ein Protokoll für die DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung der Herbarbelege demonstriert, nutzt die vorhandenen Methoden und ändert sie, um schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht für die Komplettbearbeitung von Probe zu einer Bibliothek von 24 Proben in 13 h, mit Hands-on-Zeit 8 h oder 16 h, mit 9 h Arbeitsaufwand beträgt, wenn der optionale Reamplification-Schritt benötigt wird. Gleichzeitige Verarbeitung von mehr Proben ist erreichbar, wenn der limitierende Faktor Zentrifuge Kapazität und technisches Geschick. Das Protokoll soll nur typische Laborgeräte (Thermocycler, Zentrifuge und magnetische steht) anstelle von Spezialausrüstung, wie z. B. einen Vernebler oder Sonikator, für Scheren DNA benötigen.
DNA-Qualität, Fragmentgröße und Menge sind Faktoren für den Einsatz von Herbar im Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimente begrenzt. Weitere Methoden zum Herbarium DNA zu isolieren und Erstellen von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken haben gezeigt, das Dienstprogramm zu verwenden so wenig wie 10 ng DNA-16; jedoch bedürfen experimentell ermitteln die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dies wird unpraktisch, beim Umgang mit äußerst geringen Mengen an lebensfähigen Doppel DNA (DsDNA), gestrandet, da einige Herbar nur genügend DNA für eine einzelne Bibliothek Zubereitung produzieren. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine einzelne Zahl der Zyklen unabhängig von Sample-Qualität, so dass keine DNA Bibliothek Optimierungsschritte verloren geht. Stattdessen wird ein Reamplification Schritt aufgerufen, wenn Bibliotheken nicht die Mindestbeträge für die Sequenzierung erforderlich erfüllen. Viele Herbarium Proben sind selten und besitzen wenig Material macht es schwierig, destruktive Probenahme in vielen Fällen zu rechtfertigen. Um dem entgegenzuwirken, die vorgestellte Protokoll ermöglicht DsDNA Eingang Größen von weniger als 1,25 ng in der Bibliothek Vorbereitungsprozess, Erweiterung des lebensfähigen Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Notwendigkeit einer destruktiven Entnahme von Proben zu minimieren.
Das folgende Protokoll wurde optimiert für Gräser und getestet auf Hunderte verschiedener Arten von Herbarium Proben, obwohl wir erwarten, dass das Protokoll auf viele andere Pflanzengruppen angewendet werden kann. Freuen Sie sich auf eine optionale Wiederherstellungsschritt, die verwendet werden, um niedrige Qualität und/oder seltene Exemplare zu speichern. Basierend auf mehr als zweihundert Herbar getestet, funktioniert dieses Protokoll auf Proben mit niedrigen Gewebe ein- und Qualität, so dass für die Erhaltung der seltene Exemplare durch minimale destruktive Probenahme. Hier wird gezeigt, dass dieses Protokoll hochwertige Bibliotheken bieten kann, die für Datenqualität-basierte Projekte sequenziert werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">4452300</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:180px;">Azure Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">c300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microfuge 20 Series</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">B30137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Digital Dry Bath</td>
			<td style="width:180px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:104px;">BSH1001</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:180px;">EasyCast</td>
			<td style="width:104px;">B2</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td>
			<td style="width:180px;">ELGA&#160;</td>
			<td style="width:104px;">89204-092</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DNA LoBind Tube&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td style="width:147px;">2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mini centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-006-901</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-812</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mortar</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02591</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pestle</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02595</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">21-403-161</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microwave</td>
			<td style="width:180px;">Kenmore</td>
			<td style="width:104px;">405.7309231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">20170-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32866</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Balance</td>
			<td style="width:180px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:104px;">PM2000</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen Short-term Storage</td>
			<td style="width:180px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">F9401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Magnetic-Ring Stand&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">AM10050</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Water Bath</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">89032-210</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hot Plate Stirrers</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">97042-754</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:180px;">Airgas</td>
			<td style="width:104px;">UN1977</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1 X TE Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Ambion</td>
			<td style="width:104px;">AM9849</td>
			<td style="width:147px;">pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CTAB</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0833-500G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2-MERCAPTOETHANOL</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0482-200ML</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ribonuclease A</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">E866-5ML</td>
			<td style="width:147px;">10 mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63882</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">705744</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">40970004-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nuclease Free water</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">42300012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">A393-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">s608-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:180px;">GeneMate</td>
			<td style="width:104px;">E-3120-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">100bp PLUS DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:104px;">D003-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, Disodium Salt</td>
			<td style="width:180px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:104px;">IB70182</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">TRIS</td>
			<td style="width:180px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:104px;">103133</td>
			<td style="width:147px;">ultra pure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Loading Dye Purple (6 X)</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">B7024S</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0348L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&#160;</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7645L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7600S</td>
			<td style="width:147px;">Dual Index Primers Set 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0543L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mag-Bind RXNPure Plus</td>
			<td style="width:180px;">Omega bio-tek</td>
			<td style="width:104px;">M1386-02</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">GelRed 10000 X</td>
			<td style="width:180px;">Pheonix Research</td>
			<td style="width:104px;">41003-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:104px;">P4557-400ml</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVP40</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">PVP40-50G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Chloroform</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">EM8.22265.2500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ethanol</td>
			<td style="width:180px;">Koptec</td>
			<td style="width:104px;">V1016</td>
			<td style="width:147px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silica sand</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">14808-60-7</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reamplification primers</td>
			<td colspan="2">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>see text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sequencher v.5.0.1</td>
			<td style="width:180px;">GeneCodes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

Herbarien sind eine unschätzbare Quelle von pflanzlichem Material, das in einer Vielzahl von biologischen Studien verwendet werden kann. Die Verwendung von Herbar ist verbunden mit einer Reihe von Herausforderungen einschließlich Probenqualität Erhaltung geschädigter DNA und destruktive Probenahme seltene Exemplare. Um effektiver Herbarium Material in großen Sequenzierung Projekten verwenden, ist eine zuverlässige und skalierbare Methode der DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dieses Papier zeigt eine robuste, Anfang-Ende Protokoll für DNA-Isolierung und hohem Durchsatz Bibliotheksbau von Herbar, die keine Änderung für Einzelproben erfordert. Dieses Protokoll ist für niedrige Qualität getrocknet Pflanze Material und nutzt vorhandene Methoden durch die Optimierung der Gewebe Schleifen, ändern Bibliothek Größenauswahl und die Einführung eines optionalen Reamplification Schritt für geringe Ausbeute Bibliotheken zugeschnitten. Reamplification von geringer Ausbeute DNA-Bibliotheken kann Proben abgeleitet von unersetzlichen und potenziell wertvollen Herbar, negiert die Notwendigkeit für zusätzliche destruktive Probenahme und ohne erkennbare Sequenzierung Voreingenommenheit für gemeinsame retten. phylogenetische Anwendungen. Das Protokoll ist auf Hunderten von Grasart geprüft worden, aber wird voraussichtlich nach Prüfung für den Einsatz in anderen pflanzlichen Linien angepasst werden. Dieses Protokoll kann durch extrem geschädigter DNA, wo Fragmente nicht in der gewünschten Größenordnung vorhanden sind, und sekundäre Pflanzenstoffe in einigen Pflanzenmaterial vorhanden, die saubere DNA-Isolierung hemmen begrenzt. Dieses Protokoll stellt insgesamt eine schnelle und umfassende Methode, die DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung von 24 Proben in weniger als 13 Stunden mit nur 8 h aktive Handhabungszeit mit minimalen Anpassungen ermöglicht.

DNA-Isolierung und endgültige Bibliothek Ertrag In dieser Studie wurde die Wirksamkeit des Protokolls für die Isolierung von Herbarium DNA und die Verwertung von hochwertigen Sequenzierung Bibliotheken nachgewiesen mit fünfzig verschiedenen Proben mit das älteste aus dem Jahre 1920 und der jüngste ab 2012 (Tabelle 2). Für jede Probe wurde etwa 10 mg Blattgewebe für DNA-Isolierung verwendet. Grüner Blattgewebe wurde bevorzugt, falls verfügbar, und kein Gewebe mit offensichtlichen Pilzbefall wurde ausgewählt. Erfolgreiche Isolationen können erfolgen mit gelben oder braunen Gewebe, obwohl der Ertrag sollte voraussichtlich niedriger sein. Insgesamt doppelte stranded DNA (DsDNA) aus der anfänglichen Isolation reichten von 3,56 ng zu 2.610 ng. Wie erwartet, wurde DNA gewonnenen Herbar stark abgebaut (Abbildung 1A, Supplemental Abbildung 1). Ein Teil dieser Isolationen dienten für enzymatische Scheren (1,26 – 464 ng). Obwohl Herbarium DNA bereits durch den Prozess der Erhaltung geschert, erfordert Optimierung des Protokolls zusätzliche Scheren um allgemeine Bibliothek Ertrag zu verbessern. Die gesamte Heilung der DsDNA nach dem Scheren reichten von < 1 bis 51 % der Eingabe DsDNA, wodurch ein Minimum von weniger als 1,25 ng DNA Bibliothek Vorbereitung und maximal 328 ab ng. Der extreme Verlust der DNA in einigen Proben kann die ohnehin schon geringe Fragmentgröße für einen Großteil der DNA vor der enzymatischen Schur (Abbildung 1A, ergänzende Abbildung1) zugeschrieben werden. Die Verwendung von einer 90 % des Volumens Wulst Bereinigung auf der DNA geschoren entfernt absichtlich die kleinsten Fragmente von DNA, für größere, wünschenswerter Fragment Größen zu bereichern. Diese kleinen Fragmente wurden vor allem in Proben, TK463, TK657 und TK694, gesehen, wie durch ein intensives Signal bei 100 Basenpaaren (Abbildung 1A) bezeichnet.
Die Gesamtmenge der Bibliothek Post Größenauswahl reichte von 1,425 ng zu 942.5 ng (Tabelle 2, zusätzliche Tabelle1). Für 23 der Proben, die Extraktion und Bibliothek Vorbereitung keine ausreichende Menge an Bibliothek Ausbeute (< 10 nM; Zusätzliche Tabelle1 Tabelle 2), also diese Proben unterzogen wurden die Schritte Reamplification und Wiederherstellung des Protokolls, wodurch in einem 14-680 X Erhöhung der gesamten Bibliothek (Tabelle 2, zusätzliche Tabelle1). Endgültige Bibliotheken führte ein Band zwischen 350 und 500 Basenpaaren (Abbildung 1 b, Supplemental Abbildung 2). Zeitweise wurde eine zweite Band, die größer als die erwarteten Bibliothek wurde gesehen (Abbildung 1 b, Supplemental Abbildung 2). Dies geschah als die Reamplification PCR zur Verfügung Primer erschöpft und begann Glühen Bibliothek Adapter nicht homologe DNA-Fragmente. Dadurch entsteht ein Molekül, wo die Enden (Adapter) waren richtig glühen, aber die DNA einfügen nicht. Dieses "sprudelte" Molekül erschien auf ein Gel, größer als es langsamer durch die Gelmatrix bewegt. Diese Glühen Fehler wurden behoben, durch die Vorbereitung einer anderen Reamplification Reaktion aus der bereits reamplified Bibliothek und läuft es für einen einzigen Zyklus. Diese Einzelzyklus Primer vorgesehenen richtigen Glühen und Verstärkung, entfernen das zweiten Band (ergänzende Abbildung 3).
Reamplification der Bibliotheken erleichtert letzte Bibliothek Konzentrationen von mindestens 10 nM. Diese Konzentrationen Bibliotheken verdünnt werden, um gleiche Molarity und gebündelt in paritätisch, helfen, Probleme negieren, die mit ungleichen Probenqualität ergeben hätten und Sequenzierung Bibliothek Ausbeute erlaubt. Wenn das Ziel eines Projekts Chloroplast Genom Sequenzierung, dann der Gesamtbetrag der Sequenzierung erforderlich als verschiedene Übertragungslinien variiert und Gewebe unterscheiden sich in der Prozent der Gesamtzahl der Lesevorgänge, die ihren Ursprung in Chloroplast DNA-19. In der Regel 50 – 100 x projizierte Berichterstattung über das Chloroplast Genom ist ausreichend für die Montage und Sequenzierung läuft können um bis zu 70 Personen je nach Spezies und Sequenzierung Methode gehören gebündelt werden.
Tests für Verunreinigungen, Bias und Variation, die durch Reamplification verursacht Eine bemerkenswerte Sorge für HTS-Sequenzierung ist Einführung der Voreingenommenheit in Bibliotheken durch umfangreiche PCR Verstärkung20. Testen Sie die Auswirkungen von Reamplification und Bias gemeinsam phylogenetische Anwendungsmöglichkeiten der Herbarium Material zu identifizieren, haben wir eine erfolgreich sequenzierte Bibliothek (TK686) mit der gleichen Bibliothek verdünnt 1:5 und Professor (benannten TK686-R) verglichen. Beide TK686 und TK686-R wurden jeweils auf eine Illumina HiSeq4000 an der University of Illinois Roy J. Carver biotechnologischen Zentrum und der Michigan State University Forschung Technologie Support Facility, sequenziert, mit 150 Basenpaare gekoppelten Ende liest (siehe Tabelle 3 Einzelheiten Sequenzierung). Rohe liest wurden in der NCBI SRA (SRP128083) hinterlegt. Lesevorgänge wurden gereinigt, mit Trimmomatic v.0.3621 einschließlich Adapter Trimmen mit NEB Adapter Sequenz, Qualität für eine durchschnittliche Phred Score von 20 für eine 10 Basenpaare Schiebefenster, Filterung und ein Minimum abgeschnitten Größe 40 Basenpaare. Als eines der Hauptprobleme mit Herbar Pilzbefall, schätzte Kontamination durch die Zuordnung liest gegen einen Teil des JGI MycoCosm pilzartige Genom Datenbank22 (312 nuklearen Genomen und 79 mitochondrische Genome) mit bowtie2 v . 2.2.923 mit der "sehr empfindlich-lokal" Parametersatz. TK686 und TK686-R Bibliotheken waren ununterscheidbar in nuklearen Pilzbefall (9,24 % und 9,68 %, beziehungsweise) und mitochondriale Pilzbefall (0,94 % und 0,8 %) (Tabelle 3). Obwohl dies nur ein Beispiel, legt es nahe, dass Pilzbefall Herbarium Proben ist nicht zu vernachlässigen und sollte vor der Verwendung Herbarium abgeleitet Sequenzdaten entfernt werden. In M. R. McKain GitHub Repository Herbarium Genomics24finden die Datenbank und Befehle zur Identifizierung und Entfernung von Pilzbefall.
Chloroplast Genom-Sequenzierung wird häufig verwendet für phylogenetische Analysen und Herbar werden zunehmend als Quelle Material12verwendet. Um die Treue des Reamplification in der Chloroplasten-Genom-Baugruppe zu testen, wurden Chloroplasten Genome für TK686 und TK686-R montiert mit schnell-Plast v.1.2.525 bei Standardeinstellungen mit der Fliege-Index auf Poales festgelegt. Eine vollständige Chloroplast Genom wurde für TK686-R, aber TK686 Chloroplast Genom wurde in sieben Contigs aufgrund niedriger lesen Sie Tiefe montiert. Die TK686 Contigs wurden montiert, manuell nach McKain Et al. 26 komplett montierte Chloroplast Genom wurden aufeinander abgestimmt in einem GUI-basierten Alignment-Software (siehe Tabelle der Materialien) und Unterschiede zwischen den Baugruppen wurde bewertet. Insgesamt 12 SNPs und eine Indel wurden zwischen Chloroplasten Baugruppen für TK686 und TK686-R. Für jede Variante wurde Abdeckung lesen Sie Sets von TK686 und TK686-r bewertet In allen Fällen war die häufigste Variante das gleiche zwischen den beiden Bibliotheken. TK686 zeigte eine T→C, ein G→A, ein G→T, ein G→-, eine C→A, eine T→A und vier C→A Varianten. Fünf dieser Varianten ereignete sich in einem Homopolymer String, was darauf hindeutet, dass ihre Eingliederung in die Baugruppe durch Sequenzierung Fehler und niedrige allgemeine Abdeckung gewesen sein mag. Der andere können das Ergebnis der Chloroplasten Haplotyp Variation, Sequenzierung Fehler oder Cytosin Deamination oder eine Kombination dieser Faktoren gewesen sein. TK686-R hatte ein C→T, ein G→T und ein A→G. Die Varianten C→T und G→T fanden in einem Homopolymer wie oben beschrieben. Letztlich wurden identische komplette Chloroplasten Genome von lesen Sie beide identifiziert. Eine einzelnes Chloroplast Genom von TK686 wurde kommentiert, mit grünen21 und im Vergleich zu anderen Mitgliedern des Stammes Andropogoneae. Alle Features der standard Chloroplasten wurden kommentiert: 8 rRNAs und tRNAs 38 84 Protein kodierenden Gene. Das komplette Chloroplast Genom ist GenBank (MF170217) und grünen27ab.
Potenzielle Verzerrung aus den Reamplification der Bibliotheken wurde auch durch Schätzung der Prozent GC und insgesamt geschätzte Transposon Inhalt ermittelt. Mit einem benutzerdefinierten Skript24Prozent GC schätzte. Unterschiede in der GC-Gehalt der beiden Proben waren vernachlässigbar, mit 49,7 % GC in TK686 und 51,2 % GC in TK686-R. Transposon Zusammensetzung wurde anhand der Transposome28geschätzt. Für beide Bibliotheken Transposon Zusammensetzung wurde mit einem Prozent Identität von 90, ein Bruchteil Abdeckung von 0,55, eine Cluster-Größe von 100 geschätzt 100.000 mal gelesen wurden nach dem Zufallsprinzip subsampled und die RepBase 21.10. Rasen wiederholte Verweis festlegen29. Dies wurde 100 Mal wiederholt, bootstrapping auf Transposon Schätzung von dieser Datensätze durchführen. Gesamten Genom Prozentsätze für großen Unterfamilien der Transposons wurden aus Transposome Ausgabe gewonnen, und der Mittelwert und die Standardabweichung dieser für die 100 Wiederholungen wurden geschätzt. Alle Skripte zur Erzeugung von diesen Ausgängen finden Sie im M. R. McKain Github Repository Transposons30, und alle Ergebnisse in Dryad (doi:10.5061/dryad.r8t2m) hinterlegt worden. Mit den zwei am weitesten verbreiteten Transposon Unterfamilien als Indikatoren (Copia und Gypsy long Terminal repeat Retrotransposons), waren die Ergebnisse fast identisch mit Copia 33,52 ± 4,00 % und 31,68 ± 2,94 % Zigeuner an 24.83 ± 2,72 bis 24.00 ± 2,35 % in TK686 und TK686-R, bzw. (Tabelle 3). Diese Testergebnisse deuten darauf hin, dass der Reamplification Schritt dieses Protokolls keine sinnvolle Sequenzierung Voreingenommenheit für hochrangige Genom Metriken erstellt haben. Allerdings ist anzumerken, dass dieses Beispiel möglicherweise nicht vollständig repräsentativ für alle reamplified Bibliotheken. Diese einzelnen Test zeigt, dass der Reamplification Schritt nicht von Natur aus Genom Metriken in TK686/TK686-R. Vorspannen war Eingeführten Bias würde keinen Einfluss auf die Versammlung ein Chloroplast Genom ausreichende Deckung der Sequenzierung gegeben, aber es wird empfohlen, dass, wie in dieser Studie mit TK686/TK686-R, präsentiert auf Ziel Linien Experimente sind zu überprüfen, dass Vorurteile nicht Während Studien untersuchen übertragbar Element Vielfalt auftreten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig1.jpg"> Abbildung 1: Agarose-Gel-Bilder von A) DNA-Isolierung und (B) endgültige Sequenzierung Bibliotheken aus zehn Herbar. Für jede Fahrspur wurde 3 µL DNA oder Bibliothek benutzt. (A) DNA wurde in allen Herbarium Isolationen abgebaut, wie durch die allgemeine Abstrich zu sehen. (B) endgültige Sequenzierung Bibliotheken zeigen eine primäre Band von 300-500 Basenpaaren mit einer breiteren Verteilung der 200-1.000 Basenpaare; Letzteres ist häufiger bei Professor Bibliotheken. Fahrspuren für beide (A) und (B) wurden durch Probe identifiziert und Ergebnisse in Tabelle 2verglichen werden können. Leiter-Größe wurde in Basenpaaren (bp) dargestellt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2.jpg"> Abbildung 2 : Kreisförmige Grundstück von Schizachyrium scoparium (TK686) Chloroplast Genom mit Annotations. Das fertig montierte Genom von Schrotflinte Sequenzierung der DNA Herbarium abgeleitet ausgestellt eine Gesamtlänge von 139.296 Basenpaare (bp), einer großen Einzelkopie Region (LSC) der 81.401 bp, ein umgekehrtes Wiederholbereich (IR) der 22.669 bp und ein kleines Exemplar Region (SSC) der 12.557 BP. In der Anmerkung wurden alle standard Protein-kodierenden Gene, tRNAs und rRNAs für Mitglieder des Stammes Andropogoneae identifiziert. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Tabelle 2: DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung Ergebnisse für zehn Herbarium Proben und vier Professor Bibliotheken. Die total Doppel stranded DNA an verschiedenen Schritte im Protokoll nachgewiesener wie unterschiedlicher Qualität sein kann, vor allem, wenn für Größe gefiltert. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table%202.xlsx" target="_blank">Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Sequenzierung Statistiken für TK686 und reamplified TK686R. Reamplification hat keinen Einfluss auf die Gesamtinzidenz von pilzartige Genom Kontamination, GC Content Schätzung, Transposon Zusammensetzung Schätzung oder die Möglichkeit, ganze Chloroplasten Genome zu montieren. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table3_Sequencing_Statistics_TK686.xlsx" target="_blank">Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Zusätzliche Tabelle1: DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung Ergebnisse für 40 zusätzliche Herbarium Proben, darunter zwanzig Professor Bibliotheken. Total Doppel stranded DNA an verschiedenen Schritte im Protokoll nachgewiesener wie unterschiedlicher Qualität sein kann, vor allem, wenn für Größe gefiltert. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Table1_Data.xlsx" target="_blank">Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung1: Agarose-Gel-Bilder von vierzig weitere DNA-Isolationen von Herbar. (A) und (B) zeigen zwanzig eigene DNA-Isolationen und zeigen die charakteristischen Verschlechterung der DNA Herbarium abgeleitet. Für jede Fahrspur wurde 3 µL DNA verwendet. Fahrspuren für beide (A) und (B) wurden durch Probe identifiziert und in ergänzenden Tabelle1zu Ergebnissen verglichen werden können. Leiter-Größe wird in Basenpaaren (bp) dargestellt. Weiße Flecken auf dem Bild sind durch Artefakte in der Gel-Imager, die mit der Reinigung nicht entfernt werden konnte. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure1_DNA_Isolation.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung2: Agarose-Gelbilder von vierzig weitere Sequenzierung Bibliotheken aus Herbarium abgeleitet DNA. Für jede Fahrspur wurde 3 µL der Bibliothek verwendet. Endgültige Sequenzierung Bibliotheken befinden sich in (A) und (B) mit einer durchschnittlichen Größe von 300-500 Basenpaaren. Sekundäre Bands gesehen in einigen verstärkten Proben vorschlagen "bubbling" von Bibliotheken. Fahrspuren für beide (A) und (B) werden durch Probe identifiziert und können im Vergleich zu Ergebnissen in ergänzenden Tabelle1. Leiter-Größe wird in Basenpaaren (bp) dargestellt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Figure_2_Library_Prep.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Agarose-Gelbild der sekundären Band Entfernung mit einer zusätzlichen Einzelzyklus PCR Schritt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure3_Single_Cycle_Clean.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>

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Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Aufrufe.  Donald Danforth Plant Science Center. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.

Serie: Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...