Este trabalho foi apoiado por grant GM117446 NIH de A.B.

1. preparação de células para Flow Cytometry classificação
<ol><li>Inocular tubos de ensaio de 15 mL contendo 8 mL de caldo YEPD tal que as culturas atingem uma densidade de 5 x 106 a 1,5 x 107 células / mL após crescimento durante a noite (ver discussão Nota 1).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura (1.400 x g, à temperatura ambiente ou 4 ° C) em um tubo de centrifugação de tampa de rosca 15 mL por 5 min, Ressuspender as células em 1,5 mL de etanol a 70% e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mL, deixando este sentar-se por 1h à temperatura ambiente ou pelo menos 3 h no gelo ( podem ser armazenados indefinidamente a 4 ° C) (ver ponto de discussão (2)).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura na microcentrífuga (14.000 x g, 4 ° C) por 1 min, resuspenda em citrato de sódio 1 mL 50 mM, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C) por 1 min, aspirar o sobrenadante, resuspenda em citrato de sódio 1 mL 50 mM, pH 7,2 , contendo 0,25 mg/mL solução de RNAse h 1 a 50 ° C, ou durante a noite a 37 ° C em banho de água ou bloco térmico.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l solução de proteinase K (20 mg/mL resuspended em pH de Tris 10 mM 7,5, 2 mM CaCl2, peso de 50% de glicerol de volume) e incubar durante 1 h a 50 ° C.</li>
	<li>Spin para baixo de células (14.000 x g, 4 ° C), Ressuspender as células em 1 mL citrato de sódio 50 mM, pH 7,2, spin para baixo (14.000 x g, 4 ° C), aspirar o sobrenadante com vácuo, resuspenda em 1 mL 1 µM verde ácido nucleico estirpe resuspended em citrato de sódio 50 mM , pH 7,2 e incubar no escuro por 1h à temperatura ambiente, proceda à sonicação 2x para 2 s cada (2 watts de potência de saída).</li>
</ol>2. célula de triagem
<ol><li>Usando um classificador de célula, tipo de células de acordo com o conteúdo de DNA em fases G1, S, "G2 precoce" e "tarde G2", recolha de pelo menos 1,6 milhões células haploides de cada fase do ciclo celular como na Figura 1 (ver ponto de discussão (3)).</li>
	<li>Células de transferência para tubos de microcentrífuga e spin para baixo de células por 20 min a 14.000 x g a 4 ° C, na microcentrífuga e aspire o sobrenadante com vácuo (a pelota pode ser armazenada congelado a-20 ° C indefinidamente; ver discussão ponto (4)).</li>
</ol>3. DNA extração e preparação de sequenciamento de bibliotecas
Nota: As etapas a seguir são baseadas em "protocolo" na extração de DNA genômico de levedura Kit (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Adicione 120 µ l de "Buffer de digestão," um buffer patenteado que permite que a enzima lítica de levedura digerir a parede celular e 5 µ l da enzima lítica de levedura, resuspenda vortexing e incubar a 37 ° C por 40-60 min.</li>
	<li>Adicione 120 µ l de "Lise," uma reserva proprietária que contém detergente e difícil para 10-20 s de vórtice.</li>
	<li>Adicionar 250 clorofórmio µ l - homogeneizar por 1 min.</li>
	<li>Girar na velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 min.</li>
	<li>Carrega o sobrenadante para a coluna de ligação de DNA e centrifugar a velocidade máxima em uma microcentrífuga por 1 min.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de "DNA lavagem Buffer," uma reserva proprietária que contém etanol e centrifugar por 1 min na velocidade máxima em uma microcentrífuga. Descartar o fluxo através de, adicionar 300 µ l de tampão de lavagem do DNA e repita o processo de lavagem.</li>
	<li>Transferir a coluna de rotação para um tubo de microcentrífuga fresco, Adicionar 60 µ l de água (não TE) - Espere 3 min - 1 e em seguida centrifugar durante 10 s para Eluir o DNA.</li>
	<li>Medir a concentração pela adição de 5 µ l de DNA para 195 µ l de reagente de alta sensibilidade de dsDNA que foi diluído 1: 200 em dsDNA buffer de alta sensibilidade e, em seguida, a medida de fluorescência em um dados, usando 10 µ l de fornecidos padrões para calibração; Espero que entre 10 e 50 ng do rendimento total do ADN.</li>
	<li>Proceda à sonicação (pico incidente poder 450, Factor de serviço de 30%, ciclos por 200 Burst, tratamento tempo 60 s, nível de água 6) para separar o DNA em fragmentos de bp 250-350.</li>
	<li>Preparar uma biblioteca usando o kit de preparação de amostra de DNA e sequência-(leituras de pelo menos 10 milhões 50 bp único-extremidade) do instrumento de sequenciamento de DNA no modo rápido (ver nota de discussão (5)).</li>
</ol>4. análise de dados e geração de replicação de sequenciamento perfis
<ol><li>Alinhar sequências de Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genoma usando Gsnap12 (ver nota de discussão (6)).</li>
	<li>Determine por-base par ler profundidades usando "genomeCoverageBed" software13 dos Bedtools.</li>
	<li>Remover artefactual picos nas profundezas de leitura, se presente (ver nota de discussão (7)).</li>
	<li>Liso ler profundezas por cromossoma usando medianas em um 20KB deslizante janela usando a função "runMean" em R pacote "caTools" (ver nota de discussão (8)).</li>
	<li>Trama ler profundezas em S fase precoce G2 e G2 atrasado como uma porcentagem de profundidades de leitura completamente replicadas (ver nota de discussão (9)).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto esta técnica é robusta e relativamente direta, deve ser prestada especial atenção ao seguinte:
(1) recomendamos que culturas crescem pelo menos 12 h antes que eles atinjam a fase de registo, desde que diferenças se manifestar no ciclo celular distribuições se culturas são colhidas após ter alcançado a densidade desejada apenas 4 h após a inoculação. Nossa suposição é que uma distribuição de ciclo celular que atingiu um equilíbrio relativamente estável melhor representa uma distribuição de fase log "real" do que uma distribuição que está ainda em movimento, quando uma cultura saturada foi mais recentemente transferida para meio fresco.
(2) em vez de girar para baixo as células antes da fixação, as células também podem ser corrigidas adicionando diretamente etanol 100% para a cultura de levedura para que a concentração final de etanol é de 70%. As células podem ser cultivadas em sintético ou rico médio (YEPD).
(3) fases do ciclo de celular são visualizadas para ordenar por número de célula plotagem em função da área de emissão 530 nm. Descobrimos que os pontos de inflexão entre G1 e S e S e G2 servem como Marcos robustos para delinear a fase S, e nós usamos o máximo de G2 de fronteira para separar G2 cedo e tarde. Usamos os termos "G2 precoce" e "G2 final" para a clareza e concisão, talvez em detrimento da precisão no sentido de que as células são tecnicamente em fase S até que tenham concluído a replicação do DNA. Embora o objetivo do G2-seq é identificar sites muito tarde-replicação, que são esperados para ser revelado na fração G2 atrasada, nós coletamos fase S e cedo G2 células a seguir replicação através de todas as fases do ciclo celular.
(4) é criticamente importante que células ser girado para baixo imediatamente após a classificação. Não deixe pilhas sentar-se durante a noite antes girando-os para baixo. Temos tido problemas de recuperação de células por centrifugação se eles foram armazenados a 4 ° C, sugerindo que eles tornam-se frágeis após triagem e lyse com tempo.
(5) como poucos como leituras 5 milhões é suficientes, mas parcelas tornam-se menos suave, com menor número de leituras. Conjuntos de dados com leituras menos ainda pode ser capazes de ser acomodados pela suavização com janelas maiores que 20 kb, mas nós não tentamos isso.
(6) qualquer software de alinhamento utilizado (por exemplo, Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15ou Gsnap12) irá funcionar.
(7) dados de sequenciamento alto throughput do fermento mostram picos ocasionais em profundidades de leitura, que muitas vezes refletem elementos de Ty. Podemos eliminar estas substituindo 2.5 x mediana amostra ler profundezas para leitura profundidades fora regiões conhecidas por conter trechos repetitivos (por exemplo, o rDNA) maiores do que a mediana de x 2,5. O rDNA e as extremidades dos cromossomos são excluídas porque eles são conhecidos por conter elementos repetitivos. Um exemplo deste "despiking" usando a linguagem R é o seguinte:
# criar um quadro de dados chamado "leituras", contendo os dados: Chr <-rep ('chrI', 10) pos <-seq (1, 10) área de trabalho remota <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1) lê <-data.frame ('cromossomo' = chr, 'posição' = pos, 'read_depth' = rd) # "despike" as profundezas de leitura: leituras [, 'despiked'] <-ifelse (leituras [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])), (2,5 * median(reads[,3])), reads[,3])
"Tampando" ou "despiking" pode também ser conseguida excluindo leituras que mapeiam para mais de um local, mas isto irá eliminar leituras que mapeiam para, por exemplo, apenas dois locais. Instâncias de leituras que mapeiam para mais de um local, mas ainda fornecem informações valiosas, não são incomuns quando se trabalha com S. cerevisiae, cujo genoma resultou de um ancestral duplicação16.
(8) obtivemos resultados comparáveis com a função de "rollmedian" no pacote R "zoo" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) e a função "runmean" no pacote R "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) nós já experimentou inúmeros métodos para normalizar a profundidades de leitura, que deu resultados comparáveis. Nossa abordagem favorecida baseia-se no pressuposto de que pelo menos algumas regiões do genoma são totalmente replicados em nossa amostra de fase S. Determinamos a profundidade de leitura que representava a replicação completa como a mediana lê profundidade em nosso conjunto de dados em locais correspondentes aos 12 primeiros disparando alta confiança (Pontuação de "confiança" > = 7) origens em um conjunto de dados publicamente disponível. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & tabela = Raghu2001_ori & ext_format = & formato = guia). A maioria dos aplicativos, a abordagem adoptada para normalização não é crítica, e há muitas opções razoáveis, normalizando-se mais simplesmente apenas para ler os totais de contagem. No entanto, vale notar que, se existem grandes diferenças nos números de sequências repetitivas entre as amostras, normalização para ler contagem totais pode ser enganosa. Por exemplo, ao comparar duas linhagens cujas matrizes de rDNA diferem por várias vezes, normalizando a total de contagens de ler pode fazer certa regiões do genoma da estirpe com a maior matriz de rDNA artefactually parecem replicar a tensão com o menor, o mais tardar matriz.
Em resumo, G2-seq representa uma extensão lógica das técnicas existentes para perfil de replicação. Como outras técnicas de sequenciamento e microarray-baseada, G2-seq tem vantagens sobre 2D gel análise da ampla cobertura do genoma e a falta de exigência de conhecimento da localização das origens de replicação. O último é particularmente relevante em células de mamíferos onde, ao contrário no fermento de brotamento, origens de replicação não estão limitadas a sequências específicas. Por outro lado, géis 2D fornecem um nível de resolução de intermediários moleculares na replicação do DNA completamente inatingível por G2-Seq estendendo G2-seq para outros organismos cujas células podem ser classificadas de acordo com o conteúdo de DNA deve ser relativamente direta, no entanto, a natureza altamente repetitiva dos genomas de eucariotos superiores faz alinhamento de Sequências curtas de leitura muito mais desafiador. Tecnologias de sequenciamento que fornecem significativamente mais emergentes ler comprimento pode ser úteis a este respeito, especialmente desde que G2-seq deve ser relativamente robusto para as maiores taxas de erro que podem ser associadas com mais leituras17. Em nossa experiência, o problema técnico que é mais provável de causar problemas é deixar células sentar depois que eles foram classificados e antes do isolamento do DNA. Estas células aparecem para ser particularmente frágil e lyse com o tempo, e DNA deve ser isolado dentro de no máximo uma ou duas horas de classificação. Direções de futuras promissoras para esta técnica incluem dividindo as fases S e G2 tanto em aumento do número de fracções para obter maior resolução da dinâmica da replicação do genoma, de início precoce, a conclusão final.

Replicação do genoma eucariótico é iniciada em vários locais discretos, chamados origens de replicação, de que a replicação garfos procedem em ambas as direções (revistas em Fragkos et al, 20151). Origens variam em seu tempo e a eficiência de queima, e várias técnicas foram desenvolvidas para monitorar a atividade de origem de replicação e elucidar as causas desta variação. A atividade de origens individuais pode ser inferida níveis de single-stranded DNA2, que se forma em torno de origens ativas, ou por meio de eletroforese em gel 2D para monitorar a replicação específico intermediários3, ambos os quais podem ser detectados com sondas radioactivas. Ambas estas técnicas são mais facilmente aplicadas em S. cerevisiae do que em células de mamíferos, porque origens limitam-se a sequências específicas de conhecido na antiga. Com o advento dos microarrays, tornou-se possível avaliar globalmente a disparar de origem. Isto foi feito primeiro pela rotulagem DNA com isótopos pesados, liberando as células de um bloco de G1 no médios contendo isótopos leves e monitoramento em seguida a formação de pesados-luz híbrido DNA através do genoma4. A introdução de sequenciamento de alto throughput permitiu semelhante genoma-monitoração de atividade de origem, sem a exigência de marcação isotópica caro. As células foram classificadas em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA e seu DNA submetido ao sequenciamento profundo. Porque a cobertura de sequência procede de 1x a 2x ao longo da fase S, sincronismo de replicação relativo pode ser avaliado comparando leitura profundidades de células em fase S àqueles em G1 ou G25,6. Estas técnicas, particularmente aplicadas à levedura, levaram a uma compreensão mais profunda de como sequência de DNA, estrutura da cromatina e DNA replicação proteínas regulam eficiência e sincronismo de origem.
Transmissão fiel da informação genética durante a proliferação celular requer não só sucesso iniciação da replicação do DNA, que se realiza às origens, mas também a conclusão bem sucedida da replicação, que ocorre onde encontram forquilhas de replicação. Como iniciação da replicação, o momento da conclusão da replicação varia consoante o genoma com certas regiões restantes replicadas no mesmo final do ciclo celular. Tais regiões podem ser particularmente distantes origens de replicação ativa ou podem conter sequências ou estruturas de cromatina que impedem as polimerases de DNA. Tarde, replicar as regiões pode se manifestar como sítios frágeis, que são associados com quebras cromossômicas e maiores taxas de mutação e têm sido implicados no cancro e o envelhecimento7,8,9. No entanto, apesar da importância da adequada conclusão da replicação do DNA na manutenção da estabilidade do genoma, nossa compreensão de onde e como isso ocorre tem lag muito atrás da iniciação da replicação. E enquanto os genes individuais cuja replicação final tem sido associada com doença têm sido estudados com, por exemplo, qPCR10, globais estudos dirigidos a elucidar as localizações e ultimamente tem faltado replicação de causas subjacentes. Aqui nós descrevemos uma técnica que chamamos como "G2 seq", no qual combinamos citometria de fluxo com sequenciamento de alto throughput para lançar luz sobre a conclusão da replicação do genoma em fermento11. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser adaptado a qualquer uma das células que pode ser de fluxo-classificados de acordo com o conteúdo de DNA.

<table width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">YeaStar Genomic DNA kit</td>
			<td style="width:135px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-323</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">1 &#181;M SYTOX Green</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">57020</td>
			<td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="width:301px;height:147px;">RNase solution (0.25 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R6513</td>
			<td style="width:167px;">0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:301px;height:42px;">proteinase K solution (20 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher / Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-015</td>
			<td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Model 50 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>FB50A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">BD Biosciences FACSAria II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Zymo-spin III columns</td>
			<td style="width:135px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td>
			<td style="width:135px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">500219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>15026486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina HiSeq 2500 instrument</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>SY&#8211;401&#8211;2501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:301px;height:63px;">gsnap alignment software</td>
			<td style="width:135px;">open source software / Genentech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-pub.gene.com/gmap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Inúmeras técnicas têm sido desenvolvidas para acompanhar o progresso da replicação do DNA através da fase S do ciclo celular. A maioria destas técnicas tem sido direcionada para elucidação do local e hora de início da duplicação do genoma, ao invés de sua conclusão. No entanto, é fundamental que nós entendemos de regiões do genoma que são última para concluir a replicação, porque essas regiões sofrem níveis elevados de quebra cromossômica e mutação, e eles têm sido associados com doenças e envelhecimento. Aqui descrevemos como nós estendemos uma técnica que tem sido usada para monitorar a iniciação de replicação para em vez disso, identificar as regiões do genoma última a replicação completa. Esta abordagem é baseada em uma combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento. Embora este relatório centra-se sobre a aplicação desta técnica a levedura, a abordagem pode ser usada com qualquer uma das células que pode ser classificada em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA.

Temos utilizado o procedimento descrito acima para identificar sites replicação finais no fermento de brotamento. Esta abordagem usando uma região de replicação final conhecida em um cromossomo artificial de teste provou a técnica para ser precisa e confiável. Nossos resultados também demonstraram a importância biológica da conclusão atempada da replicação, mostrando que uma tarde região replicam no cromossomo 7, que identificamos como replicação final com base nos nossos resultados de G2-seq, foi perdida aproximadamente triplo, mais frequentemente do que uma comparável controle região11.
Um exemplo específico de resultados com G2-seq é mostrado na Figura 2. Nós tinha a hipótese de que lá estaria regiões do genoma que particularmente tarde replicados nas células falta uma proteína deacetilase chamado Sir2. Figura 2A mostra o progresso da análise de dados para o tipo selvagem (azul) e sir2 (vermelho). Os dados brutos (linhas superiores) contêm grandes picos, a maioria dos quais são devida à presença de elementos de Ty. Estes picos são removidos por tampando Leia profundidades em 2.5 x a mediana leitura profundidade para cada amostra (linhas médios). Então, os dados despiked são suavizados com uma janela de 20KB deslizante (linha inferior). Finalmente, dados são normalizados e plotados como rácios para os níveis no G1. Uma região típica tarde replicam que aparece no mutante sir2 é destacada na Figura 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56286/56286fig1.jpg"> Figura 1. Fluxo cytometry perfil indicando fracções de ciclo celular usadas; Marcado como limites externos de todas as portas. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56286/56286fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56286/56286fig2.jpg"> Figura 2. (A-B) Progressão de processamento de dados de dados brutos (linhas superiores), despiked de dados (linhas de médios) e alisou dados (linhas de fundo) para o tipo selvagem (A) e sir2 (B). (C) rácios de S fase - início G2- e tarde G2-G1 ler profundezas. Tipo selvagem em azul e sir2 em vermelho. A região realçada no canto superior direito mostra uma região de replicação final específico para sir2 mutante. Escala indica a fração de replicação completa (2N); uma célula completamente replicada apareceria em 0,5, uma célula completamente replicada no 1. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56286/56286fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

5.7K visualizações.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Mediada por CRISPR genoma edição do patógeno humano fungo Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...