Cromatografia de troca iônica

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

Cromatografia de troca de íons é um tipo de cromatografia que separa analitos com base na carga. Uma coluna é usada que é preenchida com uma fase estacionária carregada em um suporte sólido, chamada de resina de troca de íons. A cromatografia forte de troca de cations separa preferencialmente os ceados usando uma resina carregada negativamente, enquanto a cromatografia forte de troca de ânions seleciona preferencialmente os ânions usando uma resina carregada positivamente. Esse tipo de cromatografia é popular para a preparação da amostra, por exemplo, na limpeza de proteínas ou amostras de ácido nucleico.

Cromatografia de troca de íons é um processo de duas etapas. Na primeira etapa, a amostra é carregada na coluna em um buffer de carregamento. A vinculação da amostra carregada à resina da coluna baseia-se em interações iônicas da resina para atrair a amostra da carga oposta. Assim, amostras carregadas de polaridade oposta à resina estão fortemente ligadas. Outras moléculas que não são carregadas ou são da carga oposta não estão ligadas e são lavadas através da coluna. O segundo passo é elutar o analito que está ligado à resina. Isso é feito com um gradiente de sal, onde a quantidade de sal no tampão é lentamente aumentada. As frações são coletadas no final da coluna à medida que ocorre a elução e a amostra purificada de interesse pode ser recuperada em uma dessas frações. Outra técnica, como a espectroscopia, pode ser necessária para identificar qual fração contém a amostra. A cromatografia de troca de íons é especialmente útil em estudos proteicos, para isolar proteínas de interesse que tenham uma carga ou tamanho específicos, pois o tamanho pode determinar o número de interações com a resina.

Cromatografia de troca de íons é uma técnica de separação mais geral do que a cromatografia de afinidade, que também é frequentemente usada no preparo de amostras proteicas, onde um anticorpo é anexado a uma coluna para ligar um analito específico. Uma nova coluna de afinidade deve ser comprada para cada analito, enquanto o mesmo tipo de coluna de troca de íons, muitas vezes com diferentes condições de eluição, pode ser usado para limpar muitas proteínas da mesma carga. A cromatografia de troca de íons também pode ser usada em conjunto com outros tipos de cromatografia que se separam com base em outras propriedades. Por exemplo, a cromatografia de exclusão de tamanho separa-se com base no tamanho e poderia ser usada antes da cromatografia de troca de íons para escolher compostos de apenas um determinado tamanho.

A cromatografia de troca de íons é regida pelos princípios das interações químicas iônicas que levam à adsorção reversível do analito na fase estacionária. A força da ligação entre a amostra e o suporte sólido é regida pelo número e tipos de grupos funcionais na amostra e na resina. O tampão de carga geralmente tem baixa condutividade, a fim de promover interações entre a amostra e a resina. Resinas de troca de cation forte normalmente apresentam grupos funcionais de ácido sulfônico, enquanto resinas fracas de troca de cáção têm ácidos carboxílicos. Resinas de troca aniônica forte contêm aminas quaternárias, enquanto resinas fracas de troca de ânion apresentam aminas secundárias ou terciárias. Os termos fortes e fracos referem-se às propriedades ácido/base do material da coluna e não quão bem ele liga um analito. Resinas fracas são carregadas sobre uma faixa de pH menor do que resinas fortes, mas ainda ligam os analitos de forma muito eficaz, e podem ser uma boa escolha se forem carregadas na faixa de pH necessária. Antes do uso, as colunas de troca de íons são equilibradas em um pH usando um buffer de equilíbrio.

Para elutar a amostra de interesse, é usado um gradiente de sal. Amostras que estão menos firmemente ligadas à resina irão elute primeiro, pois o sal irá mais facilmente perturbar sua ligação iônica com a coluna. Amostras mais apertadas se estotarão mais tarde, quando forem utilizadas maiores quantidades de sal. Normalmente, é usado um gradiente linear de sal, onde a concentração de sal aumenta ao longo do tempo de forma linear. No entanto, gradientes de passo também podem ser usados onde a concentração de sal é intensificada ao longo do tempo.

Uma consideração importante para experimentos de troca de íons é o pH dos buffers. O pH precisa ser mantido para que o analito de juros seja cobrado e se ligue à resina. Para proteínas, a carga é baseada no ponto isoelétrico da proteína, onde a proteína é carregada neutramente, e medida como i PEI. O pH em comparação com a proteína pI fornece informações sobre a carga de proteína esperada. Na cromatografia de troca de cáation, o aumento do pH fará com que o analito seja menos carregado positivamente e menos propenso a interagir com a resina negativamente carregada. Da mesma forma, na cromatografia de troca de anion, a redução do pH fará com que o analito seja menos carregado negativamente e menos propenso a interagir com a resina positivamente carregada. Assim, ajustes de pH também podem ser usados para elute seletivamente analitos da coluna. O uso de ajustes de pH em vez de sais poderia ser vantajoso para separar dois tipos diferentes de proteínas com diferentes valores de II.

1. Preparando a Amostra e a Coluna

1. Nesta demonstração, uma mistura de 2 proteínas será separada em uma coluna de troca de cáation: hemoglobina e citocromo C. Adicione 0,2 mL tampão de equilíbrio (pH 8.1) à amostra de proteína e vórtice para misturar completamente. Centrifuga por 2 minutos para remover qualquer espuma.
2. Coloque a coluna de troca de cation em um tubo de ensaio por 5 minutos para permitir que a resina se instale. Aperte o tubo de ensaio com a coluna em um suporte de anel para ter certeza de que está ereto.
3. Abra a tampa superior da coluna e, em seguida, a tampa inferior. Deixe o buffer na coluna escorrer sob gravidade para o tubo de ensaio.
4. Lave a coluna duas vezes com um volume de coluna (neste caso, o volume da coluna é de 0,3 mL) de tampão de equilíbrio. Deixe que o primeiro volume de coluna (0,3 mL) do tampão de equilíbrio escorra no frasco de resíduos antes de adicionar o segundo volume de coluna. Esta etapa permite que a coluna equilibre com o buffer de equilíbrio. Adicione o tampão de equilíbrio lentamente nesta etapa para não perturbar a resina.

2. Executando uma amostra de proteína através de uma coluna de troca de cation

1. Coloque a coluna em um tubo de centrífugas de 2 mL rotulado como "Unbound 1". Carregue cuidadosamente 0,1 mL da amostra de proteína na parte superior da coluna.
2. Uma vez que a amostra tenha sido carregada na parte superior da coluna, lave-a com 0,3 mL de tampão de equilíbrio adicionando o buffer na parte superior da coluna e permitindo que ela escorra por todo o caminho. Repita esta etapa 4x (para um total de 5 lavagens) e colete cada lavagem em um tubo de centrífuga separado de 2 mL. Rotule os tubos como "Unbound 1-5".
3. Para as últimas 2 lavagens, centrífuga por 10 s a 1.000 x g para garantir que todas as espécies desvinculas saiam da coluna. Qualquer amostra que se ligue à coluna não deve estar nestas lavagens, mas a amostra que não se ligar será lavada sem ser retida. A centrifugação fornece mais força para lavar materiais não vinculados da coluna.
4. Coloque a coluna em um novo tubo de coleção de centrífugas de 2 mL rotulado como "Bound 1". Coloque 0,3 mL de tampão de eluição (sal alto, pH 5,5) em cima da coluna. Centrifugar o eluente resultante para 10 s a 1.000 x g.
5. Repita a etapa de eluição mais 2 vezes colocando a coluna em um novo tubo de centrífuga, adicionando 0,3 mL e centrifugando para 10 s. Rotule estes "Bound 2 e 3".
6. Regisso regissão qualquer alteração de cor ou observações sobre as frações. A hemoglobina é uma proteína colorida que parece marrom-avermelhada, enquanto o citocromo C é de cor avermelhada.

3. Resultados: Cation-troca de Hemoglobina e Citocromo C

1. Cytochrome C tem um iPI de 10,5 e hemoglobina um iPI de 6,8. Assim, quando um tampão de equilíbrio pH 8.1 é usado, a hemoglobina não se liga à coluna porque é carregada negativamente. O Citocromo C é carregado positivamente neste pH e se liga à coluna porque o pH < pI.
2. A hemoglobina é observada nas frações não ligadas porque não está ligada à coluna.
3. O citocromo C é observado em frações vinculadas, porque estava ligado à coluna de troca de delitos.

Figura 1. Imagem de fração desvinculada (hemoglobina) e fração amarrada (citocromo C).

A cromatografia de troca de íons é amplamente utilizada na bioquímica para isolar e purificar amostras de proteínas. As proteínas têm muitos aminoácidos com grupos funcionais que são carregados. As proteínas são separadas com base na carga líquida, que depende do pH. Algumas proteínas são mais positivamente carregadas, enquanto outras são mais carregadas negativamente. Além disso, as etiquetas de peptídeos podem ser geneticamente adicionadas a uma proteína para dar-lhe um ponto isoelétrico que não está na gama de proteínas normais, tornando possível separar completamente. A cromatografia de troca de íons é útil para separar complexos proteicos multimédicos, pois diferentes configurações teriam diferentes quantidades de carga e diferentes interações.

Outra grande aplicação da cromatografia de troca de íons é a análise da água. A cromatografia de troca de ânion pode ser usada para medir a concentração de ânions, incluindo sulfatos, nitratos, nitritos, flúor e cloreto. A cromatografia de troca de cá de cáção é usada para medir a concentração de cáções como sódio, potássio, cálcio e magnésio. Um tipo de cromatografia de troca de íons também é usado na purificação da água, pois a maioria dos amaciantes filtram íons de magnésio e cálcio em água dura, vinculando-os a uma resina, que libera sódio vinculado. Metais pesados, como cobre ou chumbo, também podem ser removidos da água usando cromatografia de troca de íons.

A cromatografia de troca de íons também é útil na purificação metálica. Pode ser usado para purificar actanides, como plutônio, e removê-lo de barras de combustível de reator nuclear gastas. Também pode ser usado para recolher urânio e removê-lo da água ou outras amostras ambientais.