Curvas de calibração

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

As curvas de calibração são usadas para entender a resposta instrumental a um analito e prever a concentração em uma amostra desconhecida. Geralmente, um conjunto de amostras padrão são feitas em várias concentrações com uma faixa que inclui o desconhecido de interesse e a resposta instrumental em cada concentração é registrada. Para obter mais precisão e entender o erro, a resposta em cada concentração pode ser repetida para que uma barra de erro seja obtida. Os dados são então adequados com uma função para que concentrações desconhecidas possam ser previstas. Normalmente a resposta é linear, no entanto, uma curva pode ser feita com outras funções, desde que a função seja conhecida. A curva de calibração pode ser usada para calcular o limite de detecção e limite de quantitação.

Ao fazer soluções para uma curva de calibração, cada solução pode ser feita separadamente. No entanto, isso pode levar muito material inicial e ser demorado. Outro método para fazer muitas concentrações diferentes de uma solução é usar diluições seriais. Com diluições seriais, uma amostra concentrada é diluída de forma stepwise para fazer concentrações mais baixas. A próxima amostra é feita a partir da diluição anterior, e o fator de diluição é muitas vezes mantido constante. A vantagem é que apenas uma solução inicial é necessária. A desvantagem é que quaisquer erros na criação de soluções — pipetação, massing, etc.— são propagados à medida que mais soluções são feitas. Assim, deve-se tomar cuidado ao fazer a solução inicial.

Curvas de calibração podem ser usadas para prever a concentração de uma amostra desconhecida. Para ser completamente preciso, as amostras padrão devem ser executadas na mesma matriz da amostra desconhecida. Uma matriz amostral são os componentes da amostra que não o analito de interesse, incluindo o solvente e todos os sais, proteínas, íons metálicos, etc. que podem estar presentes na amostra. Na prática, a execução de amostras de calibração na mesma matriz do desconhecido às vezes é difícil, pois a amostra desconhecida pode ser de uma amostra biológica ou ambiental complexa. Assim, muitas curvas de calibração são feitas em uma matriz amostral que aproxima de perto a amostra real, como fluido espinhal cerebral artificial ou urina artificial, mas pode não ser exato. A faixa de concentrações da curva de calibração deve ser aquessalta na amostra desconhecida esperada. O ideal é medir algumas concentrações acima e abaixo da amostra de concentração esperada.

Muitas curvas de calibração são lineares e podem ser encaixados com a equação básica y=mx+b, onde m é a inclinação e b é o y-intercept. No entanto, nem todas as curvas são lineares e às vezes para obter uma linha, um ou ambos os conjuntos de eixos estarão em uma escala logarítmica. A regressão linear é normalmente realizada usando um programa de computador e o método mais comum é usar um ajuste de menos quadrados. Com uma análise de regressão linear, é dado um valor R^2, chamado de coeficiente de determinação. Para uma simples regressão única, R² é o quadrado do coeficiente de correlação (r) e fornece informações sobre quão distantes os valores y estão da linha prevista. Uma linha perfeita teria um valor R² de 1, e a maioria dos valores R² para curvas de calibração são superiores a 0,95. Quando a curva de calibração é linear, a inclinação é uma medida de sensibilidade: o quanto o sinal muda para uma mudança na concentração. Uma linha mais íngreme com uma inclinação maior indica uma medição mais sensível. Uma curva de calibração também pode ajudar a definir a faixa linear, a faixa de concentrações que o instrumento dá uma resposta linear. Fora deste intervalo, a resposta pode diminuir devido a considerações instrumentais, e a equação da calibração não pode ser usada. Isso é conhecido como o limite da linearidade.

O limite de detecção é a menor quantidade que pode ser estatisticamente determinada a partir do ruído. Geralmente isso é definido como um sinal que é 3 vezes o ruído. O limite de detecção pode ser calculado a partir da inclinação da curva de calibração e é geralmente definido como LOD=3*S.D./m, onde S.D. é o desvio padrão do ruído. O ruído é medido tomando o desvio padrão de múltiplas medidas. Alternativamente, em um traço, o ruído pode ser estimado como o desvio padrão da linha de base. O limite de quantitação é a quantidade que pode ser diferenciada entre as amostras e geralmente é definida como 10 vezes o ruído.

1. Fazendo os Padrões: Diluições seriais

1. Faça uma solução concentrada de estoque do padrão. Normalmente, o composto é pesado com precisão e, em seguida, transferido quantitativamente para um frasco volumoso. Adicione algum solvente, misture para que a amostra se dissolva e, em seguida, encha a linha com o solvente adequado.
2. Realizar diluições seriais. Pegue outro frasco volumoso e pipeta a quantidade de padrão necessária para a diluição, em seguida, encha a linha com solvente e misture. Uma diluição de dez vezes é tipicamente feita, por isso para um frasco volumoso de 10 mL, adicione 1 mL da diluição anterior.
3. Continue conforme necessário para mais diluições, pipetando da solução anterior para diluí-la para fazer a próxima amostra. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.

2. Execute as amostras para a Curva de Calibração e a Desconhecida

1. Execute as amostras com o espectrômetro UV-Vis para determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.
2. Faça a leitura com a primeira amostra. É uma boa ideia executar as amostras em ordem aleatória ( ouseja, não mais alta para menor ou mais baixa para alta) no caso de haver algum erro sistemático. Para obter uma estimativa de ruído, repita a leitura em qualquer amostra 3-5x.
3. Execute as amostras padrão adicionais, repetindo as medidas para cada amostra para obter uma estimativa de ruído. Registo os dados para fazer um plot posterior.
4. Execute a amostra desconhecida( s). Use condições semelhantes para executar as normas possível. Assim, a matriz amostral ou tampão deve ser o mesmo, o pH deve ser o mesmo, e a concentração deve estar na faixa das normas executadas.

3. Fazendo a curva de calibração

1. Registo os dados em uma planilha e use um programa de computador para traçar os dados versus concentração. Se pelo menos medidas triplicadas forem tomadas para cada ponto, as barras de erro podem ser traçadas do desvio padrão dessas medidas para estimar o erro de cada ponto. Para algumas curvas, os dados podem precisar ser plotados com um eixo como um tronco para obter uma linha. A equação que rege a curva de calibração é geralmente conhecida antes do tempo, de modo que um plot de log é usado quando há um registro na equação.
2. Examine a curva de calibração. Parece linear? Tem uma porção que parece não linear ( ouseja, atingiu o limite da resposta instrumental)? Para verificar, encaixe todos os dados para uma regressão linear usando o software. Se o coeficiente de determinação (R²) não for alto, remova alguns dos pontos no início ou final da curva que não parecem se encaixar na linha e realize novamente a regressão linear. Não é aceitável remover pontos no meio só porque eles têm uma grande barra de erro. A partir desta análise, decida qual parte da curva é linear.
3. A saída do linear deve ser uma equação do formato y=mx+b, onde m é a inclinação e b é o y-intercept. As unidades para a inclinação são a unidade/concentração do eixo y, neste exemplo (Figura 1) absorção/μM. As unidades para a interceptação y são as unidades do eixo Y. Um coeficiente de determinação (R²) é obtido. Quanto maior o R^2, melhor o ajuste; um ajuste perfeito dá um R² de 1. O programa também pode ser capaz de dar uma estimativa do erro na encosta e na interceptação.

4. Resultados: Curva de Calibração da Absorvância de Corante Azul #1

1. A curva de calibração para absorção de #1 de corante azul (a 631 nm) é mostrada abaixo(Figura 1). A resposta é linear de 0 a 10 μM. Acima dessa concentração o sinal começa a nivelar porque a resposta está fora da faixa linear do espectrofotômetro UV-Vis.
2. Calcule o LOD. Da inclinação da curva de calibração, o LOD é de 3*S.D. (ruído)/m. Para esta curva de calibração, o ruído foi obtido tomando um desvio padrão de medições repetidas e foi de 0,021. O LOD seria de 3*0,021/.109=0,58 μM.
3. Calcule o LOQ. O LOQ é 10*S.D.(ruído)/m. Para esta curva de calibração, LOQ é 10 * 0,021/.109 =1,93 μM.
4. Calcule a concentração do desconhecido. Use a equação da linha para calcular a concentração da amostra desconhecida. A curva de calibração só é válida se o desconhecido cair na faixa linear das amostras padrão. Se as leituras forem muito altas, a diluição pode ser necessária. Neste exemplo, a bebida esportiva desconhecida foi diluída 1:1. A absorvância foi de 0,243 e isso correspondeu a uma concentração de 2,02 μM. Assim, a concentração final de corante azul #1 na bebida esportiva foi de 4,04 μM.

Figura 1. Curvas de calibração para absorvância UV-Vis de corante azul. Esquerda: A absorvância foi medida de diferentes concentrações de corante azul #1. As respostas se nivelam após 10 μM, quando a absorvância for superior a 1. As barras de erro são de medidas repetidas da mesma amostra e são desvios padrão. Certo: A porção linear da curva de calibração é encaixada com uma linha, y=0,109 * x + 0,0286. Os dados desconhecidos são mostrados em preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As curvas de calibração são usadas em muitos campos de química analítica, bioquímica e química farmacêutica. É comum usá-los com medições de espectroscopia, cromatografia e eletroquímica. Uma curva de calibração pode ser usada para entender a concentração de um poluente ambiental em uma amostra de solo. Pode ser usado para determinar a concentração de um neurotransmissor em uma amostra de fluido cerebral, vitamina em amostras farmacêuticas ou cafeína em alimentos. Assim, as curvas de calibração são úteis em aplicações ambientais, biológicas, farmacêuticas e de ciências alimentares. A parte mais importante de fazer uma curva de calibração é fazer amostras padrão precisas que estão em uma matriz que se aproxima de perto da mistura de amostras.

Um exemplo de curva de calibração eletroquímica é mostrado abaixo(Figura 2). Os dados foram coletados com um eletrodo seletivo de íons para flúor. Os dados eletroquímicos seguem a equação Nernst E=E⁰ + 2,03*R*T/(nF) * log C. Assim, os dados de concentração (x-eixo) devem ser plotados em uma escala de log para obter uma linha. Esta curva de calibração poderia ser usada para medir a concentração de flúor em pasta de dente ou água potável.

Figura 2. Curva de calibração para um eletrodo seletivo de íons. A resposta de um eletrodo seletivo de flúor (em mV) a diferentes concentrações de flúor é traçada. A equação esperada para a resposta do eletrodo é y (em mV)=-59,2 * log x+b a 25 °C. A equação real é y=-57.4 * log x +56.38. O valor de R² é de 0,998. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.