Os autores reconhecem o financiamento do NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).

1. Preparação de Meios (Figura 1, Passo 1) <ol><li> Fatia Meio de Cultura <ol><li> 25 ml de meio de cultura fatia é suficiente para preparar pratos de fundo 5 de vidro com 2 fatias por bem. </li><li> Num tubo de 50 ml, adicionar 250 mL de uma solução de N2 100x e 500 ul de uma solução 50x B27 sem vitamina A. Adicione DMEM/F12 a um volume de 22,5 ml. </li><li> Filtro esterilizar solução e posteriormente adicionar 1,25 ml de soro de cavalo inactivado pelo calor e de 1,25 ml de soro fetal bovino. </li><li> Incubar solução em um banho de água a 37 ° C durante o tempo de preparação das fatias. </li><li> Adicionar os factores de crescimento (FGF e EGF, concentração final de 10 ng / ml e 20 ng / ml, respectivamente), imediatamente antes do início da cultura. A composição deste meio foi optimizada para promover a sobrevivência de células em cultura e para aumentar a taxa de proliferação de células progenitoras neurais. Isto irá, portanto, maximizar a probabilidade deobservar células mitóticas na fatia. </li></ol></li><li> Solução Dissection HBSS completa <ol><li> Preparar 500 ml de HBSS completo por adição de 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de Hepes 1 M (pH 7,4, 2,5 mM de FC), 6 ml de 2,5 M de D-Glucose (FC 30 mM), 2,2 ml de 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) e autoclavados DiH 2 O para um volume final de 500 ml. </li><li> Filtrar a solução de esterilizar e armazenar a 4 ° C, até a recolha de cornos uterinos do ratinho grávida. Esta solução pode ser mantida a 4 ° C por semana. </li><li> Mantenha a HBSS em gelo durante o procedimento de dissecção todo. </li></ol></li><li> Solução Incorporação <ol><li> Para a incorporação de quatro cérebros embrionárias, preparar 30 ml de 3% de agarose de baixa fusão na solução completa HBSS. Num tubo de 50 mL cónico, adicionar 0,9 g de agarose de baixo ponto de fusão e cheio de HBSS a 30 ml. </li><li> Misturar a solução com um misturador de vórtice, e derreter no microondas com a posição do tubo ea tampa aberta. </li><li> Enquanto no forno de microondas, monitorar a solução para pestouro revent devido à ebulição excessiva. Quando ferver começa, pare o microondas e vortex a solução. </li><li> Repita essas etapas até que todo o agarose derreteu. </li><li> Armazenar o tubo em banho-maria a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção do Embriões (Figura 1, Passo 2) <ol><li> Após a eutanásia cuidado com o mouse grávida, recolher os cornos uterinos e transferi-los para um prato de 10 cm2 Petri contendo frio completo 1x HBSS. A idade do embrião pode variar, dependendo do estudo. Este protocolo tem sido usado com sucesso para a cultura fatias de cérebro de dias embrionárias E12.5 a E17.5. Devido ao seu tamanho, os cérebros mais novas tendem a ser mais difícil de trabalhar com ele. </li><li> Recolher os embriões e dissecar os cérebros embrionários, como descrito anteriormente no rato e no ratinho 26,27, até um cérebro embrionário completo, incluindo o cérebro posterior e o cérebro anterior com os dois hemisférios cerebrais é obtido. Estes podem sermantidos à temperatura ambiente até todos os cérebros foram dissecados. </li><li> Recolher os embriões e dissecar os cérebros embrionários, como descrito anteriormente no rato e no ratinho 26,27, até um cérebro embrionário completo, incluindo o cérebro posterior e o cérebro anterior com os dois hemisférios cerebrais é obtido. Estes podem ser mantidos à temperatura ambiente até que todos os cérebros foram dissecados. </li></ol> 3. Incorporação dos cérebros embrionários (Figura 1, Passo 3) <ol><li> Em um balde contendo gelo, criar um buraco no gelo para inserir os moldes de incorporação em. </li><li> Verter o meio de agarose a 3% dentro de um molde de plástico e colocá que o molde para o furo preparado no gelo. </li><li> Agita-se o meio de agarose, com a ponta de um termómetro digital, até que a temperatura atinja 35 ° C. </li><li> Prontamente transferir o cérebro no meio de incorporação. </li><li> Passo Crítico: Para remover o excesso de HBSS na interface entre o cérebro eo agarose, com cuidado e secar delicadamente / girar o cérebro repetidamentena solução de incorporação com a pinça. </li><li> A almofada de agarose gelificada irá formar na parte inferior do molde em contacto com o gelo. Uma vez que a almofada pode ser sentida com a ponta do fórceps agitando o cérebro, posicionar o cérebro com o lado dorsal para cima. O cérebro não deve afundar até o fundo do molde. </li></ol> 4. Preparação de agarose bloco (Figura 1, Passo 4) <ol><li> Deixe que a agarose endureça no gelo durante pelo menos 5 min. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, a secção dos cantos do molde. </li><li> Esculpir cuidadosamente um bloco de agarose ao redor do cérebro usando uma lâmina de barbear. Tente minimizar o número de cortes para evitar perturbar o cérebro incorporado. </li><li> Certifique-se de que o bloco tem uma maior área de superfície da região caudal do cérebro (versus a região rostral, ver Figura 1, Passo 4) para aumentar a estabilidade do bloco sobre o pedestal de seccionamento. </li><li> O último corte deve ser o único no lado caudal do cérebro;este corte irá definir o plano de corte correto com o vibratome. </li><li> Fazê-lo através do alinhamento da lâmina perpendicular ao eixo rostro-caudal do cérebro e o bloco de agarose. Deslize para baixo a lâmina caudal ao longo do eixo rostro-caudal e fazer o corte final de cerca de 5 mm da região mais caudal do cérebro. </li><li> Definir o bloco de agarose / cérebro de lado e repita a incorporação de outros cérebros. </li></ol> 5. Transferência dos Brains incorporados na Bandeja do Vibratome (Figura 1, Passo 5) <ol><li> Adicionar uma gota de cola na parte inferior da bandeja de vibratome. Coloque cola de modo a que os blocos de agarose será posicionada dentro do alcance da lâmina vibrante. </li><li> Coloque bloco de agarose / cérebro lado o caudal baixo na extremidade de uma espátula, com cerca de 50% do bloco de inflexão sobre a borda da espátula. </li><li> Aplicar a face caudal do bloco de agarose para a cola e deslizar a espátula de distância, mantendo-se o bloco de agarose para o fundo do tabuleiro, com a sHoulder de um par de pinças. Não deixe que a espátula contactar directamente a cola. </li><li> Deixe a cola solidificar à temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol> 6. Seccionamento dos Brains incorporados (Figura 1, Passo 6) <ol><li> Encha o tabuleiro de vibratome com HBSS. </li><li> Definir as posições de largada e chegada da lâmina vibratome. </li><li> Gerar 200-250 mM fatias. Com a vibratome VT1000s, use os seguintes parâmetros: velocidade 2-4, freqüência 8. </li><li> Retire cuidadosamente as fatias do vibratome como eles são cortados. Transfira as fatias com uma espátula e back-end de pinças em 12 pratos bem cheios de pleno HBSS. Alternativamente alguns pesquisadores têm usado um pincel em vez de pinças ponto-chave:. Durante a transferência, tome cuidado para que as fatias de cérebro permanecer ligado à agarose circundante. </li></ol> 7. Syto11 coloração das fatias (Figura 1, Passo 7) <ol><li> Diluir Syto11 para uma concentração final de0,5-1 uM em meio de cultura fatia suplementado com factores de crescimento. </li><li> No poço de uma placa de 12 poços, incubam fatias de um cérebro em 2,5 ml da solução de coloração, durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lave as fatias em 2,5 ml de meio de cultura sem fatia solução durante 20 min a coloração. </li></ol> 8. Montar as fatias em um prato fundo de vidro (Figura 1, as etapas 8, 9) <ol><li> Prepare 15 mL de solução de colágeno a incorporação por fatia. Prepara-se uma solução de 1,5 mg / ml de colagénio por mistura de 375 ul de solução de I ml de 3 mg / tipo de colagénio com 75 ul de 10x de DMEM, 9,4 mL de NaOH 1 M, e 290 mL de H 2 O. Guarde no gelo. </li><li> Colocar uma gota de 15 ul da solução de colagénio, na parte inferior de um fundo 35 mm Vidro Micropoço lavar. Espalhe-o com a ponta da pipeta para combinar com o tamanho da fatia. </li><li> Transfira a fatia na gota de colágeno com uma espátula e pinça ponto-chave:. Montagem em várias fatias diferentespratos rentes aumenta a probabilidade de adquirir fatias adequadas para a imagem latente. Tela através de diferentes fatias e selecionar aquelas que melhor atendam aos critérios descritos abaixo, na seção &quot;Resultados representativos&quot;. </li><li> Deixe as fatias incubar à TA durante 10 min antes de transferi-los para uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Após 20 min, adicionar 1,2 ml de meio de cultura fatia no fundo de vidro prato Microwell. Adicionar 600 mL de meio de cada vez e espalhá-lo com uma ponteira. </li><li> Capturar uma imagem de baixa ampliação da fatia do cérebro para registrar a nível anatômico e integridade da fatia. </li></ol> 9. Imaging ao vivo das fatias (Figura 1, as etapas 10, 11) <ol><li> Deixe as fatias de recuperar na incubadora durante pelo menos 1 hora e 30 min a 37 ° C com 5% de CO 2 antes de imagens em tempo real. </li><li> Imagem as fatias com o microscópio de escolha, tendo em mente que Syto11 é muito propenso a fotodegradação. Aqui uma inversãoted disco giratório microscópio confocal é usado (Andor XD revolução fiação confocal disco microscópio). Alternativamente um microscópio confocal de varrimento de laser pode ser usado. Os parâmetros a seguir são para o microscópio disco giratório set-up. </li><li> Durante a sessão de imagens em tempo real de todo, fatias manter a 37 ° C, 5% de CO 2, numa câmara de incubação humidif ligado ao microscópio. </li><li> Células de imagens com uma objectiva 60X de silício de óleo com uma distância de trabalho de 300 mm, e uma abertura numérica de 1,3 (para exemplos, ver as Figuras 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Um objectivo óleo 100X com uma distância de trabalho de 130 um e uma abertura numérica de 1,4 (por exemplo, ver a Figura 4C) também pode ser usado. A resolução da câmera é de 512 x 512. </li><li> Imagem as células em um z-pilha 30 um, com o centro da pilha z localizado a cerca de 40 mM ou mais abaixo da superfície da fatia. Tentando imagem mais profundamente no tecido pode causar o objectivo de adicionarpressão mecânica sobre a fatia. Isso pode afetar a integridade da fatia do cérebro. Se pretende fazer reconstruções 3D das células, usar um z-intervalo de não mais do que 2 ^ m. </li><li> Ajuste a potência do laser e tempos de exposição para limitar fotodegradação. Usar os tempos de exposição que variam entre 30 e 200 mseg, dependendo da intensidade do sinal Syto11. </li><li> Com um palco motorizado, imagem várias posições em várias fatias montado em um prato. Por exemplo, a imagem até 20 posições espalhados por 4 fatias diferentes em um único prato. </li><li> Para imagens em tempo real, utilize uma resolução temporal inferior a 5 minutos, para permitir a identificação das diferentes fases da mitose. Usando Syto11 e / ou histona H2B-EGFP, 4-5 horas de imagens ao vivo são suficientes para observar um número significativo de células mitóticas. No entanto, se a imagiologia de baixa densidade marcada células mitóticas (tais como os obtidos no útero por electroporação), em seguida, um parâmetro de tempo de imagem (durante a noite), é apropriado e que funcionall. Nota: O uso deste protocolo, que normalmente observamos em média 10 células mitóticas por posição. Como afirmado acima, múltiplos imagiologia fatias montado aumenta a probabilidade de ter uma experiência de sucesso. Com esta abordagem que normalmente identificam células mitóticas em praticamente todos os experimentos realizados com Syto11 ou histona H2B-EGFP. </li></ol> 10. Pós-aquisição Análise da mitose (Figura 2) Todos os procedimentos desta seção foram otimizados em Fiji (ImageJ), o que é vantajoso, pois é um software livre de código aberto. Outras soluções de software estão disponíveis para executar as mesmas tarefas, como Metamorph, Imaris e Amira. <ol><li> Identificação de mitótico Figuras em Fiji <ol><li> Depois de abrir o conjunto de dados para uma posição como um &quot;hyperstack&quot;, selecione um z-plano (ver Figura 2A para a localização da barra de rolagem), onde o tecido e as células parecem saudáveis ​​(ver critérios na seção de discussão).Rolar através da dimensão temporal para identificar células que atravessam a anafase, como é o mais fácil de identificar fase mitótica. </li><li> Role para trás no tempo para identificar o ponto no tempo em que a célula entra em mitose (condensação DNA). A célula pode se mover através z-aviões, mas a resolução temporal e os parâmetros z-stack descritos anteriormente foram otimizados para permitir este processo. </li><li> Numa folha de cálculo, gravar o 4D coordenadas da célula na hyperstack (X, Y, Z e tempo, ver Figura 2A para visualizar a localização destas figuras na interface Fiji) à medida que entra mitose. Conhecendo essas coordenadas impedirá contando a mesma célula várias vezes. </li><li> Vá para a frente no tempo e registrar o momento em que a célula progride de uma fase para outra. Documentar a duração de cada fase mitótica de uma dada célula. </li><li> Prossiga com outras células, em todo o conjunto de dados completo (várias células dentro e entre as posições). </li></ol></li><li> Reconstruir 3Diônica das células e quantificação de rotação Durante Metaphase (Adaptado de Haydar et al, 2003) (Figura 2B). <ol><li> Depois de ter identificado várias células mitóticas, use as coordenadas de uma célula e avançar no tempo até o início da metáfase. </li><li> Gire todo o &quot;hyperstack&quot; para que a fronteira ventricular é planar (usando o &quot;... Imagem / Transform / Rotate&quot; de comando). Use a ferramenta &quot;ângulo&quot; para determinar o ângulo para se candidatar a esta rotação. </li><li> Identificar o plano z onde a célula de interesse é o mais visível. Nesse plano, use a ferramenta &quot;retângulo de seleção&quot; para desenhar uma seleção que inclui toda a célula. </li><li> Identificar os z-planos que incluem a célula de interesse. Use o comando &quot;Imagem / Duplicar&quot; para criar um &quot;sub-stack&quot;. Na caixa de diálogo, sair &quot;hyperstack Duplicate&quot; marcada. O &quot;Fatias (z)&quot; parâmetro corresponde aos z-aviões, incluindo toda a cell, e os &quot;Quadros (t)&quot; parâmetro corresponde ao ponto no tempo atual. </li><li> Se a resolução for pobre, aumentar o tamanho do &quot;sub-stack&quot; usando o &quot;Imagem / Ajustar / tamanho ...&quot; comando. </li><li> Gerar uma reconstrução 3D do celular no ponto de tempo atual usando o &quot;projeto Image/Stacks/3D ...&quot; comando. Os parâmetros para este comando são exibidos na Figura 2B. O &quot;espaçamento fatia&quot; corresponde ao intervalo de tempo entre cada uma das imagens z-plano (M). Importante: certifique-se que a dimensão física (mm) da sub-stack foi conservado. Se não, a interpolação dos pixels na dimensão z será incorreto, ea reconstrução 3D vai ser imprecisa. </li><li> Usando a barra de rolagem, girar a reconstrução 3D resultante para que a borda da placa metafásica é visível. O número do quadro corresponde ao ângulo beta descrito na Figura 3B, registar esse número. Utilizaçãoa ferramenta &quot;ângulo&quot; e &quot;Analisar / Medida ...&quot; comando, medir o ângulo entre a horizontal e uma linha que atravessa a placa metafásica perpendicularmente (Figura 2B). Isto é o ângulo alfa. </li><li> Anote esses ângulos para todos os pontos da célula de interesse tempo metáfase. O ângulo de rotação entre os pontos de tempo (t) e (t-1) é igual ao valor absoluto da diferença entre um ângulo de (t), e este ângulo de (t-1). </li></ol></li><li> Medir a orientação da clivagem Plane <ol><li> 3D reconstruir uma célula de interesse em um ponto de tempo durante a anáfase seguindo as instruções descritas para a reconstrução 3D de placas de metáfase. </li><li> Girar a reconstrução até que as bordas das duas placas formadas pelos cromossomas segregantes são visíveis. </li><li> Utilizar a ferramenta para medir o ângulo entre o ângulo horizontal (a borda ventricular) e uma linha paralela às duas placas formadas pelos cromossomas segregantes. Isto é o ângulo do plano de clivagem (Figura 2C). </li></ol></li><li> Geração de Filmes <ol><li> Como as células movem-se frequentemente em diferentes z-planos, identificar os z-aviões ocupados pelo celular durante a sessão de imagens ao vivo. Gerar uma &quot;projeção de intensidade máxima&quot; desses z-aviões usando a &quot;imagem / Stacks projeto / Z ...&quot; comando. Salve a pilha resultante como um arquivo &quot;. TIF&quot;. </li><li> Abra este arquivo na versão 1.45 do ImageJ como Fiji não inclui um plugin estável para a geração de &quot;. Mov&quot; ou &quot;AVI&quot;. Arquivos. </li><li> Use o &quot;Arquivo / Salvar como / ...&quot; comando de ImageJ para gerar um filme em um formato compatível com as suas aplicações a jusante. </li></ol></li></ol>

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R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Interactions+between+Intermediate+Neurogenic+Progenitors+and+Radial+Glia+in+Embryonic+Mouse+Neocortex:+Potential+Role+in+Dll1-Notch+Signaling.">Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).</li><li>Hu, D. J. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+recruitment+to+nuclear+pores+activates+apical+nuclear+migration+and+mitotic+entry+in+brain+progenitor+cells.">Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells.</a> Cell. 154, 1300-1313 (2013).</li><li>Noctor, S. C., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).</li><li>Tyler, W. A., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genetic+Fate+Mapping+Reveals+a+Novel+Route+of+Neocortical+Neurogenesis,+Which+Is+Altered+in+the+Ts65Dn+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).</li><li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain.">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains.">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors.">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li><li>Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice.">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li><li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells.">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis.">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li><li>Schenk, J., Wilsch-Br&#228;uninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors.">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A principal vantagem do protocolo já descrito é que proporciona uma resolução temporal dinâmico de mitose de células progenitoras neurais. Normalmente, os ensaios para visualizar mitose no cérebro em desenvolvimento são realizadas através de imunofluorescência de cortes de tecidos fixos. Mas esta abordagem apenas fornece um instantâneo da mitose em um ponto do tempo. Existem vários passos que são mais críticos para imagiologia de mitose em fatias de cérebro de: 1) As fatias de cérebro deve permanecer ligado à agarose, para preservar a integridade das secções do cérebro durante a transferência e a montagem. 2) Para a geração de imagem e de fatias, o controlo dos níveis de rostro-caudal é importante. Fatias de cérebro caudal são tipicamente melhores, porque nestas fatias, os processos basais do RGC será mantida intacta, o que é mais saudável para as células. 3) Para imagens ao vivo, o uso de um microscópio confocal de disco giratório com um objetivo 60X é melhor tanto para alta resolução e para evitar a fotodegradação de splos, o que pode ocorrer com corante Syto11. 4) Para imagens ao vivo, os parâmetros temporais de aquisição são críticos. Dependendo do material utilizado microscópio, lapso de tempo pode ser realizado variando de cada min a cada 10 min. Mais de 10 min é tipicamente muito tempo para atingir a dinâmica de alta resolução de mitose. Este protocolo tem certas limitações. A experiência é realizada com o tecido ex vivo. É concebível que as observações feitas em fatias de cérebro podem ser diferentes in vivo. Assim, ao fazer comparações entre os experimentos realizados em dias diferentes ou utilizando diferentes amostras, os seguintes parâmetros devem ser mantidos constantes: utilização de níveis semelhantes rostro-caudal e dorso-lateral, conteúdo de mídia, o uso de microscópio e os parâmetros de aquisição. Além disso, é possível fototoxicidade com imagem latente a longo prazo. Portanto vários experimentos devem ser realizadas antes de fazer conclusões. Além disso, podia-se Syto11 potenteei ra me nt influenciar os acontecimentos de mitose, especialmente em um fundo mutante. Portanto, recomenda-se que, quando se faz a conclusões sobre a mitose com base em Syto11, eles também confirmar os resultados utilizando ensaios independentes, como por exemplo marcadores descritos na Figura 4. Tal como descrito no protocolo, a mitose pode ser trabalhada após marcação cromossomas e o citoesqueleto de várias maneiras. Outros corantes SYTO pode ser usado para visualizar a mitose em outros canais fluorescentes. Em vez de utilizar a coloração Syto11 para visualizar o ADN, as fatias pode ser gerado a partir de linhas transgénicas fluorescentes. Por exemplo, tal como demonstrado, linhas transgénicas histona H2B-EGFP pode ser usado 29. Utilização de histona H2B-EGFP é particularmente útil e recomendado para confirmar qualquer fenótipo observado com o tratamento Syto11. Além disso, também pode ser útil para a superação de desafios associados à fotodegradação com Syto11. A utilização de outras linhas de transgénicos, tais como Centrin-EGFP 30, podeser usado para visualizar centríolos, os componentes de centrossomas. Embora estes sozinho não seria suficiente para a visualização de mitose, eles funcionam bem em combinação com outros marcadores de cromossomas ou microtúbulos. Tais marcadores podem ser introduzidos por electroporação in utero 4,5,10,31,32. Como demonstrado, a expressão de proteínas de fusão no dia anterior à dissecção podem ser úteis para esta abordagem. Em nossa experiência, expressando construções sob um promotor CAG muitas vezes pode render expressão robusta dentro de um dia. Por exemplo, introduzimos α-tubulina e histona H2B-EGFP em cérebros embrionárias usando essa abordagem. Uma vez que esta técnica é dominada há modificações adicionais que podem ser feitas para experiências futuras. No útero electroporação também pode ser utilizado para manipular a expressão génica. Por exemplo, a introdução de shRNA ou cDNAs podem ser úteis para determinar o impacto de perda de função ou a sobre-expressão de um gene de interesse sobre prog neuralenitor mitose 33. Além disso, as fatias podem ser tratadas com drogas químicas ou pequenas moléculas para medir o impacto da inibição das vias ou moléculas de sinalização sobre a mitose 34,35. No nosso procedimento descrevemos imagiologia confocal realizada utilizando um disco giratório. A principal vantagem de um microscópio confocal de disco giratório é a velocidade de aquisição. Isso permite que a imagem de várias posições de diferentes fatias de cérebro em uma sessão de imagens ao vivo, com uma alta resolução temporal, e uma qualidade de imagem razoável. Outras configurações, tais como um sistema multi-fotão confocal laser scanning microscópio permitir a possibilidade de obtenção de imagens de alta qualidade profundamente no tecido, onde as células gliais radiais são menos susceptíveis de ser cortada ao nível do processo de basal. Isto irá, por conseguinte, aumentar a probabilidade de imagem progenitores neurais saudáveis. No entanto, este é geralmente associada a um sacrifício da velocidade de aquisição. Este, por sua vez, irá limitar o númemero de posições que podem ser visualizados durante uma sessão de imagens em tempo real, bem como a resolução temporal. Imagiologia de mitose também pode ser realizada através de um microscópio de campo largo. No entanto, neste caso, é melhor a imagem de baixa densidade de células marcadas, em oposição a histona H2B-EGFP ou Syto11, como o brilho global destes reagentes faria imagem muito mais difícil. Além disso, o protocolo descrito aqui utiliza um microscópio invertido. As principais vantagens de um microscópio invertido é a possibilidade de utilizar os objectivos de óleo de alta resolução e a liberdade de movimento quando o microscópio é acoplado com uma plataforma motorizada. Como conclusão, o pesquisador precisa encontrar um equilíbrio entre as vantagens e desvantagens de um determinado set-up eo propósito de um experimento.

O objetivo geral deste protocolo é para descrever como realizar imagens ao vivo de neural mitose progenitor em fatias cerebrais embrionárias. Usando imagens ao vivo de fatias cerebrais em cultura, este protocolo fornece um método simples para analisar vários aspectos da mitose em progenitores neurais em um ambiente muito semelhante a um cenário in vivo. Ele pode ser aplicado aos cérebros de animais e / ou mutantes cérebros que foram manipuladas com eletroporação in utero) 1-5. Esta técnica também é ideal para testar o efeito de agentes farmacológicos na mitose &quot;precursores neurais, por simples adição de um agente para o meio de cultura. Em suma, este artigo fará um protocolo tecnicamente desafiador acessível para aqueles que estudam a neurogênese. Durante a neurogênese, as populações progenitoras neurais distintas sofrer divisões precisas para gerar neurônios que eventualmente contribuem para as seis camadas corticais do neocórtex adulto 6-8. No início do desenvolvimento cortical, a piscina precursor neural expande como células gliais (NE) divide simetricamente de auto-renovação. Células NE em seguida, converter em células gliais radiais (RGCs). Inicialmente CGR dividir simetricamente para produzir dois novos CGR, no entanto, durante a maior parte da neurogênese, o modo principal &#39;CGR da divisão é assimétrica. Na divisão assimétrica, um RGC dá origem a um novo e RGC ou um neurónio pós-mitótico, ou um progenitor mais especializado (ou um precursor neural curto (SNP), um glia radial exterior (ORG), ou um intermediário de progenitor (INP) 2,3,7,9. INP, SNPs e orgs pode então gerar neurónios no sub-ventricular, ventricular, e as regiões do córtex basal, respectivamente. Assim, a divisão celular das células progenitoras é um processo fundamental para a geração de neurónios do neocórtex. Vários estudos apontam para uma correlação entre as características específicas do CGR mitose e o destino das células-filhas. Haydar et al. E Takahashi et al.têm demonstrado que a duração mitótico RGC e aumento do comprimento do ciclo celular como neurogênese receitas, uma descoberta ecoou em acompanhar os estudos 10-13. Um número de estudos têm sugerido que a orientação relativa do fuso mitótico para o ventrículo influencia aspectos da neurogénese e corticogenesis, incluindo os tipos de neurónios gerados e localização de progenitura no cérebro, respectivamente 3,10,14-16. Quer orientação plano de clivagem influencia diretamente o destino da célula é controversa, mas a conclusão é que este mitótico impactos parâmetros neurogênese. Além disso ressaltando a importância da mitose é a observação de que muitos genes envolvidos nos mecanismos da mitose são cruciais para a neurogênese e para o desenvolvimento adequado do cérebro 17-20. A mitose é um processo dinâmico, no entanto, até o momento a maioria dos estudos que detalham neural mitose progenitor utilizar análise de cortes de tecidos fixos ou de imagem de progenitores neurais através de cultura in vitro de células. Assim, os métodos tradicionais para avaliar a mitose só fornecer um instantâneo desse processo e não conseguem descobrir como as células se comportam em um tecido. Imagens ao vivo de neural mitose progenitor tem se tornado uma ferramenta fundamental para a compreensão da função neural progenitor. Para exemplos veja estas referências 4,8,10,21-25. Vários protocolos pendentes foram publicadas para a preparação e tratamento de imagens de fatias do cérebro 26,27. No entanto até à data, um protocolo detalhado para a imagem e análise de mitose não tem sido descrito, nem demonstrado em vídeo. Esta técnica oferece várias vantagens significativas sobre análise fixo de seções cerebrais. Análise Time-lapse de fatias do cérebro permite a geração de um número significativamente maior de pontos de dados que podem ser analisados ​​de uma forma flexível. Em primeiro lugar, os dados são recolhidos em pontos de tempo individuais ao longo de vários minutos ou de várias horas. Pode-se analisar pontos de tempo individuais (para criar uma montagem estática) oupode combinar diferentes momentos em filmes. Em segundo lugar, confocal de imagens de fatias permite a geração de dados em diferentes seções Z em fatias de cérebro. Como resultado, as secções individuais pode ser analisado. Em alternativa, as pilhas de secções individuais podem ser combinadas em uma projecção de intensidade máxima. Em terceiro lugar, a análise é feita no contexto de um tecido, revelando como as células se dividem em relação às células e as estruturas vizinhas. Em quarto lugar, é idealmente adequado para a análise de mutantes que mostram alguma evidência de defeitos mitóticas. Juntos, este protocolo vai ajudar a esclarecer as etapas críticas para ajudar os investigadores que pretendam realizar imagens ao vivo de neural mitose progenitor em seus próprios laboratórios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:261px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X N2</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50X B27 without vitamin A</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated horse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1138-500ml</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat-inactivated calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>R&#38;D Sytems</td>
			<td>3139-FB-025</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14065-056</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes Free Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;H4034</td>
			<td style="width:261px;">dilute to 1M (pH7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5M D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.9M NaHC03</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-melting agarose</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 404 glue</td>
			<td>Loctite 404</td>
			<td>46551</td>
			<td style="width:261px;">keep at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syto11</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>S7573</td>
			<td style="width:261px;">Make 5&#181;l aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mg/ml collagen type I&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A1048301</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">digital thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to measure the temperature of the agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">alternative to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">dissecting out embryos</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">imaging microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex

Apesar de curta duração, a mitose é um processo multi-passo complexo e dinâmico fundamental para o desenvolvimento de órgãos, incluindo o cérebro. No córtex cerebral em desenvolvimento, a mitose anormal das células progenitoras neurais pode causar defeitos de tamanho e função do cérebro. Portanto, há uma necessidade crítica de ferramentas para compreender os mecanismos da mitose neural progenitor. Desenvolvimento cortical em roedores é um modelo excelente para estudar este processo. Neural mitose progenitor é comumente examinadas em seções cerebrais fixos. Este protocolo irá descrever em detalhe uma abordagem para geração de imagens ao vivo de mitose em ex vivo fatias cerebrais embrionárias. Vamos descrever os passos críticos para este procedimento, que incluem: extração do cérebro, a incorporação do cérebro, vibratome seccionamento de fatias do cérebro, coloração e cultura de fatias e imagem time-lapse. Nós, então, demonstrar e descrever em detalhes como realizar a análise pós-aquisição da mitose. Nós incluímos os resultados representativos from este ensaio utilizando o corante vital Syto11, ratinhos transgénicos (histona H2B-EGFP e Centrin-EGFP), no útero e electroporação (mCherry α-tubulina). Vamos discutir como este processo pode ser melhor otimizado e como ele pode ser modificado para o estudo da regulação genética da mitose. Imagens ao vivo da mitose em fatias de cérebro é uma abordagem flexível para avaliar o impacto da idade, anatomia e perturbação genética em um ambiente controlado, e para gerar uma grande quantidade de dados com alta resolução temporal e espacial. Assim, este protocolo irá complementar as ferramentas existentes para análise de neural mitose progenitor.

O sucesso deste ensaio e da observação de várias células mitóticas durante uma sessão de imagens ao vivo depende em grande parte tanto a integridade eo nível anatômico da fatia onde as aquisições são feitas. Como se verá adiante, o nível anatômico de uma fatia é um fator importante. Figura 3A mostra rostro-caudal e locais onde temos sido mais bem sucedido medial-lateral. Para discussão adicional sobre este assunto consulte Noctor 26. A integridade da fatia pode variar em diferentes regiões da fatia. Esta pode ser determinada antes do início do lapso de tempo (usando imagens de toda a fatia como no Passo 7.6). Em uma boa região de um cérebro E13.5 as seguintes observações podem ser feitas: muitas células mitóticas serão encontrados na fronteira ventrículo, os núcleos interfásicos será em forma elíptica em vez de redondo, e núcleos interfásicos aparecerá em relação à fronteira colunar ventrículo . Em uma região menos desejável do cérebro, onúcleos vai olhar arredondado e um pouco desorganizado (Compare Figuras 3B e 3C, e veja a Figura 3D para uma imagem de uma fatia bem montado). Quando são alcançadas as condições ideais, este ensaio irá permitir a identificação qualitativa dos diferentes fases da mitose. Estes podem ser detectados por meio de análise do padrão de DNA (ver Figura 3E para exemplos de apicalmente a divisão das células em cada fase de mitose). Durante profase, a condensação de DNA terá a aparência de ADN de baixa densidade marcada (regiões de ADN-pobre-rico de ADN e no núcleo). Durante a metáfase, os cromossomos formam um plano no equador do corpo celular. Dependendo da orientação do plano, o padrão de ADN é (i) uma linha de espessura (Figura 3E, ver 1) ou (ii) um &quot;roseta&quot;, com uma região de ADN-pobre no meio (Figura 3E, ver 2) . Durante a anáfase, quando os cromossomos se separam, eles se parecem com &quot;mãos&quot;; que migram em sentidos opostos. Esta fase pode ser difícil de identificar quando o plano de clivagem está no X - Y plano de aquisição. Durante a telófase, DNA relaxa e adquire uma forma elipsóide como as reformas envelope nuclear. Pontos de tempo individuais podem ser coletadas para visualizar mitose ao longo do tempo (veja a Figura 3F). Além de obter imagens de mitose de células progenitoras dividem apicalmente, este ensaio pode ser utilizado para a imagem, tais como células de orgs ou INP basalmente divisão, o último dos quais é mais provável representado na Figura 3G. Tais células são identificáveis ​​pela sua localização para a divisão no SVZ camada. No entanto, para realmente marcar essas células é melhor par a análise com a expressão de um marcador fluorescente que rotula o processo de célula ou o destino (ver Figuras 4B-D). INP terá nem um processo de apicais nem basal, orgs terá um processo basal com o seu corpo celular localizado nas camadas exteriores, e CGRs terá uma baprocesso de sal com o seu corpo celular localizado na camada VZ. A mitose das células progenitoras pode ser visualizado através de métodos alternativos. Figura 4A demonstra o uso da histona H2B-EGFP ratinho transgénico para rotular cromossomas de todas as células em divisão. Isto marca as células em um padrão semelhante ao Syto11. Figura 4B mostra imagens realizada com cérebro no útero eletroporados com EGFP-α-tubulina e histona H2B-mCherry. Como demonstrado, o que permite uma visualizar ambos os microtúbulos e cromossoma, e, adicionalmente, o corpo da célula e processos basal. Figura 4C mostra imagiologia realizada com cérebro de um rato Centrin-EGFP, no útero electroporadas com mCherry-a-tubulina e a histona H2B-EGFP . Como demonstrado, este permite que se cromossomos e centríolos imagem no canal verde eo corpo do fuso mitótico e celular / processo no canal vermelho. Figura 4D mostra imagens realizadas com o cérebros no útero eletroporados com CMV-Cre esparsamente e CALNL-EGFP 28. Esta técnica permite que se escassamente rótulo progenitores divisão, tornando a análise de células em divisão individuais mais fáceis. Ao utilizar eletroporação no entanto, tenha em mente que este método tem como alvo um grupo bastante sincronizada de células de ciclismo 2,12. Isto significa que o tempo de imagens ao vivo em relação à electroporação necessita de ser ajustada, de modo que o grupo de células electroporadas aproxima mitose no início da sessão de imagem. Se não, o sucesso da experiência na identificação de células mitóticas pode ser comprometida em uma sessão de imagens de curto prazo. Quando são alcançadas as condições ideais, as características fundamentais da mitose pode ser medido quantitativamente incluindo a duração da mitose em geral, a duração das fases individuais, a rotação do plano da metafase e clivagem orientação do plano. Nas condições descritas, temos observado uma duração mitótico global média de 1h30 min nos dias embrionários (E) 13,5 e 14,5. Como descrito anteriormente, a rotação do plano de ADN metafase pode ser medido num ponto de tempo individual ou cumulativamente ao longo da duração de uma metafase inteiro 2,6,9,10. Isto pode ser conseguido utilizando a reconstrução em 3D do plano da metafase de uma célula em cada ponto de tempo e a medição de ângulos de DNA em relação ao ventrículo. Nós temos aplicado com sucesso o método neste artigo a seguir células por pelo menos 3 horas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51298/51298fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51298/51298fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática dos passos no protocolo. Tempo necessário para cada etapa é indicado em cada uma das etapas. Detalhes para cada uma dessas etapas são descritos na seção &quot;protocolo&quot;. Por favor, note que o Passo 7 pode ser contornado quando imagiologia fatias de oiembriões pedra H2B-EGFP, ou fatias de cérebros que foram electroporadas com os plasmídeos que expressam os marcadores para a mitose. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51298/51298fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51298/51298fig2.jpg" /> Análise pós-aquisição Figura 2. De time-lapse conjuntos de dados de microscopia de vídeo em Fiji (ImageJ). A) Localização das diferentes ferramentas utilizadas para a análise em Fiji. B) diferentes etapas envolvidas na reconstrução 3D de uma célula em metáfase. Detalhes para cada uma dessas etapas são descritos na seção &quot;protocolo&quot;. C) Medição de clivagem orientação do plano de reconstrução 3D de células em anáfase. Por favor, note que os números em B Passo 6 e C mostram a seqüência seguida para medir o ângulo. D) Os dados representativos, mostrando a repartiçãon de duração da metafase em um grupo de células mitóticas observada na fronteira ventricular em fatias de cérebro de E13.5 (n = 35). E) Os dados representativos mostram a rotação cumulativa de placas na metafase em células mitóticas E13.5 na fronteira do ventrículo . <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51298/51298fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51298/51298fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51298/51298fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplos de dados representativos da análise de imagens ao vivo. A) ao longo do eixo dorso-ventral, mitose é mais facilmente trabalhada na região dorsal de fatias do cérebro, porque o processo basal das CGR é mais curta e, assim, menos susceptíveis de ser cortados por vibratome. Ao longo do eixo rostro-caudal, fatias nas regiões caudais do córtex dorsal darresultados mais consistentes em nossas mãos Exemplos. B e C) são mostrados de uma boa região (B) e uma região ruim (C) para a imagem latente. Em uma boa região, os núcleos são de forma elíptica (regiões circulados) e muitas células mitóticas são observados na fronteira do ventrículo antes de lapso de tempo de imagem (setas). Em uma região ruim, muito poucas células mitóticas são observados na fronteira do ventrículo (seta simples) e os núcleos são redondos (regiões circulado) D) Exemplo de uma boa fatia observados com um microscópio de baixa ampliação antes de viver de imagem.. E) Exemplos de Syto11 rotulado células em diferentes fases da mitose, como observado F) Montagem de uma região na fronteira do ventrículo onde dois progenitores neurais percorrer as diferentes fases da mitose, marcada em cores diferentes (tempo, hh:. mm). G) Montagem de uma região em destaque na (B) em que um progenitor neural divide em distância da fronteira ventricular. Em montagens (D) e (E), cells foram pseudo colorido usando o Photoshop para destacar as diferentes fases de mitose. (As barras de escala: B, C, F: 10 mM, D: 1 milímetro, E, G: 5 mm). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51298/51298fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51298/51298fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de instrumentos alternativos para visualizar a mitose de células progenitoras neurais. A) Montagem de uma região na fronteira do ventrículo em uma fatia do cérebro de um embrião transgênico histona H2B-EGFP em E13.5. Um progenitor é observada como ela prossegue através das diferentes fases da mitose. B) Montagem de um VZ em E14.5 na fatia de um cérebro que foi electroporado em E13.5 com vectores que expressam EGFP-a-tubulina e H2B-mCherry. EGFP-a-tubulina permite a visualização da dinâmica dos microtúbulos durante a mitose (B 1-B 2) C) Montagem de uma região ventricular numan E15.5 cérebro de um embrião transgénico Centrin-EGFP que foi electroporado em E14.5 com plasmídeos que expressam mCherry-a-tubulina e H2B-EGFP. Centrin-EGFP permite a visualização de centríolos dinâmica durante a mitose (C 1 e C 2). D) Montagem de uma região mostrando o IZ de uma fatia E14.5 cérebro onde as células foram escassamente rotulada pela eletroporação em E13.5 com um baixo concentração de um plasmídeo de expressão de Cre e uma concentração normal de um plasmídeo expressando EGFP após recombinação Cre 28. A célula dividindo nesta montagem tem a morfologia de um RGosvz com um processo longo basal (setas rosa) e nenhum processo apical 9. O objectivo usado para imagens em tempo real de (A) e (B) é um objectivo exemplos 60X óleo de silicone, óleo de 100X objectivo, por exemplo, (C), e objectiva 10X ar, por exemplo, D. A resolução temporal utilizada para a imagem (A) , (B), (C) e (D) foram exemplos de 4 min, 4 min, 30 seg e 5 min, respectivamente. VZ: Ventricular Zum, IZ: Zona intermediária, RGosvz: zona subventricular exterior radial de células glia-like. (Barras de escala: A: 15 mm, B, C, D: 5 mm, C 1, C 2: 2,5 mm) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51298/51298fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a>

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Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

live-imaging-of-mitosis-in-the-developing-mouse-embryonic-cortex

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K visualizações.  Duke University Medical Center.  Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado. 

Vídeo: Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Neurociência

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...