Fluorescência de raios X (XRF)

Fonte: Laboratório da Dra.

Fluorescência de raios-X é uma radiação induzida e emitida que pode ser usada para gerar informações espectroscópicas. A microscopia de fluorescência de raios-X é uma técnica de imagem não destrutiva que usa a emissão de fluorescência induzida de metais para identificar e quantificar sua distribuição espacial.

Primeiro, devem ser preparadas amostras finas, planas e secas (a menos que um estágio criogênico especial esteja disponível para o microscópio). Em seguida, um feixe de raio-X monocromático focado é escaneado rasterizado através da amostra. O feixe de raios-X supera a energia de ligação de alguns dos elétrons da camada interna aos átomos metálicos, e quando elétrons de camada externa caem nessas vagas, um segundo raio-X é emitido pela amostra. Em cada ponto deste raster-scan, um espectro de emissão de fluorescência de raios-X é coletado pelo detector.

Neste espectro, é registrado o comprimento de onda e intensidade de todos os raios-X emitidos pela amostra. Com base na energia característica (devido ao espaçamento dos orbitais no átomo) da fluorescência emitida e na intensidade relativa característica dos picos K_α e K_β (por exemplo, ambos conhecidos), o espectro de emissões pode ser usado para determinar tanto a identidade dos metais presentes quanto a quantidade.

Este vídeo explicará o processo de preparação de uma amostra fina e seca de células aderentes adequadas para a imagem de fluorescência. O processo de digitalização das amostras será explicado brevemente, e uma imagem de exemplo descrita.

1. Preparando as janelas de nitreto de silício

1. Use pinças inversas para pegar uma janela (janelas de nitreto de silício se quebrarão se cairem).
2. Coloque a janela em um deslizamento de vidro, lado plano para cima.
3. Adere pequenos pedaços de fita adesiva aos lados da janela, e use-os para aderir as janelas ao fundo do prato de cultura.
4. Esterilize as janelas em pratos de cultura com radiação UV. Isso pode ser feito com a configuração de auto-crosslink em um gabinete UV-crosslinking, seguido de mais irradiação UV sob a lâmpada UV no capô de fluxo laminar por cerca de 1 h.

2. Emplacando as células nas janelas de nitreto de silício esterilizado

1. Segure o prato com ele inclinado em cerca de um ângulo de 45°.
2. Adicione mídia ao pipetar em direção ao lado do prato e lentamente alivie o ângulo de inclinação para revestir a janela com mídia.
3. Adicione células ao prato de cultura, da mesma forma, e incubar.
4. Observe as células ocasionalmente usando um microscópio leve para determinar quando elas estão prontas para uso.

3. Fixação e Secagem de Células

1. Em um capô de fluxo laminar, remova a mídia por aspiração suave enquanto inclina o prato como descrito acima.
2. Adicione PBS, pipetando em direção ao lado do prato enquanto segura-o no ângulo. Alivie lentamente o ângulo de inclinação para revestir a janela com PBS.
3. Remova o PBS com aspiração suave.
4. Pipetando em direção ao lado do prato, e segurando-o em um ângulo, adicione 4% PFA/PBS, pH 7 para cobrir as células. Mantenha nesta solução por 20 minutos em temperatura ambiente.
5. Remova a mistura PFA/PBS e descarte como material perigoso.
6. Adicione PBS, pipetando conforme descrito acima.
7. Repita as etapas 3.5 e 3.6 duas vezes.
8. Remova o PBS por aspiração suave.
9. Adicione 20 mM PIPES, 200 mM de sacarose, pH 7.
10. Remova o PIPES/sacarose por aspiração suave.
11. Repita as etapas 2.8 e 2.9 duas vezes.
12. Limpe rapidamente as bordas e o recuo da janela com um Kimwipe, em seguida, coloque a janela em uma superfície limpa, como um tapete de grade de borracha, para secar.

4. Imagem de Fluorescência de Raios-X das Células

1. Uma vez que a amostra esteja seca, verifique a presença de células nas janelas usando um microscópio leve.
2. Use esmalte para fixar as janelas em um suporte de alumínio fornecido pela linha de vigas.
3. Insira o suporte de alumínio em um suporte cinemático e, em seguida, coloque-o em posição no ponto focal da óptica no microscópio de raios-X, e em um ângulo de cerca de 45° para o feixe de raios-X incidente, montado para os estágios de nanoposicionamento da amostra.
4. Saia da área do instrumento do microscópio de raios-X (geralmente uma cabana feita de paredes de chumbo) e abra o obturador. Conduza as etapas restantes remotamente.
5. Usando uma placa de zona, ou espelhos Kirkpatrick-Baez, concentre o feixe de raios-X monocromático (geralmente 10 keV em energia) até um tamanho de ponto de sub-mícnico.
6. Usando os estágios da amostra de nanoposicionamento e visualizando a posição do feixe de raios-X na amostra com uma câmera cintilante pré-calibrada a jusante, determine a largura e altura apropriadas do raster scan para capturar dados da amostra.
7. Com o detector de deriva de silício dispersivo de comprimento de onda a 90° para o feixe de incidente, e cerca de 3 mm ou menos da amostra, colete um espectro de teste com um tempo de 1 a 2 segundos.
8. Visualizando o espectro de teste, escolha um tempo de moradia adequado para a varredura, para fornecer sinal-a-ruído suficiente para os elementos de interesse.
9. Escolha uma resolução apropriada para a digitalização, que não seja significativamente menor do que o tamanho do feixe na amostra, nem maior do que as características de interesse da amostra.
10. Programe a varredura no software de digitalização e colete a imagem.

O mapa de fluorescência de raios-X de uma célula aderente é mostrado na Figura 1. Cada painel mostra a distribuição de um determinado elemento (por exemplo, cobre, ferro, zinco, etc) sobre a célula. O painel intitulado "s_a" mostra a absorção de raios-X.

Figura 1. Mapa de fluorescência de raios-X de uma célula aderente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A imagem de fluorescência de raios-X pode ser uma ferramenta útil em muitos campos, incluindo geociências, ciência forense, ciência dos materiais, biologia e até mesmo no estudo de nosso patrimônio cultural. Na ciência dos materiais, pode ajudar a encontrar defeitos em chips e catalisadores feitos com metais. No trabalho do patrimônio cultural, tem sido usado para identificar metais venenosos nos cabelos de pessoas mortas famosas (por exemplo, Beethoven), e para identificar a fonte de tintas usadas na arte. Em biologia, é usado para estudar os metais naturais que realizam importantes bioquímicas. Em geociências, é frequentemente usado para estudar eventos narrados no disco de rock. Duas características particulares que tornam a imagem de fluorescência de raios-X útil em tantos campos são 1) suas não destrutivas, tantos itens que são raros, ou de alto valor podem ser imagens, e 2) enquanto a preparação da amostra descrita aqui para células é complexa — porque as células devem ser secas para muitos materiais, como rochas, arte ou outros itens, há muito pouca preparação amostral necessária, além de ser plana e livre de poeira. Embora seja necessário um síncrotron que seja melhor acessado através da colaboração com cientistas nessas instalações, a técnica pode ser muito acessível.