Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Fonte: Laboratório do Dr. Andrew J. Steckl — Universidade de Cincinnati

Um microscópio eletrônico de varredura, ou SEM, é um poderoso microscópio que usa elétrons para formar uma imagem. Permite imagens de amostras condutoras em ampliações que não podem ser alcançadas usando microscópios tradicionais. Microscópios de luz modernos podem alcançar uma ampliação de ~1.000X, enquanto o MEI típico pode atingir ampliações de mais de 30.000X. Como o SEM não usa luz para criar imagens, as imagens resultantes que ele forma estão em preto e branco.

As amostras condutoras são carregadas no estágio amostral do SEM. Uma vez que a câmara de amostra atinja o vácuo, o usuário passará a alinhar a arma eletrônica no sistema ao local adequado. A arma eletrônica dispara um feixe de elétrons de alta energia, que viajam através de uma combinação de lentes e aberturas e eventualmente atingem a amostra. À medida que a arma eletrônica continua a disparar elétrons em uma posição precisa na amostra, elétrons secundários saltarão da amostra. Estes elétrons secundários são identificados pelo detector. O sinal encontrado a partir dos elétrons secundários é amplificado e enviado para o monitor, criando uma imagem 3D. Este vídeo demonstrará as capacidades de preparação, operação e imagem da sem.

Elétrons são gerados pelo aquecimento pela arma eletrônica, que age como um cátodo. Estes elétrons são impulsionados para o ânodo, na mesma direção da amostra, devido a um forte campo elétrico. Depois que o feixe de elétrons é condensado, ele entra na lente objetiva, que é calibrada pelo usuário para uma posição fixa na amostra. (Figura 1)

Uma vez que os elétrons atingem a amostra condutora, duas coisas podem acontecer. Primeiro, os elétrons primários que atingiram a amostra serão escavados através dela até uma profundidade que depende do nível de energia desses elétrons. Em seguida, os elétrons secundários e recattered atingirão a amostra e refletirão para fora dela. Esses elétrons refletidos são então medidos pelo detector de elétrons secundários (SE) ou backscattered (BS). Após o processamento do sinal, uma imagem da amostra é formada na tela. ¹

No modo SE, elétrons secundários são atraídos por viés positivo na frente do detector por causa de sua baixa energia. A intensidade do sinal é variada dependendo do ângulo da amostra. Portanto, o modo SE fornece imagens altamente topográficas. Por outro lado, no modo BS, a direção dos elétrons é quase diretamente oposta à direção do feixe eletrônico e a intensidade de detecção é proporcional ao número atômico da amostra. Portanto, é menos topográfico, mas útil para imagens composicionais. O modo BS também é menos afetado pelo efeito de carregamento na amostra, o que é benéfico para amostras não condutoras. ¹

Figura 1. Esquema do SEM.

1. Preparação da Amostra

1. Coloque a amostra no stub da amostra. Se necessário, a fita de carbono pode ser usada para ligar a amostra adesivamente ao stub.
2. Coloque a amostra em um sistema de sputtering de ouro. Usando uma sputter mini-ouro, sputter ouro para 30 s a ~ 70 mTorr pressão. Uma espessura de camada de ouro diferente pode ser necessária dependendo da geometria da amostra. Uma superfície mais áspera ou porosa requer um tempo mais longo de sputtering.
3. Remova o stub do sistema de sputtering dourado.

2. Inserção de amostras e Startup SEM

1. Desabasse a câmara SEM, permitindo que a câmara atinja pressão nominal.
2. Abra o compartimento de amostras SEM e tire o estágio amostral.
3. Insira o stub de amostra contendo a amostra no estágio. Aperte o stub no lugar.
4. Se a distância z não puder ser controlada por software, certifique-se de que o estágio da amostra com amostra tenha altura adequada para obter a melhor imagem.
5. Coloque o estágio amostral na câmara de amostras. Feche o compartimento de amostras.
6. Ligue as bombas e deixe o sistema atingir o vácuo. O sistema notificará o usuário quando isso estiver concluído.
7. Abra o software SEM. Selecione tensão de operação desejada variando de 1 a 30 kV. Maior tensão de operação dá melhor contraste de imagem, mas pode produzir menor resolução se as cargas se acumularem na amostra.

3. Capturando a Imagem SEM

1. Inicie 'Auto Focus' no software SEM clicando no ícone chave. Isso adquirirá uma imagem focada da amostra para usar como ponto de partida.
2. Certifique-se de que a ampliação está definida para o nível mínimo de zoom de 50X.
3. Selecione o modo 'digitalização rápida'.
4. Ajuste o foco no modo grosseiro até que um foco áspero seja adquirido.
5. Ajuste o estágio manualmente usando os botões externos para que a região de interesse seja visível no visor.
6. Aumente o nível de ampliação até que o recurso desejado seja observado. Ajuste o botão de foco grosseiro para focar aproximadamente a imagem nesta ampliação. Em seguida, melhore o foco usando o botão de foco fino para obter uma imagem focada no nível de ampliação desejado. Esta etapa será repetida sempre que o nível de ampliação for aumentado.
7. Uma vez alcançada a ampliação desejada, ajuste o botão de foco fino para melhorar a clareza.
8. Para otimizar a clareza da imagem, aumente a ampliação perto do nível máximo e, em seguida, concentre a imagem usando o botão de foco fino. Se uma imagem clara não puder ser obtida, ajuste a estigma na direção x e y. Continue ajustando o foco e as estigmas até que a imagem mais clara seja obtida no nível exagerado de ampliação.
9. Depois de atingir uma imagem de qualidade da amostra, volte ao nível de ampliação desejado. A imagem pode ser tirada pressionando o botão de foto no modo 'foto lenta' ou 'foto rápida'. O modo 'foto lenta' dá melhor qualidade e alta resolução da imagem.

4. Fazer medições usando o software SEM

1. Na lista suspensa 'Painéis', selecione 'M. Ferramentas'.
2. Várias medidas como comprimento, área e ângulo podem ser medidas diretamente no software SEM. Para realizar uma dessas medidas, clique no ícone desejado na janela M. Ferramentas.
3. Role até o local de medição na imagem SEM. As medições são feitas clicando na imagem para criar pontos de referência que serão analisados pelo software. Os pontos de dados medidos podem ser inseridos diretamente na imagem, se desejado pelo usuário.
4. As imagens são então salvas no computador.

O SEM, visto na Figura 2a,tem sido utilizado para fazer medições e adquirir fotos de amostras. A amostra consistia em sal de cloreto de sódio (NaCl). Foi colocado no stub como visto na Figura 2b, em seguida, alguns nanômetros de ouro foi sputtered sobre ele para torná-lo condutivo. A amostra condutora foi então colocada na área amostral SEM, conforme visto na Figura 2c.

As imagens SEM foram obtidas nos níveis de ampliação 50X, 200X, 500X, 1.000X e 5.000X, como visto na Figura 3. A Figura 3a mostra uma visão olho-de-pássaro da amostra de sal na ampliação de 50X. A Figura 3b então se aproxima de uma partícula de sal individual em uma ampliação de 200X. A Figura 3c mostra este mesmo nível de ampliação, mas inclui medições de área e diâmetro feitas dentro do software SEM. A figura 3d então amplia para 500X, mostrando a área de interesse na partícula de sal. A Figura 3e mostra uma ampliação de 1.000X, permitindo observar o canto da partícula de sal que foi danificada. A Figura 3f mostra uma ampliação de 5.000X, permitindo que o usuário visualize a estrutura da partícula salgada.

Figura 2. a Imagem de SEM. (b) Sal naCl colocado na amostra com fita de carbono. c Amostragem colocada em fase amostral SEM após ser tratada com revestimento dourado.

Figura 3. Imagens SEM da amostra em vários níveis de ampliação: (a) 50X, (b) 200X, (c) 200X com medições, (d) 500X, (e) 1.000X e (f) 5.000X.

O SEM é uma ferramenta muito poderosa que é comum na maioria das instituições de pesquisa por causa de sua capacidade de imagem de qualquer objeto que seja condutor, ou tenha sido tratado com um revestimento condutor. O SEM tem sido utilizado para imagens de objetos como dispositivos semicondutores,² membranas biológicas,³ e insetos,⁴ entre outros. Também utilizamos o SEM para analisar nanofibras e materiais à base de papel, biomateriais, estruturas micropatteradas. Claro, existem materiais, como líquidos, que não podem ser colocados em um SEM padrão para imagem, mas o desenvolvimento contínuo de microscópios eletrônicos de varredura ambiental (ESEM) permite tal funcionalidade. ESEM é semelhante ao SEM na qual usa uma arma eletrônica e analisa a interação eletrônica com a amostra. A principal diferença é que o ESEM é dividido em duas câmaras separadas. A câmara superior consiste na arma eletrônica e entra em um estado de alto vácuo, enquanto a câmara inferior contém a amostra e entra em um estado de alta pressão. Como a área da amostra não precisa entrar em um vácuo, amostras molhadas ou biológicas podem ser usadas durante o processo de imagem. Outro benefício do ESEM é que a amostra não precisa ser revestida com material condutor. No entanto, o ESEM tem algumas desvantagens de baixo contraste de imagem e pequena distância de trabalho devido ao ambiente gasoso na câmara amostral. . A regra geral é que se você for capaz de revestir uma amostra com uma camada condutora, ela pode ser imageda em um SEM, permitindo que quase todos os objetos sólidos sejam analisados.

1. Goldstein, J., Newbury, D., Joy, D., Lyman, C., Echlin, P., Lifshin, E., Sawyer, L., Michael, J. Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis. 3^rd Ed. Springer, New York, NY. (2003).
2. Purandare, S., Gomez, E.F., Steckl, A.J. High brightness phosphorescent organic light emitting diodes on transparent and flexible cellulose films. Nanotechnology. 25, 094012 (2014).
3. Masuda, Y., Yamanaka, N., Ishikawa, A., Kataoka, M., Aral, T., Wakamatsu, K., Kuwahara, N., Nagahama, K., Ichikawa, K., Shimizu, A. Glomerular basement membrane injuries in IgA nephropathy evaluated by double immunostaining for a5(IV) and a2(IV) chains of type IV collagen and low-vacuum scanning electron microscopy. Clinical and Experimental Nephrology. 1-9. (2014).
4. Kang, J.H., Lee, Y.J., Oh, B.K., Lee, S.K. Hyun, B.R. Lee, B.W, Choi, Y.G., Nam, K.S., Lim, J.D. Microstructure of the water spider (Argyroneta aquatic) using the scanning electron microscope Journal of Asia-Pacific Biodiversity. 7 484-488 (2014).

Nenhum conflito de interesses declarado.