Questo lavoro è stato sostenuto da una concessione intramurale da parte di NIH-NICHD a MS Ringraziamo G. Dold e T. Talbot della NIH-NIMH Instrumentation Core Facility per assistenza nella progettazione del sistema di consegna tastante.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti consentono di registrare in vivo da un animale relativamente semplice, Manduca sexta , a caratterizzare l&#39;attività di GRN multipli selezionati in modo casuale per lunghe durate (per più di 2 ore), prima, durante e dopo la consegna del sapore. Questi metodi consentono anche la rapida e sequenziale consegna di stimoli tastanti multipli con preciso controllo temporale, vantaggi utili per studiare meccanismi neurali alla base della rappresentazione tastante. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare come le risposte dei GRN ai tastanti vengono trasformate quando vengono trasmesse ai loro neuroni targetistici postinaptici ( ad es. Nella SEZ) monitorando GRN simultaneamente con gli interneuroni 10 monocinapticamente collegati. Inoltre, questi metodi possono essere adattati alle esigenze del sperimentatore, permettendo l&#39;esecuzione di paradigmi complessi per studiare aspetti fondamentali della codifica gustativa. Quando cominciaNei nostri studi, un problema tecnico a volte dovuto risolvere è stato l&#39;incapacità di rilevare segnali di picco dal nervo maxillare con i fili tetrode. Le cause possibili per questo sono diverse, poiché il protocollo di dissezione è impegnativo e occorre una certa pratica per ottenere una buona preparazione. Innanzitutto, durante la dissezione delle falene i nervi maxillari sono facili da danneggiare, soprattutto durante la rimozione della guaina che circonda il tessuto nervoso. In secondo luogo, se la guaina non viene rimossa completamente, i fili tetrode potrebbero non essere in grado di accedere al nervo. In entrambi i casi, avviare una nuova preparazione è spesso il modo più semplice per risolvere questi problemi. In terzo luogo, potrebbe esserci un problema con i cavi tetrode. Questo può essere verificato misurando l&#39;impedenza dei cavi che dovrebbe essere di ~ 270 kΩ a 1 kHz. Se il valore dell&#39;impedenza è superiore a ~ 300 kΩ, impilare i cavi con oro per ottenere l&#39;impedenza desiderata (vedi riferimento 30 ). Quarto, un pezzo di apparecchiatura potrebbe essere disconnessoO malfunzionamenti. Un altro possibile problema è che vengono registrati segnali spiking ma i neuroni sembrano non rispondere ai tastanti. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i neuroni registrati sono insensibili all&#39;insieme dei tastanti consegnati. Inoltre, è importante tenere a mente che, oltre agli assoni di GRN, il nervo maxillare porta anche fibre meccanosensorie. Così, è possibile registrare da neuroni meccanosensori anziché, o in aggiunta a, GRNs. Tuttavia, il sistema di consegna tastante è stato progettato per fornire un costante input meccanico durante l&#39;esperimento rendendo improbabile che le risposte a un tastante saranno confuse dalle risposte alla componente meccanica della sua consegna. I neuroni che rispondono ad alcuni ma non altri tastanti, o in modi diversi ai tastanti diversi, possono essere classificati in modo non definito come GRNs. Si consiglia di utilizzare tostanti appena diluiti per evitare variazioni di concentrazione o composizione tastante a causa del degrado o dell&#39;evaporazione compostaDel solvente. Raccomandiamo inoltre di pulire regolarmente il sistema per evitare contaminazioni e / o ostacoli. Un altro possibile problema tecnico è un rapporto segnale-rumore svantaggioso. Questo problema può essere spesso risolto con re-clorizzazione o regolazione della posizione dell&#39;elettrodo di terra del bagno. Altre soluzioni potrebbero richiedere schermature e ridurre al minimo la lunghezza di ogni connessione elettrica nell&#39;apparecchio. Infine, è importante notare che un&#39;analisi corretta dei dati ottenuti utilizzando le registrazioni di tetrode richiede un&#39;attenta selezione dei picchi. Abbiamo scoperto che i metodi completamente automatizzati sono generalmente inadeguati. Prima di analizzare i dati di tetrode 10 , 29 , 31 , 32 , 33 , si consiglia di familiarizzare con la letteratura di classificazione delle chiavi. Alternative alla nostra dissezione proPuò essere utilizzato il tocol. Qui abbiamo descritto una dissezione attraverso la parte ventrale della testa della falena, che fornisce l&#39;accesso ai nervi maxillari e SEZ, ma è anche possibile accedere a queste strutture attraverso la dissezione attraverso il lato dorsale. Abbiamo trovato che la preparazione laterale dorsale non è ottimale per fare registrazioni da queste strutture gustative grazie alla loro posizione profonda, ma questa preparazione offre il vantaggio di consentire registrazioni da strutture di ordine superiore come il corpo di funghi, un&#39;area associata a multi Integrazione -sensoriale, apprendimento associativo e elaborazione della memoria 34 . Ci siamo concentrati sull&#39;utilizzo di elettrodi tetrodi per registrare dal nervo maxillare, ma, come abbiamo illustrato, possono anche essere utilizzati standard elettrodi intracellulari affilati. Inoltre, entrambe le tecniche possono essere combinate per eseguire registrazioni simultanee da più aree cerebrali 10 . La letteratura neuroscienze offre molti esempi di iModelli nertebrati che si sono dimostrati potenti strumenti per rivelare principi fondamentali di elaborazione sensoriale, come la codifica olfattiva, che si applicano sia agli insetti che ai vertebrati 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Speriamo che i nostri metodi porti a nuove conoscenze fondamentali sulla codifica gustativa.

I sistemi gustativi e olfattivi generano le rappresentazioni interne delle sostanze chimiche nell&#39;ambiente, dando luogo a percezioni di gusti e odori, rispettivamente. Questi sensi chimici sono essenziali per elicitare numerosi comportamenti critici per la sopravvivenza dell&#39;organismo, che vanno dalla ricerca di compagni e pasti per evitare predatori e tossine. Il processo inizia quando le sostanze chimiche ambientali interagiscono con i recettori situati nelle membrane plasmatiche delle cellule del recettore sensoriale; Queste cellule, direttamente o attraverso interazioni con i neuroni, trasudano informazioni in merito all&#39;identità e alla concentrazione di sostanze chimiche in segnali elettrici. Questi segnali vengono poi trasmessi ai neuroni di ordine superiore e ad altre strutture cerebrali. Mentre questi passaggi avanzano, il segnale originale subisce sempre cambiamenti che promuovono la capacità dell&#39;organismo di rilevare, discriminare, classificare, confrontare e memorizzare le informazioni sensoriali e di selezionare un&#39;azione appropriata. Capire come il reggisenoIn trasforma le informazioni sulle sostanze chimiche ambientali per eseguire al meglio svariati compiti è una questione fondamentale nella neuroscienza. La codifica gustativa è stata considerata relativamente semplice: una visione ampiamente contenuta afferma che ogni molecola chimica che genera un gusto (un &quot;tastante&quot;) naturalmente appartiene ad una delle qualità del gusto di circa cinque o di base ( cioè dolce, amaro, acido , Salato e umami) 1 . In questa visione &quot;gusto di base&quot;, il lavoro del sistema gustativo è quello di determinare quale di questi gusti di base è presente. Inoltre, i meccanismi neurali sottostanti alla rappresentazione gusto di base nel sistema nervoso non sono chiari e sono ritenuti governati da una &quot;linea etichettata&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 o da un &quot;modello di fibra&quot; 7 </suP&gt; , codice 8 . In un codice di codice etichettato, ogni cellula sensoriale e ciascuno dei suoi seguaci neurali rispondono a una singola qualità di gusto, insieme formando un canale diretto e indipendente verso centri di lavorazione più alti nel sistema nervoso centrale dedicato a quel gusto. Al contrario, in un codice di pattern di fibre diverse, ogni cellula sensoriale può rispondere a molteplici qualità del gusto in modo che le informazioni sul tastante siano rappresentate dalla risposta complessiva della popolazione dei neuroni sensoriali. Sia che le informazioni gustative siano rappresentate dai gusti di base, attraverso linee etichettate, o attraverso un altro meccanismo, sia poco chiara ed è al centro della recente indagine 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Il nostro lavoro recente suggerisce che il sistema gustativo utilizza un codice di popolazione spatiotemporale da generareRappresentazioni di singoli sapori piuttosto che categorie di gusto di base 10 . Qui offriamo 3 nuovi strumenti per assistere nello studio della codifica gustativa. Innanzitutto, suggeriamo l&#39;uso della hawkmoth Manduca sexta come un organismo modello relativamente semplice adatto allo studio elettrofisiologico del gusto e descrivere una procedura di dissezione. In secondo luogo, suggeriamo l&#39;utilizzo di &quot;tetrodes&quot; extracellulari per registrare l&#39;attività dei singoli GRN. E, in terzo luogo, suggeriamo un nuovo apparecchio per la consegna e il monitoraggio di impulsi prefissati di tastante all&#39;animale. Questi strumenti sono stati adattati da tecniche che il nostro laboratorio e altri hanno usato per studiare il sistema olfattivo. Gli insetti come la frutta Drosophila melanogaster , la locusta Schistocerca americana e la falena Manduca sexta hanno da decenni forti risorse per comprendere i principi fondamentali sul nerVous, compresa la codifica sensoriale ( es., Olfazione 13 ). Nei mammiferi, i recettori del gusto sono cellule specializzate che comunicano con i neuroni attraverso complessi percorsi secondari messaggeri 1 , 14 . È più semplice negli insetti: i loro recettori del gusto sono neuroni. Inoltre, i percorsi di gusto dei mammiferi nei pressi della periferia sono relativamente complessi, caratterizzati da percorsi neurali multipli e paralleli e componenti importanti sono difficili da accedere, contenuti in piccole strutture ossee 15 . I percorsi di gusto dell&#39;insetto sembrano essere più semplici. Negli insetti, le GRN sono contenute in strutture specializzate noti come sensilla, situate nell&#39;antenna, bocche, ali e gambe 16 , 17 . I GRN proiettano direttamente la zona sottosofagea (SEZ), una struttura il cui ruolo è stato ritenuto prevalentemente gustativo 17 e che contiene secondo ordineNeuroni gustatori 10 . Da lì le informazioni si spingono verso il corpo per guidare riflessi e verso aree cerebrali più alte da integrare, conservare e, in ultima analisi, guidare scelte comportamentali 16 . È necessario caratterizzare le risposte del gusto periferico per capire come le informazioni di gusto vengono propagate e trasformate da punto a punto in tutto il sistema nervoso. Il metodo più comunemente usato per monitorare direttamente l&#39;attività neurale delle GRN negli insetti è la tecnica di registrazione delle punte 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Ciò comporta l&#39;immissione di un elettrodo direttamente su un sensillum, molti dei quali sono relativamente facili da accedere. Il tastante è incluso nell&#39;elettrodo, permettendo di attivare ed estrarreMisura racellulare le risposte neuronali delle GRN nel sensillum. Ma poiché il tastante è contenuto nell&#39;elettrodo, non è possibile misurare l&#39;attività GRN prima che il tastante venga consegnato o dopo essere stato rimosso o sostituito da tastanti senza sostituire l&#39;elettrodo 20 . Un altro metodo, la tecnica di registrazione &quot;parete&quot;, è stata utilizzata anche per registrare l&#39;attività di GRN. Qui, un elettrodo di registrazione viene inserito nella base di un sensitio di gusto 24 , e i tastanti vengono consegnati attraverso un capillare di vetro separato sulla punta del sensilum. Entrambe le tecniche limitano la registrazione da GRN ad un particolare sensillum. Qui suggeriamo una nuova tecnica: registrazione da assoni GRN randomly selezionati da sensilla diversa, mentre separatamente distribuire sequenze di tastanti alla proboscide. Le registrazioni Axon vengono ottenute mettendo elettrodi di vetro o fasci di elettrodi extracellulari (tetrodes) nel nervo che trasporta gli assoni daGRNs nella proboscide della SEZ 10 . In Manduca , questi assi attraversano il nervo maxillare, che è noto per essere puramente afferente, permettendo la registrazione inequivocabile delle risposte sensoriali 25 . Questo metodo di registrazione da assoni consente, per più di due ore, una misura stabile delle risposte GRN prima, durante e dopo una serie di presentazioni tastative. Qui descriviamo una procedura di dissezione per esporre i nervi maxillari insieme alla SEZ, che può consentire di registrare simultaneamente le risposte di più GRN e neuroni nella SEZ 10 . Descriviamo anche l&#39;uso di registrazioni extracellulari di GRN usando un tetrode a filo metallico a 4 canali personalizzato che, combinato con un metodo di ordinamento a picchi, consente l&#39;analisi simultanea di più (fino a sei) GRNs. Inoltre confrontiamo le registrazioni fatte con tetrodes a registrazioni effettuate con intracellulare forteelettrodi. Infine, descriviamo una nuova apparecchiatura per fornire stimoli tastanti. Adattato da apparecchiature utilizzate da molti ricercatori per distribuire odoranti negli studi di olfatto, la nostra nuova apparecchiatura offre vantaggi per studiare la tastatura: migliorare il sistema di consegna multicanale precedente, come quelli sviluppati da Stürckow e colleghi (vedi i riferimenti 26 , 27 ). Controllare la tempistica della consegna tastant mentre fornisce una lettura di tensione di questo tempo; E consente la rapida e sequenziale consegna di stimoli tastanti multipli 10 . L&#39;apparecchio bagna la proboscide in un flusso costante di acqua pulita in cui possono essere consegnati impulsi controllati di tastante. Ogni impulso tastante passa sopra la proboscide e viene poi lavato via. I sapori contengono una piccola quantità di coloranti alimentari insapori, permettendo al sensore di colore di monitorare, con tempi precisi, il passaggio di tastant ovLa proboscide.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Dissection and specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 ml -Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2&#34;&#160;</td>
			<td>&#160;MONOJET</td>
			<td>888200144</td>
			<td>For aplying air to remove the hair from the moth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&#160;</td>
			<td>DickBlick</td>
			<td>33268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish-100 x 15 mm&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89000-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip (1-200 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Techni Edge</td>
			<td>TE05-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG standard hookup wire</td>
			<td>AlphaWire</td>
			<td>1551</td>
			<td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batik wax</td>
			<td>Jacquard</td>
			<td>7946000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric waxer</td>
			<td>Almore International</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Myscroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #1 forceps (coarse)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500335</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14096</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500085</td>
			<td>For desheathing the nervious tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>For removing the cuticle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Saline perfusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension set with rate flow regulator</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set with Y injection site</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastant delivery system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&#34;, ID 1/8&#34;</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>B001JJT4SA</td>
			<td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Circuit Specialists</td>
			<td>ZD200BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool-Dremel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&#160;</td>
			<td>Industrial Netting</td>
			<td>XN5170</td>
			<td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized 16-Channel perfusion system&#160;</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-16H</td>
			<td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubing, ID 0.034&#34;, ID 0.050&#34;</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Co</td>
			<td>427421</td>
			<td>&#160;Output tube from the perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For controlling the output channel of the perfusion system.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1366</td>
			<td>For pumping water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, ID 1/16&#34; OD 1/8&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-95802-02</td>
			<td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>&#160;FS-V31M</td>
			<td>For monitoring tastant delivery.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-reflective fiber unit</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>FU35-FZ</td>
			<td>To connect the color sensor device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental periphery Wax</td>
			<td>Henry-Schein Dental</td>
			<td>6652151</td>
			<td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 3.7 L containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps 25.5 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500364</td>
			<td>To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Electrophysiology Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.C. amplifier</td>
			<td>Brown-Lee</td>
			<td>440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix&#160;</td>
			<td>TDS2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td>
			<td>16 Channel MA-800 Amplifier System&#160;</td>
			<td>B.E.S 2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>optiplex 780</td>
			<td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core&#160;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

new methods to study gustatory coding

Il senso del gusto consente agli animali di rilevare sostanze chimiche nell&#39;ambiente, dando vita a comportamenti critici per la sopravvivenza. Quando i Neuroni Gustatory Receptor (GRNs) rilevano molecole tastanti, codificano le informazioni sull&#39;identità e la concentrazione del tastante come modelli di attività elettrica che poi si propagano ai neuroni seguenti nel cervello. Questi schemi rappresentano rappresentazioni interne del tastante, che poi consentono all&#39;animale di selezionare azioni e di formare memorie. L&#39;uso di modelli animali relativamente semplici è stato un potente strumento per studiare i principi fondamentali nella codifica sensoriale. Qui proponiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa usando la falena Manduca sexta . In primo luogo, presentiamo una procedura di dissezione per esporre i nervi maxillari e la zona sottosofagea (SEZ), permettendo di registrare l&#39;attività dei GRN dai loro assoni. In secondo luogo, descriviamo l&#39;utilizzo di elettrodi extracellulari per registrare l&#39;attività di GRN multipli collocando teI fili di trode direttamente nel nervo maxillario. In terzo luogo, presentiamo un nuovo sistema di consegna e monitoraggio, con elevata precisione temporale, impulsi di tastanti diversi. Questi metodi consentono di caratterizzare le risposte neuronali in vivo direttamente da GRN prima, durante e dopo la consegna dei tastanti. Forniamo esempi di tracce di tensione registrate da più GRNs e presentano un esempio di come una tecnica di ordinamento di picchi può essere applicata ai dati per identificare le risposte dei singoli neuroni. Infine, per convalidare il nostro metodo di registrazione, confrontiamo le registrazioni extracellulari ottenute da GRN con tetrodes alle registrazioni intracellulari ottenute con elettrodi di vetro nitidi.

L&#39;attività di GRNs può essere registrata utilizzando un elettrodo tetrode extracellulare prima, durante e dopo la consegna del tastante ( Figura 6A e 6C ). La Figura 6A (pannelli centrale e inferiore) mostra tracce di tensione filtrate (300-6000 Hz) registrate da ciascuno dei quattro fili disposti nel nervo mascellare, dove si possono osservare segnali di diverse ampiezze che riflettono i potenziali d&#39;azione (frecce). Un impulso di tastan (1 M di saccarosio) di 1 s è stato consegnato 2 volte dopo l&#39;inizio dell&#39;esperimento; L&#39;inizio e l&#39;offset dello stimolo sono stati monitorati dal sensore di colore ( Figura 6A , pannello superiore). I tastanti hanno causato picchi che possono essere osservati in ciascuno dei quattro canali ( figura 6A , pannello centrale). I GRNs possono essere identificati e distinti dai meccanosensori (nessuno mostrato qui) quando rispondono ad alcuni tastanti e non altri Per identificare e isolare le risposte di singolo neurone dalle registrazioni di tetrode, abbiamo eseguito l&#39;ordinamento di spike off-line utilizzando un insieme di funzioni personalizzate basate sui metodi di Pouzat 31 e Kleinfeld 32 , 33 (questi metodi sono descritti in queste citazioni: 10 , 29 ). La Figura 6B mostra un esempio di ordinamento di spike applicato ai dati mostrati nella Figura 6A , in cui sono state trovate tre unità ben isolate. I diagrammi raster della Figura 6C descrivono le risposte delle tre unità isolate nella Figura 6B a sei diverse tipologie (1 M saccarosio, maltosio e NaCl, 100 mM caffeina e 10 mM berberina e lobeline) consegnati in sequenza (4 sperimentazioniS / tastant sono mostrati). Come mostrato nella Figura 6C , i GRN registrati hanno livelli diversi di attività di base, che vanno da silenziosi (GRNs 1) a bassi o moderati (GRN 2 e 3). Dopo l&#39;inizio tastante, i GRN mostrano diversi pattern di attività e mostrano una selettività diversa rispetto ai tastanti. Ad esempio, GRN 1 ha risposto solo al saccarosio, mentre GRN 2 ha risposto al maltosio e alla NaCl con burst di picchi e alla lobeline con spiking solo all&#39;insorgenza dello stimolo. Inoltre, alcune risposte sono bloccate alla temporizzazione dello stimolo ( ad esempio la risposta GRN 1 al saccarosio), mentre altre risposte superano la durata dello stimolo ( ad esempio la risposta GRN 3 a berberina) o contengono componenti sia eccitatoriali che inibitori ( ad esempio, Figura 7 Risposte GRN 2 a NaCl e saccarosio). Per ulteriori informazioni sulle diverse sensibilità e modelli di attività dei GRN, vedere il riferimento 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Per convalidare l&#39;uso delle tecniche di ordinamento di tetrodi e picchi per registrare GRN dal nervo maxillario, abbiamo eseguito registrazioni intracellulari da assoni GRN in altri animali utilizzando elettrodi di vetro nitidi convenzionali (resistenza 80-120 MΩ). Abbiamo riscontrato che i pattern di attività ottenuti utilizzando le registrazioni intracellulari erano simili a quelle riscontrate utilizzando la tecnica tetrode ( Figura 7 ). Le tracce di tensione nella scatola verde del pannello A sono state registrate intracellulariamente da GRN 1 durante 5 prove consecutive della presentazione di saccarosio e le stesse risposte sono mostrate come diagrammi raster nel pannello B. (Si noti che questo tipo di risposta corrisponde a quello ottenuto con tetrodes e Mostrato in Figura 6C .) GRN 2, registrata con elettrodi intracellulari affilati, mostra un modello di risposta più ampio. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figura 6: Risultati rappresentativi delle registrazioni dei nervi maxillari con tetrosi extracellulari. ( A ) Sono mostrate tracce di tensione filtrate (300-6,000 Hz) registrate da ciascuno dei quattro fili al nervo mascellare (pannello centrale). Un impulso di tastante da 1 s è stato applicato durante il periodo indicato dall&#39;ombreggiatura rossa nel pannello centrale. L&#39;inizio e l&#39;offset dello stimolo è stato monitorato dal sensore di colore come indicato dalla traccia di tensione rossa sul pannello superiore e viene indicato sul pannello centrale dall&#39;area a colori rossi. Le linee orizzontali punteggiate indicano +50 (alto), 0 (medio) e -50 (basso) μV. Viene mostrato un ingrandimento delle tracce di tensione raw corrispondenti all&#39;area all&#39;interno delle linee verticali tratteggiate (pannello inferiore). Esempi di punti sono indicati dalle frecce. ( B ) Un esempio di ordinamento di spike applicato ai dati mostrati nel pannello A. Le forme d&#39;onda registrate in ognuno dei quattro fili extracellulari (1-4) arE identificati con tre GRN differenti (unità 1-3) che contribuiscono ai segnali registrati. Sono indicate le manifestazioni individuali (linee sottili colorate) e la media (spessore della linea nera) per le tre unità. È necessario considerare un certo numero di criteri statistici per identificare in modo affidabile le unità indipendenti usando il metodo di classificazione delle chiavi (cfr. I riferimenti 10 , 29 ). ( C ) Le trame raster rappresentanti le risposte delle tre unità isolate ad una sequenza di sei diversi tastanti (4 prove / tastant sono mostrate). Il periodo di consegna tastant (1 s) è indicato dall&#39;area a colori rossi. Le concentrazioni di tastanti erano o 1 M (saccarosio, maltosio, NaCl), 100 mM (caffeina) e 10 mM (berberina e lobeline). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7 : Registrazioni Intracellulari da GRN Axons. ( A , pannello a scatola verde) Tracce di tensione registrate da un GRN con elettrodi intracellulari di vetro nitidi (resistenza di 80-120 MΩ) immessi nel nervo maxillario, causati da 5 stimoli consecutivi con 1 M sucrose (Suc). ( B ) Raster trame delle risposte di due GRN, comprese le risposte riportate nel pannello A (pannello verde), a due diversi tastanti consegnati in sequenza (100 mM colore grigio caratteri, 1M colore nero caratteri) registrati con elettrodi intracellulari di vetro nitidi Posizionati nel nervo maxillare (7 prove / tastant e 3 prove / acqua sono mostrate). Il tempo di consegna è indicato da aree a tonalità rosse in entrambi i pannelli. L&#39;inizio e l&#39;offset dello stimolo è stato monitorato dal sensore di colore, come indicato dalle tracce di tensione rossa nella parte inferiore di ciascun pannello.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa | Neuroscienze | Video

New Methods to Study Gustatory Coding

Presentiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa . Utilizzando un animale semplice, la falena Manduca sexta ( Manduca ) , descriviamo un protocollo di dissezione, l&#39;uso di tetrodes extracellulari per registrare l&#39;attività di molti neuroni gastatoriali e un sistema per la consegna e il monitoraggio di impulsi precisi di tastanti.

Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K Views.  National Institutes of Health (NIH).  Presentiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa . Utilizzando un animale semplice, la falena Manduca sexta ( Manduca ) , descriviamo un protocollo di dissezione, l'uso di tetrodes extracellulari per registrare l'attività di molti neuroni gastatoriali e un sistema per la consegna e il monitoraggio di impulsi precisi di tastanti. 

Video: New Methods to Study Gustatory Coding

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

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Neuroscienze

How to Create and Use Binocular Rivalry

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent representation. However, when the eyes are presented with images that are sufficiently different from each other, an interesting thing happens: Rather than fusing the two images into a combined conscious percept, what transpires is a pattern of perceptual alternations where one image dominates awareness while the other is suppressed; dominance alternates between the two images, typically every few seconds. This perceptual phenomenon is known as binocular rivalry. Binocular rivalry is considered useful for studying perceptual selection and awareness in both human and animal models, because unchanging visual input to each eye leads to alternations in visual awareness and perception. To create a binocular rivalry stimulus, all that is necessary is to present each eye with a different image at the same perceived location. There are several ways of doing this, but newcomers to the field are often unsure which method would best suit their specific needs. The purpose of this article is to describe a number of inexpensive and straightforward ways to create and use binocular rivalry. We detail methods that do not require expensive specialized equipment and describe each method's advantages and disadvantages. The methods described include the use of red-blue goggles, mirror stereoscopes and prism goggles.

Binocular rivalry occurs when the eyes are presented with different images at the same location: one image dominates while the other is suppressed, and dominance alternates periodically. Rivalry is useful for investigating perceptual selection and visual awareness. Here we describe several easy methods for creating and using binocular rivalry stimuli.

Come creare e utilizzare rivalità binoculare

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent ...

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Misurare il valore soggettivo di opzioni rischiose e ambigui utilizzando Economia Sperimentale e funzionali metodi MRI

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell&#39;ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Un metodo per fare una craniotomia sul ventrale Cranio di neonato Roditori

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...