Este trabalho foi apoiado por uma doação intramural do NIH-NICHD ao MS. Agradecemos a G. Dold e T. Talbot, do NIH-NIMH Instrumentation Core Facility para assistência no projeto do sistema de entrega de saborizantes.

<ol>
	<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste.">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li><li>Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gustotopic+Map+of+Taste+Qualities+in+the+Mammalian+Brain.">A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain.</a> Science. 333 (6047), (2011).</li><li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Sense+about+Taste:+From+Mammals+to+Insects.">Common Sense about Taste: From Mammals to Insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li><li>Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+and+coding+logic+for+bitter+taste.">The receptors and coding logic for bitter taste.</a> Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).</li><li>Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptors+for+mammalian+sweet+and+umami+taste.">The receptors for mammalian sweet and umami taste.</a> Cell. 115 (3), 255-266 (2003).</li><li>Huang, A. L., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+logic+for+mammalian+sour+taste+detection.">The cells and logic for mammalian sour taste detection.</a> Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).</li><li>Pfaffmann, C., Carl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+afferent+code+for+sensory+quality.">The afferent code for sensory quality.</a> Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).</li><li>Lemon, C. H., Katz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+processing+of+taste.">The neural processing of taste.</a> BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).</li><li>Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Coding+of+Individual+Chemicals+by+the+Gustatory+System.">Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System.</a> J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).</li><li>Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitter+Taste+Stimuli+Induce+Differential+Neural+Codes+in+Mouse+Brain.">Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain.</a> PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).</li><li>Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+different+taste+cells+and+signaling+pathways+to+the+discrimination+of+"bitter"+taste+stimuli+by+an+insect.">Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).</li><li>Kay, L. M., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+in+the+olfactory+systems+of+insects+and+vertebrates.">Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Coding+of+Taste.">Peripheral Coding of Taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+in+the+Mammalian+Gustatory+System.">Coding in the Mammalian Gustatory System.</a> Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).</li><li>Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+chemosensory+system+in+Drosophila+melanogaster:+a+rewiew.">The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew.</a> Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).</li><li>Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+structures+involved+in+insect+gustation.">Peripheral and central structures involved in insect gustation.</a> Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).</li><li>Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labellar+taste+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Labellar taste organs of Drosophila melanogaster.</a> J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).</li><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit.">Physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li><li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla.">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J Vis Exp. (84), e51355 (2014).</li><li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila).">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila).</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li><li>Descoins, C., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+responses+of+gustatory+sensilla+of+Mamestra+brassicae+(Lepidoptera,+Noctuidae)+larvae+to+three+ecdysteroids:+ecdysone,+20-hydroxyecdysone+and+ponasterone.">Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone.</a> A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).</li><li>Popescu, A., Couton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+central+projections+of+gustatory+receptor+neurons+on+the+antenna+of+the+noctuid+moth+Spodoptera+littoralis.">Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis.</a> J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).</li><li>Morita, H., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generator+potential+of+insect+chemoreceptor.">Generator potential of insect chemoreceptor.</a> Science. 130 (3380), 922 (1959).</li><li>Davis, N. T., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomy+of+the+sucking+pump+of+the+moth,+Manduca+sexta+(Sphingidae,+Lepidoptera).">Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera).</a> Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).</li><li>St&#252;rckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurons+in+the+Labellar+Nerve+of+the+Blow+Fly.">The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly.</a> Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).</li><li>St&#252;rckow, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+studies+of+a+single+taste+hair+of+the+fly+during+stimulation+by+a+flowing+system.">Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system.</a> Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).</li><li>Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific,+sex+pheromone-selective+projection+neurons+in+the+antennal+lobes+of+the+moth+Manduca+sexta.">Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta.</a> J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).</li><li>Reiter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gustatory Information Processing. , (2014).</li><li>Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-unit+Recording+Methods+to+Characterize+Neural+Activity+in+the+Locust+(Schistocerca+Americana)+Olfactory+Circuits.">Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li><li>Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+noise+signature+to+optimize+spike-sorting+and+to+assess+neuronal+classification+quality.">Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality.</a> J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).</li><li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Metrics+to+Accompany+Spike+Sorting+of+Extracellular+Signals.">Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals.</a> J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li><li>Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+sorting+of+multiple+unit+neuronal+signals+in+the+presence+of+anisotropic+and+non-Gaussian+variability.">Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability.</a> J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).</li><li>Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+memoir:+from+maps+to+models.">Mushroom body memoir: from maps to models.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).</li><li>Naraghi, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-induced+oscillations+in+the+mushroom+bodies+of+the+locust.">Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust.</a> J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).</li><li>Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+representations+of+odors+in+an+olfactory+network.">Temporal representations of odors in an olfactory network.</a> J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).</li><li>Perez-Orive, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+and+sparsening+of+odor+representations+in+the+mushroom+body.">Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body.</a> Science. 297, 359-365 (2002).</li><li>Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+identity+vs.+intensity+coding+in+an+olfactory+system.">Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system.</a> Neuron. 39, 991-1004 (2003).</li><li>Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+network+dynamics+and+the+coding+of+multidimensional+signals.">Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals.</a> Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os métodos aqui descritos permitem gravações in vivo de um animal relativamente simples, Manduca sexta , para caracterizar a atividade de múltiplas GRN selecionadas aleatoriamente em longas durações (por mais de 2 h), antes, durante e após a entrega do sabor. Esses métodos também permitem a entrega rápida e sequencial de múltiplos estímulos de saborizantes com controle temporal preciso, vantagens que são úteis para o estudo de mecanismos neurais subjacentes à representação de saborizantes. Este protocolo tem sido usado para estudar como as respostas de GRNs a tastants são transformadas quando são transmitidas para seus neurônios alvo pós-sinápticos ( por exemplo, na SEZ) monitorando GRNs simultaneamente com interneurônios monossinticamente conectados 10 . Além disso, esses métodos podem ser adaptados às necessidades do experimentador, permitindo a execução de paradigmas complexos para estudar aspectos fundamentais da codificação gustativa. Quando começarNos nossos estudos, um problema técnico que às vezes precisávamos solucionar era a incapacidade de detectar sinais de inclinação do nervo maxilar com os fios de tetrodos. Possíveis causas para isso são diversas, já que o protocolo de dissecação é desafiador, e é necessária alguma prática para obter uma boa preparação. Primeiro, durante a dissecção da traça, os nervos maxilares são fáceis de danificar, especialmente durante a remoção da bainha que envolve o tecido nervoso. Em segundo lugar, se a bainha não for removida completamente, os fios do tetrode podem não ter acesso ao nervo. Em ambos os casos, iniciar uma nova preparação geralmente é a maneira mais fácil de resolver esses problemas. Em terceiro lugar, pode haver um problema com os fios tetrodos. Isso pode ser verificado medindo a impedância dos fios que deve ser ~ 270 kΩ a 1kHz. Se o valor da impedância estiver acima de ~ 300 kΩ, eletrole os fios com ouro para obter a impedância desejada (ver referência 30 ). Em quarto lugar, um equipamento pode estar desconectadoOu se comportando mal. Outro possível problema é que os sinais de pico são gravados, mas o (s) neurônio (s) aparentemente não respondem aos provadores. Isso pode ser porque os neurônios registrados são insensíveis ao conjunto de saborizantes entregues. Além disso, é importante ter em mente que, além de axônios de GRNs, o nervo maxilar também carrega fibras mecanossensíveis. Assim, é possível gravar a partir de neurônios mecanossensores em vez de, ou além de, GRNs. No entanto, o sistema de entrega de saborizado foi concebido para proporcionar uma entrada mecânica constante ao longo do experimento, tornando improvável que as respostas a um saborizador sejam confundidas pelas respostas ao componente mecânico da sua entrega. Os neurônios que respondem a alguns, mas não a outros saborizantes, ou de maneiras diferentes a diferentes saborizantes, podem ser classificados de forma inequívoca como GRNs. Recomendamos o uso de saborizantes recentemente diluídos para evitar variações na concentração de sabor ou composição devido à degradação ou evaporação do compostoDo solvente. Também recomendamos limpar o sistema regularmente para evitar a contaminação da tubagem e / ou obstruções. Outro possível problema técnico é uma relação sinal-ruído desvantagem. Este problema muitas vezes pode ser resolvido através da recarga ou ajuste da posição do eletrodo de terra do banho. Outras soluções podem exigir blindagem e minimizar o comprimento de cada conexão elétrica no aparelho. Finalmente, é importante notar que a análise correta dos dados obtidos usando gravações de tetrode requer uma classificação cuidadosa dos espinhos. Descobrimos que os métodos totalmente automatizados geralmente são inadequados. Recomendamos familiarizar-se com a literatura de classificação de espiga antes de analisar dados de tetrodos 10 , 29 , 31 , 32 , 33 . Alternativas à nossa dissecção profissionalTocol pode ser usado. Aqui, descrevemos uma dissecção através da parte ventral da cabeça da traça, proporcionando acesso aos nervos maxilares e SEZ, mas também é possível acessar essas estruturas por dissecação através do lado dorsal. Nós achamos que a preparação do lado dorsal não é otimizada para fazer gravações dessas estruturas gustativas devido à sua localização profunda, mas esta preparação oferece a vantagem de habilitar gravações de estruturas de ordem superior, como o corpo de cogumelo, uma área associada a multi Integração sensorial, aprendizagem associativa e processamento de memória 34 . Nós nos concentramos no uso de eletrodos de tetrodos para gravar a partir do nervo maxilar, mas, como ilustramos, eletrodos afiados intracelulares padrão também podem ser usados ​​para este propósito. Além disso, ambas as técnicas podem ser combinadas para realizar gravações simultâneas de várias áreas do cérebro 10 . A literatura sobre neurociências oferece muitos exemplos de iModelos de nvertebrados que provaram ser ferramentas poderosas para revelar princípios fundamentais de processamento sensorial, como a codificação olfativa, que se aplicam tanto aos insetos quanto aos vertebrados 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Esperamos que nossos métodos conduzam a novas idéias fundamentais sobre a codificação gustativa.

Os sistemas gustativo e olfativo geram representações internas de produtos químicos no meio ambiente, dando origem a percepções de gostos e odores, respectivamente. Esses sentidos químicos são essenciais para provocar numerosos comportamentos críticos para a sobrevivência do organismo, que vão desde encontrar companheiros e refeições para evitar predadores e toxinas. O processo começa quando os agentes químicos ambientais interagem com receptores localizados nas membranas plasmáticas das células receptoras sensoriais; Essas células, diretamente ou através de interações com neurônios, transduzem informações sobre a identidade e concentração de produtos químicos em sinais elétricos. Estes sinais são então transmitidos para neurônios de ordem superior e para outras estruturas cerebrais. À medida que estes passos progridem, o sinal original sempre sofre mudanças que promovem a capacidade do organismo de detectar, discriminar, classificar, comparar e armazenar as informações sensoriais e selecionar uma ação apropriada. Entendendo como o sutiãNa transformação de informações sobre produtos químicos ambientais para executar melhor uma variedade de tarefas é uma questão básica na neurociência. A codificação de Gustatory foi pensada para ser relativamente simples: uma visão extensa postula que cada molécula química que provoca um sabor (um &quot;saborizante&quot;) pertence naturalmente a uma das aproximadamente cinco qualidades básicas de sabor ( ou seja , doce, amargo, azedo , Salgados e umami) 1 . Nesta visão de &quot;gosto básico&quot;, o trabalho do sistema gustativo é determinar qual desses gostos básicos está presente. Além disso, os mecanismos neurais subjacentes à representação básica do sabor no sistema nervoso não são claros e são pensados ​​para serem governados por uma &quot;linha marcada&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ou um &quot;padrão de fibra transversal&quot; 7 </suP&gt; , código 8 . Em um código de linha rotulado, cada célula sensorial e cada um de seus seguidores neurais respondem a uma única qualidade de sabor, formando um canal direto e independente para centros de processamento superiores no sistema nervoso central dedicado a esse gosto. Em contraste, em um código de padrão de fibra, cada célula sensorial pode responder a múltiplas características de sabor, de modo que a informação sobre o saborizante seja representada pela resposta geral da população de neurônios sensoriais. Se a informação gustativa é representada por gostos básicos, através de linhas rotuladas, ou através de algum outro mecanismo, não está claro e é o foco da investigação recente 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Nosso próprio trabalho recente sugere que o sistema gustativo usa um código de população spatiotemporal para gerarRepresentações de saborizantes individuais em vez de categorias básicas de gosto 10 . Aqui, oferecemos 3 novas ferramentas para auxiliar no estudo da codificação gustativa. Primeiro, sugerimos o uso do hawkmoth Manduca sexta como um organismo modelo relativamente simples, possivel para o estudo eletrofisiológico do gosto e descrevendo um procedimento de dissecação. Em segundo lugar, sugerimos o uso de &quot;tetrodes&quot; extracelulares para registrar a atividade de GRNs individuais. E em terceiro lugar, sugerimos um novo aparelho para entregar e monitorar pulsos de saborizante precisamente cronometrados para o animal. Essas ferramentas foram adaptadas das técnicas que nosso laboratório usou para estudar o sistema olfativo. Insetos como a mosca da fruta Drosophila melanogaster , o gafanhoto Schistocerca americana , bem como a maruca Manduca sexta, têm proporcionado por décadas recursos poderosos para entender princípios básicos sobre o nerSistema de você, incluindo a codificação sensorial ( por exemplo, olfação 13 ). Nos mamíferos, os receptores de gosto são células especializadas que se comunicam com os neurônios através de caminhos complexos do segundo mensageiro 1 , 14 . É mais simples em insetos: seus receptores de gosto são neurônios. Além disso, as vias de sabor de mamíferos perto da periferia são relativamente complexas, apresentando múltiplas rotas neurais paralelas, e componentes importantes são difíceis de acessar, contidos em pequenas estruturas ósseas 15 . As vias de sabor do inseto parecem ser mais simples. Em insetos, os GRNs estão contidos em estruturas especializadas conhecidas como sensilla, localizadas na antena, partes bucais, asas e pernas 16 , 17 . Os GRNs diretamente projetam para a zona subesofágica (SEZ), uma estrutura cujo papel foi considerado principalmente 17 gustativo e que contém segunda ordemNeurônios gustativos 10 . A partir daí, a informação viaja para o corpo para conduzir reflexos e para áreas superiores do cérebro para serem integradas, armazenadas e, em última instância, para dirigir as escolhas comportamentais 16 . É necessário caracterizar as respostas do sabor periférico para entender como a informação do gosto é propagada e transformada de um ponto para outro através do sistema nervoso. O método mais utilizado para monitorar diretamente a atividade neural de GRN em insetos é a técnica de gravação de ponta 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Isso envolve a colocação de um eletrodo diretamente em um sensillum, muitos dos quais são relativamente fáceis de acessar. O saborizador está incluído no eletrodo, permitindo que um seja ativado e extMede as respostas neuronais nas GRNs de forma racélular no sensillum. Mas, como o saborizador está contido no eletrodo, não é possível medir a atividade do GRN antes que o saborizador seja entregue ou após a remoção, ou para trocar os saborizantes sem substituir o eletrodo 20 . Outro método, a técnica de gravação &quot;side-wall&quot;, também foi usado para registrar a atividade GRNs. Aqui, um eletrodo de gravação é inserido na base de um sabor sensorial 24 , e os saborizantes são entregues através de um capilar de vidro separado na ponta do sensillum. Ambas as técnicas restringem a gravação de GRNs para um sensillum particular. Aqui, sugerimos uma nova técnica: gravação de axônios GRN selecionados aleatoriamente de sensilla diferente, enquanto distribuímos separadamente as seqüências de saborizantes para a probóscide. As gravações de Axon são conseguidas colocando eletrodos de vidro afiados ou feixes de eletrodos extracelulares (tetrodos) no nervo que carrega axônios deGRNs na probóscide ao SEZ 10 . Em Manduca , esses axônios atravessam o nervo maxilar, que é conhecido por ser puramente aferente, permitindo a gravação inequívoca de respostas sensoriais 25 . Este método de gravação a partir de axônios, permite, durante mais de duas horas, medição estável de respostas GRN antes, durante e após uma série de apresentações de sabor. Aqui, descrevemos um procedimento de dissecção para expor os nervos maxilares em conjunto com o SEZ, o que pode permitir que se grave simultaneamente as respostas de GRN e neurônios múltiplos no SEZ 10 . Nós também descrevemos o uso de gravações extracelulares de GRNs usando um tetrode de fio torcido personalizado de 4 canais que, quando combinado com um método de classificação por espiga, permite a análise de GRNs múltiplos (em nossas mãos, até seis) simultaneamente. Além disso, comparamos as gravações feitas com tetrodes com gravações feitas com células intracelulares afiadasEletrodos. Finalmente, descrevemos um novo aparelho para fornecer estímulos de saborizante. Adaptado do equipamento usado por muitos pesquisadores para fornecer odorantes em estudos de olfação, nosso novo aparelho oferece vantagens para o estudo da gustação: melhorando o sistema de entrega multicanal anterior, como os desenvolvidos por Stürckow e colegas (ver referências 26 , 27 ), nosso aparelho alcança informações precisas Controle sobre o tempo da entrega do saborizante enquanto fornece uma leitura de tensão desse tempo; E permite a entrega rápida e sequencial de vários estímulos de saborizantes 10 . O aparelho baça a probóscide em um fluxo constante de água limpa em que podem ser entregues pulsos controlados de saborizante. Cada pulso saboroso passa sobre a probóscis e depois é lavado. Os saborizantes contêm uma pequena quantidade de coloração insípida, permitindo que um sensor de cor monitore, com cronometragem precisa, a passagem do tastant ovE a probóscide.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Dissection and specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 ml -Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2&#34;&#160;</td>
			<td>&#160;MONOJET</td>
			<td>888200144</td>
			<td>For aplying air to remove the hair from the moth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&#160;</td>
			<td>DickBlick</td>
			<td>33268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish-100 x 15 mm&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89000-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip (1-200 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Techni Edge</td>
			<td>TE05-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG standard hookup wire</td>
			<td>AlphaWire</td>
			<td>1551</td>
			<td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batik wax</td>
			<td>Jacquard</td>
			<td>7946000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric waxer</td>
			<td>Almore International</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Myscroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #1 forceps (coarse)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500335</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14096</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500085</td>
			<td>For desheathing the nervious tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>For removing the cuticle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Saline perfusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension set with rate flow regulator</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set with Y injection site</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastant delivery system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&#34;, ID 1/8&#34;</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>B001JJT4SA</td>
			<td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Circuit Specialists</td>
			<td>ZD200BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool-Dremel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&#160;</td>
			<td>Industrial Netting</td>
			<td>XN5170</td>
			<td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized 16-Channel perfusion system&#160;</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-16H</td>
			<td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubing, ID 0.034&#34;, ID 0.050&#34;</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Co</td>
			<td>427421</td>
			<td>&#160;Output tube from the perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For controlling the output channel of the perfusion system.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1366</td>
			<td>For pumping water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, ID 1/16&#34; OD 1/8&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-95802-02</td>
			<td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>&#160;FS-V31M</td>
			<td>For monitoring tastant delivery.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-reflective fiber unit</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>FU35-FZ</td>
			<td>To connect the color sensor device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental periphery Wax</td>
			<td>Henry-Schein Dental</td>
			<td>6652151</td>
			<td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 3.7 L containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps 25.5 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500364</td>
			<td>To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Electrophysiology Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.C. amplifier</td>
			<td>Brown-Lee</td>
			<td>440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix&#160;</td>
			<td>TDS2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td>
			<td>16 Channel MA-800 Amplifier System&#160;</td>
			<td>B.E.S 2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>optiplex 780</td>
			<td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core&#160;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

new methods to study gustatory coding

O sentido do gosto permite que os animais detectem produtos químicos no meio ambiente, dando origem a comportamentos críticos para a sobrevivência. Quando os neurônios do receptor Gustatory (GRNs) detectam moléculas de saborizante, codificam informações sobre a identidade e a concentração do saborizante como padrões de atividade elétrica que se propagam para os neurônios seguidores no cérebro. Esses padrões constituem representações internas do saborizante, que então permitem ao animal selecionar ações e formar memórias. O uso de modelos animais relativamente simples tem sido uma ferramenta poderosa para estudar princípios básicos na codificação sensorial. Aqui, propomos três novos métodos para estudar a codificação gustativa usando a traça Manduca sexta . Primeiro, apresentamos um procedimento de dissecção para exposição dos nervos maxilares e da zona subesofágica (SEZ), permitindo o registro da atividade de GRNs de seus axônios. Em segundo lugar, descrevemos o uso de eletrodos extracelulares para registrar a atividade de GRNs múltiplos, colocando teTrode fios diretamente no nervo maxilar. Em terceiro lugar, apresentamos um novo sistema para entrega e monitoramento, com alta precisão temporal, pulsos de diferentes saborizantes. Estes métodos permitem a caracterização de respostas neuronais in vivo directamente a partir de GRNs antes, durante e após a entrega dos saborizantes. Nós fornecemos exemplos de traços de tensão gravados em GRN múltiplos e apresentamos um exemplo de como uma técnica de classificação de espiga pode ser aplicada aos dados para identificar as respostas de neurônios individuais. Finalmente, para validar nossa abordagem de gravação, comparamos as gravações extracelulares obtidas de GRNs com tetrodos para gravações intracelulares obtidas com eletrodos de vidro afiados.

A atividade dos GRNs pode ser registrada usando um eletrodo de tetrodo extracelular antes, durante e após a entrega do sabor ( Figura 6A e 6C ). A Figura 6A (painéis médio e inferior) mostra os traços de tensão filtrados (300-6,000 Hz) registrados por cada um dos quatro fios colocados no nervo maxilar, onde são observados sinais de diferentes amplitudes que refletem potenciais de ação (setas). Um pulso de 1 s de saborizante (sacarose 1 M) foi administrado 2s após o início da experiência; O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor ( Figura 6A , painel superior). Os picos induzidos por saborizantes que podem ser observados em cada um dos quatro canais ( Figura 6A , painel central). Os GRNs podem ser identificados e distinguidos dos mechanosensores (nenhum mostrado aqui) quando eles respondem a alguns provadores e não aos outros Para identificar e isolar respostas de neurônios únicos das gravações de tetrodos, realizamos classificação de espiga fora de linha usando um conjunto de funções personalizadas com base em métodos 32 , 33 de Pouzat e Kleinfeld (esses métodos são descritos nessas citações: 10 , 29 ). A Figura 6B mostra um exemplo de classificação por espiga aplicado aos dados mostrados na Figura 6A , em que foram encontradas três unidades bem isoladas. As tramas de escala da Figura 6C representam as respostas das três unidades isoladas na Figura 6B a seis saborizantes diferentes (sacarose 1 M, maltose e NaCl, 100 mM de cafeína e 10 mM de berberina e lobelina) entregues em sequência (4 testesS / tastant são mostrados). Conforme mostrado na Figura 6C , os GRNs registrados têm níveis diferentes de atividade de linha de base, variando de silencioso (GRN 1) a baixo ou moderado (GRN 2 e 3). Após o início do sabor, os GRNs mostram diversos padrões de atividade e exibem seletividade diferente para os saborizantes. Por exemplo, o GRN 1 respondeu apenas a sacarose, enquanto o GRN 2 respondeu a maltose e NaCl com explosão de espigas e a lobelina com pico apenas no início do estímulo. Além disso, algumas respostas são bloqueadas no momento do estímulo ( por exemplo, resposta do GRN 1 à sacarose), enquanto que outras respostas superam a duração do estímulo ( por exemplo, resposta do GRN 3 à berberina) ou contêm componentes excitadores e inibitórios ( por exemplo, Figura 7 Respostas de GRN 2 ao NaCl e à sacarose). Para mais informações sobre as diversas sensibilidades e padrões de atividade dos GRN, veja a referência 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Para validar o uso das técnicas de tetrodo e triagem de ponta para registrar GRNs do nervo maxilar, realizamos gravações intracelulares de axônios GRN em outros animais usando eletrodos convencionais de vidro afiado (resistência de 80-120 MΩ). Descobrimos que os padrões de atividade obtidos usando gravações intracelulares foram semelhantes às respostas observadas usando a técnica de tetrodos ( Figura 7 ). Os traços de tensão na caixa verde no Painel A foram registrados intracelularmente a partir do GRN 1 durante 5 testes consecutivos de apresentação de sacarose e as mesmas respostas são mostradas como parcelas de quadros no painel B. (Observe que esse tipo de resposta corresponde ao obtido com tetrodos e Mostrado na Figura 6C .) GRN 2, gravado com eletrodos intracelulares afiados, mostra um padrão de resposta mais amplo. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figura 6: Resultados representativos das gravações do nervo maxilar com Tetrodes extracelulares. ( A ) São mostrados traços de tensão filtrados (300-6,000 Hz) gravados por cada um dos quatro fios no nervo maxilar (painel central). Um pulso de saborizante de 1 s foi aplicado durante o período de tempo indicado pelo sombreamento vermelho no painel do meio. O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor como indicado pelo traçado de tensão vermelha no painel superior e é indicado no painel do meio pela área sombreada vermelha. As linhas horizontais pontilhadas indicam +50 (superior), 0 (meio) e -50 (inferior) μV. É mostrado um alargamento dos traços de tensão bruta correspondentes à área dentro das linhas pontilhadas verticais (painel inferior). Exemplos de pontos são indicados pelas setas. ( B ) Um exemplo de classificação de espiga aplicado aos dados mostrados no painel A. As formas de onda registradas em cada um dos quatro fios extracelulares (1-4) sãoE identificado com três GRN diferentes (unidades 1-3) contribuindo para os sinais gravados. Eventos individuais (linhas finas coloridas) e a média (linha preta grossa) são mostradas para as três unidades. Uma série de critérios estatísticos devem ser considerados para identificar de forma confiável unidades independentes usando o método de classificação por espiga (ver referências 10 , 29 ). ( C ) Raster tramas representando as respostas das três unidades isoladas a uma seqüência de seis saborizantes diferentes (4 ensaios / saborizantes são mostrados). O período de tempo de entrega do saborizante (1 s) é indicado pela área sombreada vermelha. As concentrações de saborizantes foram 1M (sacarose, maltose, NaCl), 100 mM (cafeína) e 10 mM (berberina e lobelina). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7 : Gravação intracelular de Axões GRN. ( A , painel da caixa verde) Traços de tensão gravados a partir de um GRN com eletrodos intracelulares de vidro afiado (resistência de 80 - 120 MΩ) colocados no nervo maxilar, provocados por 5 estímulos consecutivos com sacarose 1 M (Suc). ( B ) Parcelas rásticas das respostas de dois GRNs, incluindo respostas mostradas no painel A (painel de caixa verde), a dois saborizantes diferentes entregues em sequência (cor de cor cinza 100 mM, cor de fonte negra de 1 M) gravados com eletrodos intracelulares de vidro afiado Colocado no nervo maxilar (7 ensaios / saborizante e 3 ensaios / água são mostrados). O tempo de entrega do Tastant é indicado pelas áreas sombreadas vermelhas em ambos os painéis. O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor, conforme indicado pelos traços de tensão vermelha na parte inferior de cada painel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Novos métodos para estudar codificação gustativa | Neurociência | Vídeo

New Methods to Study Gustatory Coding

Apresentamos três novos métodos para estudar codificação gustativa . Usando um animal simples, a traça Manduca sexta ( Manduca ) , descrevemos um protocolo de dissecção, o uso de tetrodos extracelulares para registrar a atividade de múltiplos neurônios receptores gustativos e um sistema para fornecer e monitorar pulsos precisamente cronometrados de saborizantes.

Novos métodos para estudar codificação gustativa

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K visualizações.  National Institutes of Health (NIH).  Apresentamos três novos métodos para estudar codificação gustativa . Usando um animal simples, a traça Manduca sexta ( Manduca ) , descrevemos um protocolo de dissecção, o uso de tetrodos extracelulares para registrar a atividade de múltiplos neurônios receptores gustativos e um sistema para fornecer e monitorar pulsos precisamente cronometrados de saborizantes. 

Vídeo: New Methods to Study Gustatory Coding

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

How to Create and Use Binocular Rivalry

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent representation. However, when the eyes are presented with images that are sufficiently different from each other, an interesting thing happens: Rather than fusing the two images into a combined conscious percept, what transpires is a pattern of perceptual alternations where one image dominates awareness while the other is suppressed; dominance alternates between the two images, typically every few seconds. This perceptual phenomenon is known as binocular rivalry. Binocular rivalry is considered useful for studying perceptual selection and awareness in both human and animal models, because unchanging visual input to each eye leads to alternations in visual awareness and perception. To create a binocular rivalry stimulus, all that is necessary is to present each eye with a different image at the same perceived location. There are several ways of doing this, but newcomers to the field are often unsure which method would best suit their specific needs. The purpose of this article is to describe a number of inexpensive and straightforward ways to create and use binocular rivalry. We detail methods that do not require expensive specialized equipment and describe each method's advantages and disadvantages. The methods described include the use of red-blue goggles, mirror stereoscopes and prism goggles.

Binocular rivalry occurs when the eyes are presented with different images at the same location: one image dominates while the other is suppressed, and dominance alternates periodically. Rivalry is useful for investigating perceptual selection and visual awareness. Here we describe several easy methods for creating and using binocular rivalry stimuli.

Como criar e usar a rivalidade binocular

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent ...

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Medir o valor subjetivo de Opções de risco e ambígua usando Economia Experimental e funcional métodos de ressonância magnética

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Um método para fazer uma craniotomia no crânio ventral de neonatos Roedores

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...