破壊的なサンプリングの標本へのアクセスのためのミズーリの植物園とサンプリング標本、援助のクリスティーナ Zudock ヨルダン Teisher、テイラー AuBuchon-高齢者を感謝いたします。この作品は全米科学財団 (DEB-1457748) からの助成金による支援です。

<ol>
	<li>Savolainen, V., Cu&#233;noud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Cr&#232;vecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+herbarium+specimens+in+DNA+phylogenetics:+Evaluation+and+improvement.">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li><li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. 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Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+(Asparagaceae).">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li><li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. 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著者は、彼らが競合する利益あるを宣言します。

ここで提示されたプロトコルは、DNA の隔離および植物の乾燥標本からのライブラリの準備をシーケンス処理の包括的かつ堅牢な方法です。メソッドとそれを変更する必要は最小限の一貫性は、それは大規模な標本に基づくシーケンス プロジェクトのスケーラブルな標本の品質確認に基づいています。低降伏点ライブラリのオプション reamplification ステップを含めることは、低品質、低量、珍しい、またはシーケンスに適していないなる歴史的に重要なサンプルの包含をことができます。
初期 DNA の収穫の重要性 標本由来 DNA 劣化初期試料保存11検体の DNA と結果として 300 年以上古い歳31の数千に数百を動物の遺体から分離された DNA として劣化とされて,32します。 その結果、初期 DNA 収量の最適化成功シーケンス ライブラリの準備のため十分な高品質 dsDNA の取得で重要であります。草種滅菌砂の併用により最適な収率を達成し、初期研削における液体窒素のステップは、細胞壁のより徹底的な破壊と核酸のリリースを提供すること。このアプローチは、望ましい大きい dsDNA と望ましくない小さな断片 (図 1、補足図 1、表 2、補足表 1など) の両方を増加します。その後ビード清掃手順は隔離し、シーケンス (300-500 塩基対) が回復を大幅に削減、また長いフラグメント (表 2、補足表 1) 豊かに適したサイズの断片に豊か。初期の DNA 分離手順への変更は、下流の処理18二次代謝産物の影響を低減するためにサンプリングされている系統に基づく必要かもしれません。
ライブラリ アダプターの最適化 結紮用アダプターの濃度は、完成したライブラリ アダプター二量体の量に直接影響します。アダプター アダプター セルフライゲーションに起因する不十分なサンプルが存在する場合およびシーケンス実行33を汚染します。標本から利用可能な比較的低い合計 dsDNA 結紮する前にアダプターの希釈が必要になります。アダプターを, 50 倍希釈することができます 15 μ M のストック濃度から個別に測定し、各サンプル (表 2、補足的なテーブルのアダプターを希釈することがなく (プロトコル セクション参照) 促進高スループット ライブラリの準備1). アダプターの彩度は原則的に全体的なライブラリ収量を低下させる、標本がアダプターのような過剰に dsDNA をもたらすこと可能性がありますはありません。
掃除の手順を利回りが高いビーズのバリエーション シーケンス ライブラリの準備のためにサイズの選択は、目的のサイズ範囲内で主にフラグメントの増幅を可能にするアダプター結紮後通常行われますこの大きく、ターゲット サイズより小さいフラグメントを削除することによって行われます。ライブラリの準備のための植物標本由来 dsDNA の低量を活かして低総 dsDNA の結果、この段階でサイズを選択した後は、悪化し、最終的に低収量最後のライブラリ。結紮後 90% ボリュームのビーズを使用して標準的なビーズ洗浄ステップを行い、以上合計 dsDNA の拡大のステップの濃縮のままです。非常に小さい DNA のフラグメントは、90% の量のビーズを使用して優先的に削除されます。サイズの選択は、目的のフラグメント サイズの充実により増幅されたライブラリを最後の手順で行われています。25 μ L とビーズの 6 μ L の 2 段階ボリューム (図 1 b、補足図 2) このプロトコル内で 400-500 塩基対の挿入のライブラリを取得するために最適化されていますが、目的の範囲を選択するビーズの合計ボリュームを調整できます。
サンプル ライブラリの Reamplification を救助 にもかかわらず、DNA の隔離とライブラリの準備に関するベスト プラクティス、シーケンス処理ライブラリの最終濃度がさらにシーケンスの適切なあります。標本からのサンプリングとしばしば限られた消耗材料の破壊的な性質では、DNA の隔離を繰り返しは常に許可されていません。最大ライブラリを reamplifying で 12 追加の PCR のサイクルも非常に貧しい人々 ライブラリに保存できます。標準的なプライマーは、増幅は、いずれかのデュアルまたはシングル インデックス ライブラリ プロトコルと互換性のあるに使用されます。Reamplification にとって最大の関心事は、GC リッチ部ゲノム20削減により多くの場合、バイアスの紹介です。高品質なポリメラーゼを使用して (材料の表を参照)、これらの潜在的なバイアスを回避可能性があります。これは TK686 と TK686-R (表 3) シーケンスされたライブラリの GC 含量の最低限の変化により示される.2 番目の検証として TK686、TK686 R のトランスポゾン コンテンツは推定され目に見える差はみられなかった (表 3)。最後に、TK686 と TK686-R は、(図 2表 3) の 2 つのアセンブリ間の変動が SNP の厳重な点検の後同一シーケンスの結果からこの加盟の全体の葉緑体ゲノムを組み立てた。これらのテストは、GC 含量とトランスポゾン成分や完全な葉緑体ゲノムを組み立てる能力が受けないこと reamplification のようの標準的なゲノムの指標をお勧めします。これは標本の標本も低下すると考えを組み込むこと、または pcr 法によって導入されたバイアスを気にせずゲノミクス研究材料に欠けているの可能性を開きます。SNP の呼び出しが偏っているかどうかをテストする必要がありますがもシーケンス キャプチャ34, これらの reamplified ライブラリを使用可能性があります。プロジェクトごとにシーケンス ライブラリにバイアスを生じないことを確認するとバイアスの小規模テストを実施することをお勧めします。
制限事項と可能な修正 このプロトコルに取り組んでいるにもかかわらず標本、悪いの何百もの組織を保持まだ任意のステップで失敗します。しかし、それは極めてまれな成功の DNA の抽出と組織から reamplification を通じてライブラリ救助後は特に失敗するライブラリの。対象とする別のサイズのフラグメントまたはフラグメントのいくつかの最終的なライブラリでの広い範囲を減らすために、サイズの選択手順を変更できます。としてすべての植物ベースの抽出のプロトコルと手順は必要かもしれない全体的なプロトコルを妨げることができる系統固有の二次化合物を削除します。提示、このプロトコル草押し葉標本の DNA 分離、高速ライブラリの準備のための標準的な方法を提供します、実験と検証を通じて、他の植物の系統を除去する可能性があります。

標本コレクションは、種と系統1,2,3, 集団遺伝学4,5, 保全を含む研究のためのゲノムの多様性の両方の可能性がある貴重な情報源生物学6、外来種生物学7、および形質進化8。種、人口、地理的な場所、タイム ポイントの豊かな多様性を取得する機能は、標本は、「宝箱」9を強調表示します。歴史的に、標本由来 DNA の劣化した自然が多い領域の葉緑体ゲノムや、リボソームの内部転写スペーサー (ITS) などの高いコピー内で見つかったマーカーのみを使用する研究者を追いやって、PCR ベースのプロジェクトを妨げています。RNA。標本と DNA の品質によって異なります広く保全9,10二本鎖切断と損傷の最も一般的な形であること、作成の乾燥工程で使用される熱から断片化の手法、いわゆる 90 %dna ロックアップ PCR ベースの研究11を妨害しています。断片化、別標本のゲノムの第 2 最も一般的な問題は汚染、生菌13から派生する菌類コレクション後、標本12にもマウントする前に死後を取得したようにこの問題は、右真菌データベース (下記参照) を与えられた解決の bioinformatically をすることができます。11押し葉標本の低い (〜 0.03%) と推定されている、3 番目、およびより少なく共通の問題はシトシン脱アミノ化 (C/G→T/A)14日シーケンス変更です。短いリードとシーケンス深さ12,15、低品質の多数の標本から遺伝子レベルのデータ集録が可能高スループット シーケンス (HTS) の出現により、断片化の問題を克服できます。DNA と時々 全ゲノム シーケンス15を許可します。
標本サンプルはより頻繁に使用されるなる、系統のプロジェクト16の大きなコンポーネントです。標本を用いた高温超伝導体の現在の課題が個々 のための方法を最適化することがなく、タイムリーに多くの種から十分な二本鎖 DNA、シーケンス プロトコルは、必要な前提条件を一貫して取得します。標本。本稿では、既存の手段を活用して、高速かつ複製可能な結果を可能にするそれらを変更に DNA の抽出と標本のライブラリの準備のためのプロトコルが示されています。この方法は 13 h、8 h のハンズオン タイム、または 16 h、9 h、ハンズオン時間、オプション reamplification ステップが必要な場合 24 サンプルのライブラリに試験片から処理が完了すること。多くのサンプルの同時処理は、制限要因は遠心力と技術的なスキルが達成可能で。プロトコルは DNA をせん断してだけ典型的な実験装置 (たち、遠心とマグネット スタンド) ネブライザー、超音波発生装置などの特殊な機器ではなくを必要とする設計されています。
DNA の品質、フラグメント サイズと数量は、高スループット シーケンス実験の標本の使用のための要因を制限しています。標本の DNA を分離し、高スループット シーケンス ライブラリを作成する他の方法は 10 として少し使用の有用性を実証している DNA16; ngただし実験的 PCR の最適な数を決定する必要なライブラリの準備のために必要なサイクルです。これは、いくつか標本が単一のライブラリの準備のため十分な DNA のみを生成するよう実行可能なダブルの非常に小さな金額を扱う鎖 DNA (dsDNA)、非現実的ななります。ライブラリの最適化の手順で DNA は失われませんので、ここで紹介した方法は単一サンプルの質に関係なくサイクル数を使用します。代わりに、ライブラリは、シーケンスに必要な最低限の量を満たしていない場合に、reamplification ステップが呼び出されます。多くの植物標本サンプルはまれであり、多くの場合有害なサンプリングを正当化するが難しく少し材料を所有しています。これを対抗するため提案するプロトコルにより、dsDNA 入力サイズを 1.25 未満 ng のライブラリの準備プロセス、高スループット シーケンスと供試体の破壊のサンプリングのための必要性を最小限に抑えるのための実行可能なサンプルの範囲を拡大します。
次のプロトコルを草用に最適化されており、我々 はプロトコルことができます他の多くの植物のグループに適用されることを期待するものの、標本サンプルから別の種の何百ものテストします。低品質または珍しい標本を保存するために使用できる省略可能な回復手順が含まれています。テスト 200 以上の標本を基に、このプロトコルは、最小限の破壊的なサンプリングによって珍しい標本の保存を可能にする低組織入力と品質、標本で動作します。ここでこのプロトコルがゲノミクス ベース プロジェクトのシーケンスことができます高品質ライブラリを提供できることを示す.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">4452300</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:180px;">Azure Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">c300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microfuge 20 Series</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">B30137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Digital Dry Bath</td>
			<td style="width:180px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:104px;">BSH1001</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:180px;">EasyCast</td>
			<td style="width:104px;">B2</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td>
			<td style="width:180px;">ELGA&#160;</td>
			<td style="width:104px;">89204-092</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DNA LoBind Tube&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td style="width:147px;">2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mini centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-006-901</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-812</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mortar</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02591</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pestle</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02595</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">21-403-161</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microwave</td>
			<td style="width:180px;">Kenmore</td>
			<td style="width:104px;">405.7309231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">20170-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32866</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Balance</td>
			<td style="width:180px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:104px;">PM2000</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen Short-term Storage</td>
			<td style="width:180px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">F9401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Magnetic-Ring Stand&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">AM10050</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Water Bath</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">89032-210</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hot Plate Stirrers</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">97042-754</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:180px;">Airgas</td>
			<td style="width:104px;">UN1977</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1 X TE Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Ambion</td>
			<td style="width:104px;">AM9849</td>
			<td style="width:147px;">pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CTAB</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0833-500G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2-MERCAPTOETHANOL</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0482-200ML</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ribonuclease A</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">E866-5ML</td>
			<td style="width:147px;">10 mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63882</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">705744</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">40970004-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nuclease Free water</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">42300012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">A393-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">s608-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:180px;">GeneMate</td>
			<td style="width:104px;">E-3120-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">100bp PLUS DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:104px;">D003-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, Disodium Salt</td>
			<td style="width:180px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:104px;">IB70182</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">TRIS</td>
			<td style="width:180px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:104px;">103133</td>
			<td style="width:147px;">ultra pure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Loading Dye Purple (6 X)</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">B7024S</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0348L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&#160;</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7645L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7600S</td>
			<td style="width:147px;">Dual Index Primers Set 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0543L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mag-Bind RXNPure Plus</td>
			<td style="width:180px;">Omega bio-tek</td>
			<td style="width:104px;">M1386-02</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">GelRed 10000 X</td>
			<td style="width:180px;">Pheonix Research</td>
			<td style="width:104px;">41003-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:104px;">P4557-400ml</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVP40</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">PVP40-50G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Chloroform</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">EM8.22265.2500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ethanol</td>
			<td style="width:180px;">Koptec</td>
			<td style="width:104px;">V1016</td>
			<td style="width:147px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silica sand</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">14808-60-7</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reamplification primers</td>
			<td colspan="2">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>see text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sequencher v.5.0.1</td>
			<td style="width:180px;">GeneCodes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

標本は、さまざまな生物学的研究で使用できる植物材料の非常に貴重な源です。標本の使用はサンプル保存品質、劣化 DNA、珍しい標本の破壊的なサンプリングを含む課題の番号に関連付けられます。効果的に大規模なプロジェクトの標本材料を使用、するために DNA の分離およびライブラリの準備の信頼性と拡張性の高い方法が必要です。本稿は、DNA 分離、高速ライブラリ構築に標本から個々 のサンプルの変更を必要としない堅牢で、始めから終わりまでプロトコルを示します。このプロトコルは、組織研削、ライブラリ サイズ選択を変更して低収量ライブラリのオプション reamplification ステップを導入することを最適化することにより従来の低品質の乾燥植物素材とを利用に合わせて調整します。低収量 DNA ライブラリの reamplification は、かけがえのない、潜在的に貴重な標本、追加破壊サンプリングし、共通認識できるシーケンス バイアスを導入することがなく、必要性を否定することから派生したサンプルを救うことができます。系統のアプリケーション。プロトコル数百草種でテストされていますが確認後他の植物の系統での使用に適応します。このプロトコルは、フラグメントは目的のサイズの範囲では存在しない、非常に低下した DNA ときれいな DNA 分離を抑制する二次代謝産物いくつかの植物材料の存在によって制限することができます。全体的に、このプロトコルは DNA の隔離と最小限の変更でアクティブなハンズオン タイムの 8 時間だけで 13 h 未満の 24 サンプル調製されたライブラリでは、高速かつ包括的な方法を紹介します。

DNA の隔離および最終的なライブラリ収量 本研究では 1920 年からの最も古いと 2012 年 (表 2) から最年少 50 の異なるサンプルを使用して標本の DNA の分離および高品質シーケンス ライブラリの回復用のプロトコルの有効性を示した.各サンプルは、葉の組織の約 10 mg は DNA の隔離に使われました。場合は、環境に優しい葉組織が支持され、明らかなカビ汚染と組織が選択されていません。成功の分離は、収量が低くなるはずに黄色や茶色のティッシュを使用して行うことが。合計二重らせん DNA (dsDNA) 3.56 から最初の分離から 2,610 に ng ng。予想通り、標本から得られた DNA は著しく低い (図 1 a図 1カスタマーインフォメーション センターの障害)。酵素せん断 (1.26-464 ng) の分離の部分が使用されました。標本の DNA は、すでに保全プロセスを介して剪断、全体的なライブラリ生産収率改善追加せん断プロトコルの最適化が必要です。DsDNA が剪断後の総回復 〜 < 1% から 51% 以上 1.25 未満の結果入力の dsDNA のライブラリの準備および 328 の最大のための DNA の開始の ng ng。いくつかのサンプルの DNA の極端な損失は、酵素剪断 (図 1 a図 1 の補足) 前に DNA の多くの既に小さな断片のサイズに帰することができます。せん断の DNA 上の 90% のボリューム ビーズ クリーンアップの使用より大きくより望ましいフラグメント サイズを豊かにする DNA の小さいフラグメント意図的削除。これらの小さな断片として 100 塩基対のマーク (図 1 a) で強烈な信号によって示される TK463、TK657、および TK694、サンプルで見た特に。
ライブラリの投稿サイズ選択の合計数量は 1.425 からであった 942.5 に ng ng (補足の表 1、表 2)。初期の抽出およびライブラリの準備したサンプルの 23、ライブラリの十分な量を得られない (< 10 nM;補足の表 1、表 2) ので、これらのサンプルは、プロトコルの reamplification と回復の手順にさらされた 14-680 x の結果合計ライブラリ (補足の表 1、表 2) で増加します。最終的なライブラリは、350 と 500 の塩基対 (図 1 b、カスタマーインフォメーション センターの障害図 2) の間にバンドになりました。時、予想されるライブラリのサイズよりも大きい 2 番目のバンドが見られた (図 1 b、カスタマーインフォメーション センターの障害図 2)。これは、発生 reamplification PCR 利用可能なプライマーを排出し、始めた非相同 DNA 断片のライブラリ アダプターをアニールします。これは分子が終了 (アダプター) が熱処理正しく DNA 挿入はしませんでしたを作成します。この「バブル」分子ゲルのマトリックスをもっとゆっくり移動するそれとして登場、ゲルのより大きいです。既に reamplified のライブラリから別の reamplification 反応を準備し、単一サイクルの実行によりこれらの焼鈍のエラーを修正しました。この 1 つのサイクルは、適切な熱処理や増幅、2 番目のバンド (補足図 3) を削除のプライマーを提供しました。
ライブラリの reamplification 容易に少なくとも 10 の最後のライブラリ濃度 nM。これらの濃度はモル濃度とプールで平等な表現、等しくないサンプルの質が生じているとの問題を否定する支援とシーケンシング ライブラリ収量を等しくなるように希釈するライブラリを許可します。プロジェクトの目標が葉緑体ゲノムの場合、シーケンス、シーケンスの合計額は、異なる系統と異なりますが必要なし、組織が異なる葉緑体 DNA19から発信された読み取りの合計の割合。通常、葉緑体ゲノムの投影範囲 x 50-100 は、アセンブリのための十分な種とシーケンスの結果に応じてできるだけ多く 70 個人を含めるシーケンスの実行をプールできます。
汚染、バイアスおよび Reamplification によって引き起こされる変化のためのテスト HTS シーケンスの注目は、広範な PCR 増幅20を介してライブラリにバイアスの紹介です。Reamplification の効果をテストして標本材料の潜在的なバイアス系統共通のアプリケーションを識別するには、同じ希釈ライブラリ 1:5 と reamplified (指定された TK686-R) 正常にシーケンスされたライブラリ (TK686) を比較しました。両方の TK686 と TK686-R はイリノイ大学のロイ ・ J カーバー バイオ テクノロジー センターで、ミシガン州立大学研究技術支援施設、イルミナ HiSeq4000 でそれぞれシーケンス処理された、(を参照してください読み取りペア終了 150 塩基対を使用して表 3シーケンス詳細については)。Raw 読み取りは、NCBI SRA (SRP128083) に寄託されています。Trimmomatic v.0.3621 NEB アダプター シーケンス、スライディング ウィンドウ、10 塩基対の 20 の平均 phred スコア フィルタ リングの品質を使用してアダプター トリミングを含むを使用してきれいになった読み取りと最低 40 塩基対のサイズ。汚染が、JGI MycoCosm 真菌ゲノム データベース22 (312 の核ゲノムとミトコンドリアゲノム 79) の一部に対する読み取りをマッピングすることにより推定された真菌汚染標本に関する主な問題の 1 つとして、bowtie2 v を使用.2.2.923 「非常に敏感なローカル」パラメーター セットを使用します。TK686 および TK686-R ライブラリは核のカビ汚染の区別された (9.24% と 9.68% それぞれ) とミトコンドリアのカビ汚染 (0.94%、0.8%)(表 3)。これはほんの一例ですは標本サンプルのカビ汚染は無視できないと標本派生シーケンス データを使用する前に削除する必要があることをお勧め。データベースと識別し、真菌汚染を削除に使用するコマンドは、M. R. マッケイン GitHub のレポジトリ標本ゲノミクス24で見つけることが。
葉緑体ゲノムの系統樹解析で用いられる、標本がソース材料12としてますます使用されます。葉緑体ゲノムのアセンブリの reamplification の再現性をテストするために TK686 と TK686-R の葉緑体ゲノムは、イネ目に設定ボウタイ インデックスが既定の設定で高速プ v.1.2.525を使用組み立てられました。における葉緑体ゲノム TK686-R が得られたが、TK686 葉緑体ゲノムの低い読み取り深度による 7 コンティグに組み立てられました。手動で次のマッケインらTK686 コンティグを組み立てた完全に組み立てられた葉緑体ゲノムは、GUI ベースのアライメント ソフトウェアで互いに整列した26 (材料の表を参照) とアセンブリの間の変化を評価しました。12 SNPs と 1 つの塩基の合計が TK686 の葉緑体アセンブリと TK686 R 間識別されました。TK686 と TK686 R の両方から読み取りセットで評価した報道各バリアントのすべてのケースで最も一般的な変種は、2 つのライブラリと同じだった。TK686 1 T→C 1 G→A 1 G→T、1 G→-、1 C→A、1 T→A、C→A の 4 つのバリエーションを示した。これらの亜種の 5 つはアセンブリにその定款にかもしれない順序の誤りと低い全体的なカバレッジの結果を示唆しているホモポリマー文字列内で発生しました。他の葉緑体ハプロタイプ バリエーション、シーケンス エラー、またはシトシン脱アミノの結果またはこれらの要因のいくつかの組み合わせだったかもしれない。TK686-R は、1 C→T、1 G→T、1 A→G を持っていた。C→T と G→T の亜種は、上記のホモポリマーで発見されました。最終的には、同一の完全な葉緑体ゲノムは両方の読み取りのセットから識別されました。緑豊かな21を使用して、Andropogoneae 部族の他のメンバーと比較して、TK686 から 1 つの葉緑体ゲノムが付けられています。すべての標準的な葉緑体機能の注釈が付けられる: 8 Rrna、38 Trna および 84 の蛋白質コーディングの遺伝子。完全な葉緑体ゲノム、GenBank (MF170217) および緑豊かな27から使用できます。
ライブラリの reamplification からの潜在的なバイアスは、GC % の推定と合計推定トランスポゾン コンテンツを通じても決定しました。パーセントの GC は、カスタム スクリプト24を用いて推定しました。2 つのサンプルの GC 含量の違いは TK686 の 49.7 %gc と TK686 R に 51.2 %gc、無視されました。トランスポゾンの組成は、Transposome28を用いて推定しました。両方のライブラリの 100,000 の読み取りがランダムにサブサンプリング トランスポゾン構成を 90 パーセント アイデンティティ、0.55 の分画範囲、100 のクラスター サイズを使用して推定したし、RepBase 21.10 草繰り返し参照設定29。これは、これらのデータセットからトランスポゾン推定でブートス トラップを実行する 100 回を繰り返した。Transposome 出力から抽出されたトランスポゾンの主要な亜科の全ゲノムの割合と平均と 100 の複製のためにこれらの標準偏差を推定しました。M. R. マッケイン Github のレポジトリ トランスポゾン30でこれらの出力の生成に使用されるすべてのスクリプトを見つけることが、すべての結果は、ドリュアス (doi:10.5061/dryad.r8t2m) に寄託されています。(コピアやジプシーの長いターミナル繰り返しレトロトランスポゾン) の指標として 2 つの最も一般的なトランスポゾン亜科を使用して、結果 24.83 ± 33.52 ± 4.00% の ± 2.94% とジプシーの 31.68コピアとほぼ同一であった2.72%、TK686、TK686 R、24.00 ± 2.35% それぞれ (表 3)。これらのテスト結果このプロトコルの reamplification ステップが高度なゲノムの指標の意味のあるシーケンス バイアスを作成しなかった示唆しています。ただし、この単純な例が reamplified のすべてのライブラリを十分に反映できない場合があります。この 1 つのテストを示して reamplification ステップで r. TK686/TK686 のゲノム メトリックは本質的にバイアスなくシーケンス処理の十分な適用範囲を与えられた葉緑体ゲノムのアセンブリに導入されたバイアスは影響しませんが、実験、TK686/TK686 - r を本研究では提示が行われているターゲットの血統バイアスがないことを確認するにはお勧め転移因子の多様性を調査研究中に発生しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig1.jpg"> 図 1: A の Agarose のゲルの画像) DNA の隔離および 10 標本から B) 最終的なシーケンス ライブラリ。各レーンの 3 μ L の DNA またはライブラリが使用されました。(A) DNA すべて標本隔離された劣化一般的な塗抹標本で見られるように。(B) 最終シーケンス ライブラリ描写 200 1,000 塩基; の広い分布を持つ 300 500 塩基対の主なバンド後者は reamplified ライブラリでより流行します。車線両方 (A) と (B) サンプルによって識別された、表 2の結果と比較することができます。はしごサイズは塩基対 (bp) で描かれていた。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2.jpg"> 図 2: 円形プロットのSchizachyrium scoparium(TK686) 葉緑体ゲノムの注釈と。標本由来 DNA のショットガン ・ シークエンシング法から完全に組み立てられたゲノム展示 139,296 塩基対 (bp) 81,401 の大規模な単一コピー領域 (LSC) の長さの合計 bp、22,669 の倒立リピート領域 (IR) 12,557 小さな単一コピー領域 (SSC) と bp、bp。標準蛋白質のコーディングの遺伝子、Trna、Rrna Andropogoneae 部族のメンバーは、注釈で識別されました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
表 2:10 標本サンプルと 4 つの reamplified ライブラリの DNA 抽出とライブラリの準備の結果。さまざまな合計二本鎖 DNA 手順プロトコルでフィルター サイズの場合は特に、実証どのように変数の品質をすることができます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
テーブル 3: TK686 と reamplified TK686R の統計情報をシーケンスします。Reamplification は、全体の葉緑体ゲノムを組み立てる能力トランスポゾン組成推定や GC コンテンツ推定汚染真菌ゲノム全体の発生率には影響しません。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table3_Sequencing_Statistics_TK686.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足表 1: 20 reamplified ライブラリを含む、40 の追加標本サンプルの DNA 抽出とライブラリの準備の結果。さまざまな合計二本鎖 DNA 手順プロトコルでフィルター サイズの場合は特に、実証どのように変数の品質をすることができます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Table1_Data.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1: 40 の追加 DNA 分離標本からの Agarose ゲル画像。(A) と (B) 20 別 DNA 分離を描写や標本由来 DNA の特性劣化を示します。各レーンの 3 μ L の DNA が使用されました。車線両方 (A) と (B) サンプルによって識別された、補足表 1の結果と比較することができます。はしごサイズは塩基対 (bp) で描かれています。ホワイト クリーニングを削除できませんでしたゲル イメージャの工芸品が画像上の斑点。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure1_DNA_Isolation.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 2: 標本由来 DNA から 40 の追加シーケンス ライブラリの Agarose のゲルの画像。各レーンのライブラリの 3 μ L が使用されました。最終的なシーケンス ライブラリは両方 (A) であると (B) の平均サイズは 300-500 塩基対。いくつかの増幅されたサンプルで見られる二次バンドは、ライブラリの「バブル」をお勧めします。車線両方 (A) と (B) サンプルで識別され、補足表 1の結果と比較することができます。はしごサイズは塩基対 (bp) で描かれています。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Figure_2_Library_Prep.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 3: 二次バンド除去、単一サイクルの PCR ステップ Agarose ゲル画像。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure3_Single_Cycle_Clean.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス ライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K ビュー.  Donald Danforth Plant Science Center. この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス ライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築