Diese Arbeit wurde von einem intramuralen Stipendium von NIH-NICHD an MS unterstützt. Wir danken G. Dold und T. Talbot von der NIH-NIMH Instrumentation Core Facility für die Unterstützung bei der Gestaltung des Tastant Delivery Systems.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Verfahren erlauben in vivo Aufnahmen von einem relativ einfachen Tier, Manduca sexta , um die Aktivität mehrerer, zufällig ausgewählter GRNs über lange Zeitdauern (für mehr als 2 h) vor, während und nach der Tastantlieferung zu charakterisieren. Diese Methoden erlauben auch die schnelle, sequentielle Abgabe von mehrfachen Taststimuli mit präziser zeitlicher Kontrolle, Vorteile, die für das Studium von neuronalen Mechanismen, die einer schmackhaften Repräsentation zugrunde liegen, nützlich sind. Dieses Protokoll wurde verwendet, um zu untersuchen, wie die Reaktionen von GRNs auf Geschmackstoffe transformiert werden, wenn sie auf ihre postsynaptischen Zielneuronen ( z. B. in der SEZ) übertragen werden, indem sie GRNs gleichzeitig mit monosynaptisch verbundenen Interneuronen überwachen. Darüber hinaus können diese Methoden an die Bedürfnisse des Experimentators angepasst werden, so dass die Durchführung von komplexen Paradigmen grundlegende Aspekte der gustatory Codierung zu studieren. Wenn anfangsG unsere Studien, ein technisches Problem, das wir manchmal zu beheben hatten, war die Unfähigkeit, Spiking-Signale aus N. maxillaris mit den Tetrodendrähten zu erkennen. Mögliche Ursachen dafür sind vielfältig, da das Dissektionsprotokoll anspruchsvoll ist und manche Praxis notwendig ist, um eine gute Vorbereitung zu erhalten. Zuerst werden während der Motten-Sezierung die Oberkiefer-Nerven leicht zu beschädigen, besonders während der Entfernung der Hülle, die das Nervengewebe umgibt. Zweitens, wenn die Scheide nicht vollständig entfernt wird, können die Tetrodendrähte nicht in der Lage sein, auf den Nerv zuzugreifen. In beiden Fällen ist das Starten einer neuen Vorbereitung oft der einfachste Weg, um diese Probleme zu lösen. Drittens kann es ein Problem mit den Tetrodendrähten geben. Dies kann durch Messung der Impedanz der Drähte, die ~ 270 kΩ bei 1kHz sein sollte, überprüft werden. Wenn der Impedanzwert über ~ 300 kΩ liegt, galvanisieren Sie die Drähte mit Gold, um die gewünschte Impedanz zu erreichen (siehe Referenz 30 ). Viertens kann ein Gerät verkürzt werdenOder fehlerhaft Ein weiteres mögliches Problem ist, dass spiking Signale aufgezeichnet werden, aber die Neurone (n) erscheinen unempfänglich für die Tastamente. Dies könnte daran liegen, dass die aufgezeichneten Neuronen unempfindlich gegenüber dem gelieferten Geschmack sind. Auch ist wichtig zu beachten, dass zusätzlich zu den Axonen der GRNs der N. maxillaris auch mechanosensorische Fasern trägt. So ist es möglich, von mechanosensorischen Neuronen anstelle von oder zusätzlich zu GRNs aufzuzeichnen. Das Tastant-Abgabesystem ist jedoch so ausgelegt, dass es während des gesamten Experiments eine konstante mechanische Eingabe liefert, was es unwahrscheinlich macht, dass Reaktionen auf einen Geschmack durch Reaktionen auf die mechanische Komponente seiner Auslieferung verwechselt werden. Neuronen, die auf einige, aber nicht andere Geschmacksrichtungen reagieren, oder auf unterschiedliche Weise zu verschiedenen Geschmacksrichtungen, können eindeutig als GRNs eingestuft werden. Wir empfehlen, frisch verdünnte Geschmacksstoffe zu verwenden, um Variationen der Geschmackskonzentration oder -zusammensetzung aufgrund von vermindertem Abbau oder Verdampfung zu vermeidenDes Lösungsmittels. Wir empfehlen auch, das System regelmäßig zu reinigen, um Schlauchverunreinigungen und / oder Hindernisse zu vermeiden. Ein weiteres mögliches technisches Problem ist ein nachteiliges Signal-Rausch-Verhältnis. Dieses Problem kann oft durch Rechlorieren oder Einstellen der Position der Bad-Masseelektrode gelöst werden. Andere Lösungen können eine Abschirmung erfordern und die Länge jeder elektrischen Verbindung im Gerät minimieren. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass eine korrekte Analyse der Daten, die mit Tetrodenaufnahmen erhalten wurden, eine sorgfältige Spikesortierung erfordert. Wir haben festgestellt, dass vollautomatische Methoden in der Regel unzureichend sind. Wir empfehlen, mit der Spike-Sortierliteratur vertraut zu werden, bevor wir die Tetrodendaten 10 , 29 , 31 , 32 , 33 analysieren. Alternativen zu unserer Sektion ProTocol kann verwendet werden. Hier haben wir eine Zergliederung durch den ventralen Teil des Mottenkopfes beschrieben, der Zugang zu den Oberkiefernerven und SEZ bietet, aber es ist auch möglich, auf diese Strukturen zuzugreifen, indem sie durch die dorsale Seite zerlegen. Wir fanden die dorsale Seite Vorbereitung ist nicht optimal für die Aufnahmen von diesen Geschmack Strukturen aufgrund ihrer tiefen Lage, aber diese Vorbereitung bietet den Vorteil der Ermöglichung von Aufnahmen aus höheren Ordnung Strukturen wie der Pilz Körper, ein Bereich, der mit Multi verbunden war -sensorische Integration, assoziatives Lernen und Gedächtnisverarbeitung 34 . Wir haben uns auf die Verwendung von Tetrodenelektroden konzentriert, um aus dem N. maxillaris aufzutragen, aber, wie wir veranschaulicht haben, können auch standardmäßige intrazelluläre scharfe Elektroden verwendet werden. Darüber hinaus können beide Techniken kombiniert werden, um simultane Aufnahmen von mehreren Gehirnbereichen auszuführen 10 . Die neurowissenschaftliche Literatur bietet viele Beispiele für iWirbeltiermodelle, die sich als mächtige Werkzeuge erwiesen haben, um grundlegende Prinzipien der sensorischen Verarbeitung, wie z. B. olfaktorische Kodierung, die sowohl für Insekten als auch für Wirbeltiere 35 , 36 , 37 , 38 , 39 gelten, aufzudecken. Wir hoffen, dass unsere Methoden zu grundlegenden neuen Einsichten über die gustatorische Kodierung führen werden.

Die gustatorischen und olfaktorischen Systeme erzeugen interne Darstellungen von Chemikalien in der Umwelt, was zu einer Wahrnehmung von Geschmack und Gerüchen führt. Diese chemischen Sinne sind wesentlich für das Auslösen zahlreicher Verhaltensweisen, die für das Überleben des Organismus kritisch sind, von der Suche nach Kumpel und Mahlzeiten zur Vermeidung von Raubtieren und Toxinen. Der Prozess beginnt, wenn Umweltchemikalien mit Rezeptoren interagieren, die sich in den Plasmamembranen von sensorischen Rezeptorzellen befinden; Diese Zellen, direkt oder durch Wechselwirkungen mit Neuronen, übertragen Informationen über die Identität und Konzentration von Chemikalien in elektrische Signale. Diese Signale werden dann auf Neuronen höherer Ordnung und auf andere Hirnstrukturen übertragen. Wenn diese Schritte fortschreiten, wird das ursprüngliche Signal immer Veränderungen unterworfen, die die Fähigkeit des Organismus fördern, die sensorischen Informationen zu erkennen, zu unterscheiden, zu klassifizieren, zu vergleichen und zu speichern und eine geeignete Aktion auszuwählen. Verstehen, wie der BHIn verwandelt Informationen über Umweltchemikalien, um am besten eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen ist eine grundlegende Frage in der Neurowissenschaften. Die Gustator-Codierung wurde als relativ einfach angesehen: Eine weit verbreitete Ansicht stellt fest, dass jedes chemische Molekül, das einen Geschmack hervorruft (ein &quot;schmackhaft&quot;), natürlich zu einer der etwa fünf oder so grundlegenden Geschmackseigenschaften gehört ( dh süß, bitter, sauer , Salzig und umami) 1 . In dieser &quot;Grundgeschmack&quot; -Ansicht ist die Aufgabe des Geschmackssystems zu bestimmen, welcher dieser Grundgeschmack vorhanden ist. Ferner sind die neuronalen Mechanismen, die der grundlegenden Geschmacksdarstellung im Nervensystem zugrunde liegen, unklar und werden durch eine &quot;markierte Linie&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 oder ein &quot;über Fasermuster&quot; 7 bestimmt </suP&gt; , 8 code. In einem etikettierten Liniencode reagiert jede sensorische Zelle und jede ihrer neuralen Anhänger auf eine einzige Geschmacksqualität, die zusammen einen direkten und unabhängigen Kanal zu höheren Bearbeitungszentren im zentralen Nervensystem bildet, die diesem Geschmack gewidmet sind. Im Gegensatz dazu kann in einem across-Faser-Muster-Code jede sensorische Zelle auf mehrere Geschmackseigenschaften reagieren, so dass Informationen über den Geschmack durch die Gesamtreaktion der Population von sensorischen Neuronen repräsentiert werden. Ob gustatorische Information durch grundlegende Geschmäcke, durch markierte Linien oder durch einen anderen Mechanismus repräsentiert wird, ist unklar und steht im Mittelpunkt der neueren Untersuchung 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Unsere eigenen jüngsten Arbeiten deuten darauf hin, dass das Geschmackssystem einen räumlich-zeitlichen Bevölkerungscode verwendet, um zu erzeugenDarstellungen einzelner Geschmacksrichtungen anstatt der Grundgeschmackskategorien 10 . Hier bieten wir 3 neue Werkzeuge an, um das Studium der Gustatory Coding zu unterstützen. Zuerst schlagen wir die Verwendung des hawkmoth Manduca sexta als relativ einfacher Modellorganismus vor, der dem elektrophysiologischen Studium des Geschmacks zugänglich ist und ein Sektionsverfahren beschreibt. Zweitens schlagen wir die Verwendung von extrazellulären &quot;Tetroden&quot; vor, um die Aktivität einzelner GRNs aufzuzeichnen. Und drittens schlagen wir einen neuen Apparat vor, um präzise zeitgesteuerte Impulse für das Tier zu liefern und zu überwachen. Diese Werkzeuge wurden aus Techniken unseres Labors angepasst und andere haben das olfaktorische System untersucht. Insekten wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster , die Heuschrecke Schistocerca americana , sowie die Motte Manduca sexta, haben seit Jahrzehnten leistungsstarke Mittel, um Grundprinzipien über den Ner zu verstehenVous-System, einschließlich sensorischer Codierung ( zB Olution 13 ). Bei Säugetieren sind Geschmacksrezeptoren spezialisierte Zellen, die mit Neuronen über komplexe Sekundärboten 1 , 14 kommunizieren. Es ist einfacher bei Insekten: ihre Geschmacksrezeptoren sind Neuronen. Weiterhin sind Säugetier-Geschmackswege in der Nähe der Peripherie relativ komplex, mit mehreren, parallelen neuronalen Strecken, und wichtige Komponenten sind herausfordernd zugänglich, in kleinen knöchernen Strukturen enthalten. Insektengeschäftswege scheinen einfacher zu sein. Bei Insekten sind GRNs in spezialisierten Strukturen, die als Sensilla bekannt sind, in der Antenne, den Mundstücken, den Flügeln und den Beinen 16 , 17 enthalten . Die GRNs direkt projektieren, um die subösophageale Zone (SEZ), eine Struktur, deren Rolle wurde vor allem gustatory 17 , und die Zweite Ordnung enthältGeschmack Neuronen 10 . Von dort aus gelangt die Information zum Körper, um Reflexe zu fahren und höhere Gehirnbereiche zu integrieren, zu speichern und letztlich Verhaltensweisen zu treffen 16 . Es ist notwendig, periphere Geschmacksreaktionen zu charakterisieren, um zu verstehen, wie die Geschmacksinformation propagiert und von Punkt zu Punkt im ganzen Nervensystem transformiert wird. Die am häufigsten verwendete Methode zur direkten Überwachung der neuronalen Aktivität von GRNs bei Insekten ist die Tip-Recording-Technik 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Dabei geht es darum, eine Elektrode direkt auf ein Sensillum zu legen, von denen viele relativ leicht zugänglich sind. Der Geschmack ist in der Elektrode enthalten, so dass man zu aktivieren und extRaumuläre Messung der neuronalen Reaktionen von GRNs im Sensillum. Da aber der Geschmack in der Elektrode enthalten ist, ist es nicht möglich, die GRN-Aktivität zu messen, bevor der Geschmack abgegeben wird oder nachdem er entfernt wurde, oder um Tastants auszutauschen, ohne die Elektrode 20 zu ersetzen. Eine andere Methode, die &quot;Seitenwand&quot; Aufnahmetechnik, wurde auch verwendet, um GRNs Aktivität aufzuzeichnen. Hier wird eine Aufzeichnungselektrode in die Basis eines Geschmacksensilums 24 eingeführt und die Geschmackstoffe werden durch eine separate Glaskapillare an der Spitze des Sensillums abgegeben. Beide Techniken beschränken die Aufzeichnung von GRNs auf ein bestimmtes Sensillum. Hier schlagen wir eine neue Technik vor: Aufzeichnung von zufällig ausgewählten GRN-Axonen aus verschiedenen Sensillen, während sie separat Septionen von Tasting an den Rüssel liefern. Axon-Aufnahmen werden erreicht, indem entweder scharfe Glaselektroden oder extrazelluläre Elektrodenbündel (Tetroden) in den Nerven gebracht werden, der Axone trägtGRNs im Rüssel der SEZ 10 . In Manduca durchqueren diese Axone den N. maxillaris, der bekanntermaßen rein afferent ist und die eindeutige Aufzeichnung von Sinnesreaktionen ermöglicht. Diese Methode der Aufzeichnung von Axonen, erlaubt für mehr als zwei Stunden, stabile Messung der GRN-Antworten vor, während und nach einer Reihe von leckeren Präsentationen. Hier beschreiben wir ein Sektionsverfahren, um die Oberkiefernerven zusammen mit der SEZ auszusetzen, die es erlauben, gleichzeitig die Reaktionen von mehreren GRNs und Neuronen in der SEZ 10 aufzuzeichnen. Wir beschreiben auch die Verwendung von extrazellulären Aufnahmen von GRNs mit einer maßgeschneiderten 4-Kanal-Twisted-Wire-Tetrode, die in Kombination mit einer Spike-Sortiermethode die Analyse von mehreren (in unseren Händen bis zu sechs) GRNs gleichzeitig ermöglicht. Wir vergleichen weiter Aufnahmen mit Tetroden zu Aufnahmen mit scharfen intrazellulären gemachtElektroden Schließlich beschreiben wir einen neuen Apparat für die Bereitstellung von schmackhaften Reizen. Angepasst von Geräten, die von vielen Forschern verwendet wurden, um Geruchsstoffe in Olivitätsstudien zu liefern, bietet unser neues Gerät Vorteile für das Studieren von Böen: Verbesserung des bisherigen Mehrkanal-Abgabesystems, wie sie von Stürckow und Kollegen entwickelt wurden (siehe Referenzen 26 , 27 ), unser Gerät erreicht präzise Kontrolle über den Zeitpunkt der Tastant-Abgabe, während eine Spannungsauslesung dieser Zeitsteuerung bereitgestellt wird; Und es ermöglicht die schnelle, sequentielle Lieferung von mehrfachen Taststimuli 10 . Die Apparatur badet den Rüssel in einem konstanten Strom von sauberem Wasser, in das kontrollierte Impulse des Geschmacks geliefert werden können. Jeder schmackhafte Puls geht über den Rüssel und wird dann weggewaschen. Schmecken enthalten eine kleine Menge von geschmacklosen Lebensmittel Färbung, so dass ein Farbsensor zu überwachen, mit präzisen Timing, die Passage von schmackhaften ovEr ist der Rüssel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Dissection and specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 ml -Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2&#34;&#160;</td>
			<td>&#160;MONOJET</td>
			<td>888200144</td>
			<td>For aplying air to remove the hair from the moth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&#160;</td>
			<td>DickBlick</td>
			<td>33268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish-100 x 15 mm&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89000-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip (1-200 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Techni Edge</td>
			<td>TE05-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG standard hookup wire</td>
			<td>AlphaWire</td>
			<td>1551</td>
			<td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batik wax</td>
			<td>Jacquard</td>
			<td>7946000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric waxer</td>
			<td>Almore International</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Myscroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #1 forceps (coarse)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500335</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14096</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500085</td>
			<td>For desheathing the nervious tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>For removing the cuticle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Saline perfusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension set with rate flow regulator</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set with Y injection site</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastant delivery system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&#34;, ID 1/8&#34;</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>B001JJT4SA</td>
			<td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Circuit Specialists</td>
			<td>ZD200BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool-Dremel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&#160;</td>
			<td>Industrial Netting</td>
			<td>XN5170</td>
			<td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized 16-Channel perfusion system&#160;</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-16H</td>
			<td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubing, ID 0.034&#34;, ID 0.050&#34;</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Co</td>
			<td>427421</td>
			<td>&#160;Output tube from the perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For controlling the output channel of the perfusion system.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1366</td>
			<td>For pumping water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, ID 1/16&#34; OD 1/8&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-95802-02</td>
			<td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>&#160;FS-V31M</td>
			<td>For monitoring tastant delivery.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-reflective fiber unit</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>FU35-FZ</td>
			<td>To connect the color sensor device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental periphery Wax</td>
			<td>Henry-Schein Dental</td>
			<td>6652151</td>
			<td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 3.7 L containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps 25.5 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500364</td>
			<td>To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Electrophysiology Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.C. amplifier</td>
			<td>Brown-Lee</td>
			<td>440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix&#160;</td>
			<td>TDS2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td>
			<td>16 Channel MA-800 Amplifier System&#160;</td>
			<td>B.E.S 2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>optiplex 780</td>
			<td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core&#160;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

new methods to study gustatory coding

Der Geschmackssinn erlaubt es den Tieren, Chemikalien in der Umwelt zu erkennen, was zu Verhaltensweisen führt, die für das Überleben entscheidend sind. Wenn Gustatory Receptor Neurons (GRNs) schmeckende Moleküle erkennen, kodieren sie Informationen über die Identität und Konzentration des Geschmacks als Muster der elektrischen Aktivität, die sich dann zu den Neuronen im Gehirn ausbreiten. Diese Muster bilden innere Darstellungen des Geschmacks, die es dem Tier erlauben, Handlungen auszuwählen und Erinnerungen zu bilden. Die Verwendung von relativ einfachen Tiermodellen war ein mächtiges Werkzeug, um Grundprinzipien in der sensorischen Kodierung zu untersuchen. Hier schlagen wir drei neue Methoden vor, um mit der Motte Manduca sexta die Gustatory Coding zu untersuchen. Zuerst stellen wir ein Dissektionsverfahren für die Freilegung der Oberkiefernerven und der subösophagealen Zone (SEZ) vor, was die Aufzeichnung der Aktivität von GRNs aus ihren Axonen ermöglicht. Zweitens beschreiben wir die Verwendung von extrazellulären Elektroden, um die Aktivität von mehreren GRNs aufzuzeichnen, indem man teTrommeln direkt in den N. maxillaris Drittens präsentieren wir ein neues System für die Bereitstellung und Überwachung, mit hoher zeitlicher Präzision, Impulse verschiedener Geschmacksrichtungen. Diese Methoden erlauben die Charakterisierung von neuronalen Reaktionen in vivo direkt von GRNs vor, während und nach der Verabreichung von Leckerbissen. Wir stellen Beispiele für Spannungsspuren dar, die von mehreren GRNs aufgenommen wurden, und stellen ein Beispiel dar, wie eine Spike-Sortierungstechnik auf die Daten angewendet werden kann, um die Antworten einzelner Neuronen zu identifizieren. Um unseren Aufzeichnungsansatz zu validieren, vergleichen wir extrazelluläre Aufnahmen von GRNs mit Tetroden zu intrazellulären Aufnahmen, die mit scharfen Glaselektroden erhalten wurden.

Die Aktivität von GRNs kann mit einer extrazellulären Tetrodelektrode vor, während und nach der Tastantabgabe aufgezeichnet werden ( Abbildung 6A und 6C ). Fig. 6A (mittlere und untere Tafeln) zeigt gefilterte (300-6.000 Hz) Spannungsspuren, die von jedem der vier Drähte aufgezeichnet werden, die im N. maxillaris angeordnet sind, wobei Signale mit unterschiedlichen Amplituden, die die Aktionspotentiale (Pfeile) widerspiegeln, beobachtet werden können. Ein 1 s Puls von Tastament (1 M Saccharose) wurde 2s nach Beginn des Experiments geliefert; Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht ( Bild 6A , oberes Feld). Die schmackhaft induzierten Spikes, die in jedem der vier Kanäle beobachtet werden können ( Abbildung 6A , Mitteltafel). GRNs können identifiziert und von Mechanosensoren (hier nicht gezeigt) unterschieden werden, wenn sie auf einige Geschmacksrichtungen und nicht auf andere reagieren Um einzelne Neuronenantworten aus den Tetrodenaufnahmen zu identifizieren und zu isolieren, führten wir mit einer Reihe von benutzerdefinierten Funktionen auf der Basis von Pouzats 31 und Kleinfelds 32 , 33 Methoden (diese Methoden sind in diesen Zitaten beschrieben: 10 , 29 ). Fig. 6B zeigt ein Beispiel einer Spikesortierung, die auf die in Fig. 6A gezeigten Daten angewendet wurde, in denen drei gut isolierte Einheiten gefunden wurden. Rasterplots aus Abbildung 6C zeigen die Reaktionen der drei isolierten Einheiten in Abbildung 6B auf sechs verschiedene Geschmacksstoffe (1 M Saccharose, Maltose und NaCl, 100 mM Koffein und 10 mM Berberin und Lobeline), die nacheinander (4 Versuch)S / tastant werden gezeigt). Wie in Abbildung 6C gezeigt , haben die aufgezeichneten GRNs unterschiedliche Ebenen der Baselineaktivität, die von stiller (GRNs 1) bis zu niedrig oder mäßig (GRN 2 und 3) reichen. Nach dem anstrengenden Beginn zeigen GRNs diverse Aktivitätsmuster und zeigen unterschiedliche Selektivität für die Geschmackstoffe. Zum Beispiel antwortete GRN 1 nur auf Saccharose, während GRN 2 auf Maltose und NaCl mit Stacheln von Spikes und Lobeline mit Spiking nur zu Beginn des Reizes reagierte. Darüber hinaus sind einige Reaktionen mit dem Timing des Stimulus verriegelt ( zB GRN 1-Antwort auf Saccharose), während andere Reaktionen die Dauer des Reizes ( zB GRN 3-Response auf Berberine) überdauern oder sowohl exzitatorische als auch inhibitorische Komponenten enthalten ( z GRN 2 -Antworten auf NaCl und Saccharose). Für weitere Informationen über die unterschiedlichen Empfindlichkeiten und Aktivitätsmuster von GRNs siehe Referenz 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Zur Validierung der Verwendung der Tetrode- und Spike-Sortierungstechniken zur Aufzeichnung von GRNs aus dem N. maxillaris haben wir intrazelluläre Aufnahmen von GRN-Axonen in anderen Tieren mit herkömmlichen scharfen Glaselektroden (Widerstand von 80-120 MΩ) durchgeführt. Wir fanden heraus, dass die Aktivitätsmuster, die unter Verwendung von intrazellulären Aufnahmen erhalten wurden, den Reaktionen ähnlich waren, die unter Verwendung der Tetrodentechnik beobachtet wurden ( 7 ). Die Spannungsspuren in der grünen Box in Panel A wurden intrazellulär von GRN 1 während 5 aufeinanderfolgenden Versuchen der Saccharose-Präsentation aufgezeichnet, und die gleichen Antworten werden als Raster-Diagramme in Panel B gezeigt. (Beachten Sie, dass diese Art von Antwort mit der mit Tetroden und Gezeigt in 6C .) GRN 2, aufgezeichnet mit scharfen intrazellulären Elektroden, zeigt ein breiteres Antwortmuster. <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse von Nervenaufnahmen mit extrazellulären Tetroden. ( A ) Gefilterte (300-6.000 Hz) Spannungsspuren, die von jedem der vier Drähte im N. maxillaris aufgezeichnet wurden, werden angezeigt (Mittelfeld). Ein 1 s Puls von Tastament wurde während der Zeitspanne angewendet, die durch eine rote Schattierung in der mittleren Platte angezeigt wurde. Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht, wie durch die rote Spannungsspur auf der oberen Tafel angezeigt und wird auf dem mittleren Feld durch den rot-schattierten Bereich angezeigt. Die gepunkteten horizontalen Linien bezeichnen +50 (oben), 0 (Mitte) und -50 (unten) μV. Eine Vergrößerung der Rohspannungsspuren entsprechend der Fläche innerhalb der vertikalen gestrichelten Linien ist dargestellt (Bodenplatte). Beispiele für Spikes sind durch die Pfeile gekennzeichnet. ( B ) Ein Beispiel für eine Spikesortierung, die auf die in der Platte A gezeigten Daten angewendet wird. Die Wellenformen, die an jedem der vier extrazellulären Drähte (1-4) aufgezeichnet wurden,E identifiziert mit drei verschiedenen GRNs (Einheiten 1-3), die zu den aufgezeichneten Signalen beitragen. Einzelne Ereignisse (farbige dünne Linien) und die mittlere (dicke schwarze Linie) werden für die drei Einheiten gezeigt. Es müssen mehrere statistische Kriterien betrachtet werden, um unabhängige Einheiten nach der Spike-Sortiermethode zuverlässig zu identifizieren (siehe Referenzen 10 , 29 ). ( C ) Rasterplots, die die Antworten der drei isolierten Einheiten auf eine Sequenz von sechs verschiedenen Tastants darstellen (4 Versuche / Geschmack sind gezeigt). Die Zeitspanne der schmackhaften Zustellung (1 s) wird durch den rot-schattierten Bereich angezeigt. Die Konzentrationen der Geschmacksstoffe waren entweder 1 M (Saccharose, Maltose, NaCl), 100 mM (Koffein) und 10 mM (Berberin und Lobeline). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Abbildung 7 : Intrazelluläre Aufnahmen von GRN-Axonen. ( A , grünes Kastenfeld) Spannungsspuren, die von einem GRN mit scharfen Glas intrazellulären Elektroden (Widerstand von 80 - 120 MΩ) aufgezeichnet wurden, die in den N. maxillaris eingebracht wurden, entstanden durch 5 aufeinanderfolgende Stimulationen mit 1 M Saccharose (Suc). ( B ) Raster-Plots der Reaktionen von zwei GRNs, einschließlich der in Panel A (Green Box Panel) gezeigten Reaktionen auf zwei verschiedene Talkants, die nacheinander geliefert wurden (100 mM Grau-Schriftfarbe, 1 M Schwarz-Schriftfarbe), aufgenommen mit scharfen Glas-Intrazellulären Elektroden In den N. maxillaris (7 Versuche / Geschmack und 3 Versuche / Wasser werden gezeigt). Die Tastzeit wird in den beiden Tafeln durch rot-schattierte Bereiche angezeigt. Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht, wie durch die roten Spannungsspuren am Boden jedes Panels angezeigt.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Neue Methoden zur Untersuchung der Geschmackskodierung | Neurowissenschaften | Video

New Methods to Study Gustatory Coding

Wir präsentieren drei neue Methoden, um die gustende Kodierung zu untersuchen . Mit einem einfachen Tier, der Motte Manduca sexta ( Manduca ) , beschreiben wir ein Dissektionsprotokoll, die Verwendung von extrazellulären Tetroden zur Aufzeichnung der Aktivität von mehreren Gustatorrezeptor-Neuronen und ein System zur Bereitstellung und Überwachung von präzise zeitgesteuerten Impulsen.

Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K Aufrufe.  National Institutes of Health (NIH).  Wir präsentieren drei neue Methoden, um die gustende Kodierung zu untersuchen . Mit einem einfachen Tier, der Motte Manduca sexta ( Manduca ) , beschreiben wir ein Dissektionsprotokoll, die Verwendung von extrazellulären Tetroden zur Aufzeichnung der Aktivität von mehreren Gustatorrezeptor-Neuronen und ein System zur Bereitstellung und Überwachung von präzise zeitgesteuerten Impulsen. 

Serie: New Methods to Study Gustatory Coding

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

How to Create and Use Binocular Rivalry

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent representation. However, when the eyes are presented with images that are sufficiently different from each other, an interesting thing happens: Rather than fusing the two images into a combined conscious percept, what transpires is a pattern of perceptual alternations where one image dominates awareness while the other is suppressed; dominance alternates between the two images, typically every few seconds. This perceptual phenomenon is known as binocular rivalry. Binocular rivalry is considered useful for studying perceptual selection and awareness in both human and animal models, because unchanging visual input to each eye leads to alternations in visual awareness and perception. To create a binocular rivalry stimulus, all that is necessary is to present each eye with a different image at the same perceived location. There are several ways of doing this, but newcomers to the field are often unsure which method would best suit their specific needs. The purpose of this article is to describe a number of inexpensive and straightforward ways to create and use binocular rivalry. We detail methods that do not require expensive specialized equipment and describe each method's advantages and disadvantages. The methods described include the use of red-blue goggles, mirror stereoscopes and prism goggles.

Binocular rivalry occurs when the eyes are presented with different images at the same location: one image dominates while the other is suppressed, and dominance alternates periodically. Rivalry is useful for investigating perceptual selection and visual awareness. Here we describe several easy methods for creating and using binocular rivalry stimuli.

Wie Erstellen und Verwenden von Binocular Rivalry

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent ...

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Study Gliazellen Heterogenität Einfluss auf Axon Wachstum Mit einer neuen Methode Cokultur

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Messung des subjektiven Wert des Risky und mehrdeutig Optionen mit Experimental Economics and Functional MRI Methoden

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Eine Methode, um eine Kraniotomie auf der Bauch Schädel des Neugeborenen Nagetiere Stellen

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...