Nós gostaríamos de agradecer Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan para discussões úteis. Agradecemos também Priya Begani de assistência durante as filmagens. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 AI071727 (para AO) e R01 GM110052 (a SLV).

Dia 1: Expressão de mordaça proteínas utilizando a transcrição in vitro-translation sistema baseado em Lysate germe de trigo 1. Preparação do HIV-1 Gag <ol><li> Remove todos os reagentes do kit comercial CECF de gérmen de trigo a partir de congeladores (lisados ​​de gérmen de trigo são armazenadas a -80 ° C; outros reagentes, a -20 ºC). Descongelar-los em gelo e misturar os componentes como apresentados na Tabela 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (alimentação mix) </td><td></td></tr><tr><td> solução de alimentação </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1.000 l </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mistura-2 (Lisado mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> lisados ​​de gérmen de trigo </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNase água livre </td><td> 7 ul </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> O DNA de plasmídeo em tampão TE (1 ug / uL) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> tampão de reacção </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composições de misturas necessárias para reacções de gérmen de trigo. Nota: Se o experimento foi concebido para examinar o efeito da remoção de ARN por ARNase de Gag de ligação à membrana, substituir inibidores de ribonuclease com água sem RNase. O DNA de plasmídeo deve ser livre de impurezas de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, plasmids preparados utilizando técnicas convencionais, mas não, kits de isolamento de plasmídeos endotoxina-livres têm sido utilizados com sucesso. instruções do fabricante também recomenda o uso de DNA dissolvido em água livre de nuclease. Se utilizando ADN suspensas em TE [Tris-HCl a 10 (pH 7,4) contendo EDTA 1 mM], evitar a utilização de concentrações mais baixas de ADN, uma vez que o EDTA em TE pode afectar o rendimento. Os plasmídeos dissolvido em tampão TE a uma gama de concentrações de 0,8-1 mg / mL foram utilizadas com sucesso. <ol start="2"><li> Primeiro adicione a mistura de alimentação (Mix-1) na cassete de reacção (câmara transparente). Em seguida, adicione a mistura de lisado (Mix-2) para a outra câmara (vermelho). Não introduzir bolhas ao adicionar as misturas nas suas respectivas câmaras, uma vez que podem conduzir a troca ineficaz dos componentes da solução e, portanto, reduzir a eficiência da reacção. </li><li> Cobrir as câmaras com a película adesiva fornecida com o kit. </li><li> Insira a cassete de reação no compartimento de cassete e incubate o conjunto durante 24 horas a 24 ° C a uma velocidade de agitação constante de 900 rpm num Eppendorf Thermomixer R. </li></ol> Dia 2: Preparar GUVs por eletroformação e colheita de germe de trigo Lysates 2. Preparação de GUVs <ol><li> Alíquotas lípidos dissolvidos em solventes inorgânicos tais como o clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol em frascos de vidro com tampas de rosca forrada com forros de teflon e embrulhados com parafilme. Lidar com lipídios com seringas de vidro Hamilton-tipo, ou se disponível, pontas de plástico de clorofórmio-resistente. Retire os frascos de vidro contendo lípidos para ser usado para preparação de GUV a -20 ºC congelador. <ol><li> Uma vez que os frascos são equilibrados até à temperatura ambiente, certifique-se por inspecção visual que as suspensões lipídicas são claras. A qualidade de lípidos, em particular lípidos ácidos, tais como fosfatidilserina palmitoil-oleoil (POP) e PI (4,5) P 2, é importante para experiências bem sucedidas. Não use lipídios que sãoem alíquotas durante mais de 2 meses. </li></ol></li><li> Pré-aquecer num bloco de aquecimento para a temperatura desejada. Esta temperatura deve ser de pelo menos 5 ° C superior à temperatura de fusão (Tm) do lípido (s) com a mais elevada Tm. </li><li> Calcular os volumes de lípidos necessários de acordo com os rácios molares desejados de lípidos. Para estudar o HIV-1 Gag de ligação aqui, utilizar as seguintes razões molares como mostrado na Tabela 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mistura de lípidos </td><td> razão molar </td><td> Volume (em mL) </td><td> da concentração </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P 2: 1 mg / mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Volumes de diferentes lipídios utilizada para obter GUVs. <ol start="4"><li> Adicione os volumes desejados de lípidos em um frasco de vidro com tampa de rosca limpo. </li><li> Lâminas de dimensões 25 x 50 x 1,1 mm3 e resistência 70-100 co (como descritos no catálogo) Uso de ITO revestido. Coloque duas lâminas ITO-revestidos de uma bancada limpa. Cada câmara eletroformação requer dois-tin-óxido de índio (ITO) lâminas de vidro -Revestido. Verificar que o lado condutora da lâmina de vidro é virada para cima, verificando a resistência utilizando um multímetro. Ele deve mostrar um valor de cerca de 200 Ω. Certifique-se a superfície das lâminas são limpos, limpando suavemente com 70% de etanol usando toalhetes sem fiapos. </li><li> Limpar a superfície exterior de uma agulha de uma seringa por RInsing com clorofórmio e colocar a seringa no bloco de calor. </li><li> Colocar uma nova lâmina de vidro revestido de ITO-no bloco de calor com o lado voltado para cima condutora e permitir que ele para equilibrar até à temperatura desejada geralmente cerca de 2-3 min. Não reutilize as lâminas de vidro ITO-revestidos para um risco potencial que o ITO-revestimento nas lâminas de vidro pode ser danificado durante procedimentos de limpeza. </li><li> Use um volume de 40-50 mL da mistura de lípidos para cada slide para uniforme e ainda rápida divulgação dos lipídios sobre a lâmina de vidro. Ajustar o volume total com um solvente orgânico apropriado tal como clorofórmio. <ol><li> Coloque uma metade do volume total da mistura de lípidos na lâmina de vidro e espalhou imediatamente o lípido usando a seringa limpa (passo 2.6) para dar uma película lipidica uniforme (movendo a agulha 2-3 vezes em toda a corrediça). Espalhe o filme lipídico gentilmente (mas rapidamente) para evitar qualquer dano ao revestimento ITO fina. Não uniforme difundir ou espalhar áspera pode levar a sub-óptimarendimentos ou heterogeneidade computacional de GUVs. </li><li> Portanto, certifique-se disseminação uniforme inspecionando o filme lipídico após espalhar antes de prosseguir para a próxima etapa. Se a opacidade do filme parece excessivamente não uniforme, refazer o procedimento usando uma nova lâmina. </li></ol></li><li> Colocar a lâmina revestido dentro de um prato de Petri com o lado revestido voltado para cima. </li><li> Repita os passos de 2,6-2,9 para o resto da mistura utilizando uma outra lâmina de ITO revestido. </li><li> Colocar a placa de petri contendo ambos os diapositivos numa câmara de vácuo convencional dessecação durante 60-90 minutos para remover quaisquer vestígios de solventes orgânicos. </li><li> Durante este processo, definido na incubadora para a mesma temperatura que a do bloco de aquecimento (65 ° C na maior parte dos casos) e pré-aquecer a 300 mM de uma solução de sacarose na incubadora. </li><li> Após a secagem, trazer o prato de petri para o banco e colocar a lâmina de vidro sobre uma superfície limpa. </li><li> Suavemente limpar uma junta de PDMS (Figura 1) usando 70% de etanol e seca-lo completely. </li><li> Colocá-lo sobre a lâmina de vidro revestida de lípido, como mostrado na Figura 1 e suavemente e pressione firmemente de modo a que as formas de vedação uma vedação estanque à água. Confirmar a ausência de lacunas entre a junta PDMS eo slide. Isto resulta na formação de uma câmara superficial que contém a solução de sacarose. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figura 1:. O layout da lâmina de vidro ITO revestido usado para eletroformação <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="16"><li> Encha a câmara com solução de sacarose pré-aquecido, sem quaisquer bolhas. </li><li> Coloque a outra lâmina revestida em cima para fazer um selo apertado. Certifique-se que não há bolhas. A montagem final deve aparecer como mostrado na Figura 2. Aperte o usin câmaraclips g Binder. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figura 2:. Representação esquemática da câmara de eletroformação (vista lateral) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="18"><li> Retire o excesso de sacarose por aspiração e limpar os slides usando toalhetes sem fiapos. Apertem os slides para a barra de cobre para que os lados condutores estão em contato uniforme com a barra. Certifique-se de que apenas um lado condutor da placa de vidro está em contacto com uma barra de cobre. </li><li> Conectar-se a barra de cobre para a saída do gerador de função usando as garras jacaré. Coloque o conjunto dentro da incubadora para permitir que o conjunto para equilibrar com a temperatura desejada. </li><li> Aplique uma freqüência de onda senoidal de 10 Hz e uma diferença de potencial de 1 V por 90 min. assegue que a tensão é 1 V por um multímetro conforme mostrado na Figura 3. Continuar o processo durante 90 min. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figura 3:. As posições em que os eléctrodos do multímetro são colocados para medir a frequência e corrente <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="21"><li> Após 90 min, lentamente diminuir a frequência de 2 Hz e continuar eletroformação durante mais 10 min. Durante este tempo, a colheita em reacções de tradução in vitro (passos 3,1-3,2). </li><li> Desligue o gerador de função e permitir que o conjunto arrefecer lentamente à temperatura ambiente (desligando a incubadora e deixando a porta da incubadora ligeiramente aberta). </li><li> Após o resfriamento, desconecte os cabos do geradordos conjuntos deslizantes. GUVs pode ser muito frágil e, portanto, precisa ser manuseado com muito cuidado. trazer cuidadosamente o conjunto para o banco. </li><li> Desmonte a câmara, removendo suavemente o cursor superior usando uma pinça. Colheita das suspensões contendo GUVs sacarose utilizando uma ponta ul corte 1.000 e transferir para um tubo limpo. Lidar com o tubo suavemente para evitar a interrupção de GUVs. </li><li> Use as GUVs imediatamente. GUVs são estáveis ​​durante pelo menos 90 minutos após a colheita, quando armazenados à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Reacções colheita tradução in vitro <ol><li> Colher as reacções de tradução in vitro contendo proteínas desejadas a partir da câmara de vermelho utilizando uma micropipeta para um tubo. </li><li> Para remover proteínas agregadas, girar os lisados ​​a 16200 xg durante 15 min numa centrífuga de mesa e transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. </li></ol> 4. ensaio de ligação GUV <ol><li> Usando uma ponta de corte, misturar 51; l de reacções de tradução in vitro contendo proteínas traduzidas e 5 ul de GUVs em um tubo e incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Anexar uma folha de PDMS com um pequeno furo (3-4 mm de diâmetro) em uma lamela limpa e garantir a vedação estanque, pressionando-o suavemente e firmemente contra a lamela. </li><li> Coloque a mistura de 10 ul a partir do passo 4.1 no pequeno orifício. </li><li> Imagem a mistura sob um microscópio de fluorescência invertido confocal de epi ou à temperatura ambiente. Nota: Para evitar a evaporação, a câmara de imagem pode ser coberto por uma lamela. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. 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We declare that we have no conflicting interests.

O ensaio de ligação GUV como descrito acima fornece uma boa alternativa em situações onde outros ensaios de interação proteína-lipídica têm as suas limitações. Este ensaio nos permite examinar as interações entre ácido mirístico Gag de corpo inteiro e lipídios ácidos com cadeias acilo de comprimento nativa no contexto bicamada lipídica e fazê-lo sem longas centrifugação flotação por meio de alta densidade gradientes de sacarose ou outro processamento pós-obrigatório de Gag-lipídico complexos. Outra vantagem é que o comportamento de Gag pode ser examinado numa mistura complexa (por exemplo, na presença de componentes citosólicos), que não é prontamente conseguidas em outras técnicas em tempo real, tais como os ensaios baseados em ressonância de plasmon de superfície. Portanto, pode-se argumentar que o ensaio aqui descrito permite a avaliação em tempo real, de interacções lípidos Gag-ácidos num contexto mais nativa do que outros ensaios utilizados no campo. No entanto, existem limitações associadas com o método tal comobem. Para assegurar que GUVs em um determinada preparação têm composição semelhantes uns aos outros e à mistura original, eletroformação deve ser realizada bem acima da temperatura de transição dos lípidos que têm a mais alta temperatura de transição presente na mistura de 25,26. No entanto, é possível que a exposição dos lípidos a temperaturas superiores para períodos mais longos podem conduzir a quebra de lipídios 25,27. Portanto, para controlar a qualidade de GUVs, além de inspecção visual activada por inclusão de corantes fluorescentes (por exemplo, lípidos, fez), é desejável testar a funcionalidade do lípido de interesse [por exemplo, PI (4,5) P 2 ] utilizando uma sonda específica para lípido. Para além disso, com composições GUV que dão origem à separação de fases a uma determinada temperatura, deve ser tomado cuidado para manter precisamente uma temperatura desejada quando observando a interacção proteína-GUV. Outra limitação é que as soluções de maior força iônica são incompatíveis com o electroProtocolo de formação descrito aqui, e, por conseguinte, GUVs são cultivadas e mantidas em solução de sacarose 300 mM 26. Notavelmente, entretanto, alguns estudos têm buffers em forças iônicas fisiológicas utilizado com sucesso nos seus protocolos eletroformação modificados 28. Um aspecto crítico é a quantidade de Gag. Um sistema baseado em lisado de reticulócitos de coelho é muitas vezes utilizado para a preparação de comprimento completo Gag de HIV-1 em ensaios de lipossoma de flotação. No entanto, a quantidade de YFP-tagged Gag de comprimento completo obtido deste sistema era insuficiente para a visualização de Gag ligação a GUVs. Para resolver este problema, o sistema de transcrição-tradução de gérmen de trigo à base de lisado livre de células, que produz cerca de 8-10 vezes maior quantidade de Gag, foi utilizado no ensaio actual. No entanto, se as experiências de ligação GUV precisa ser realizada na ausência de componentes de lisado de células eucarióticas, pode-se utilizar as proteínas purificadas marcadas com um fluoróforo como tem sido feito recentemente (descrito abaixo). Tem sido demonstrado que específica e eficiente de ligação de Gag de membranas é um processo cooperativa regulada por vários factores, tais como miristato, ARN, headgroups lipídicos e cadeias de acilo, interacções Gag e Gag-(revisto em 29 de referência). O sistema in vitro descrito aqui pode ser ampliado para tratar o papel de factores individualmente ou em combinação de compreender a ordem dos eventos no processo cooperativa de Gag ligação à membrana. Até agora, o sistema de ensaio descrito elucidado um papel inesperado de cadeias acilo insaturadas PI (4,5) P 2 em ligação de Gag, mas não a de uma célula-PI-origem mamífera canónica (4,5) P 2 ligaï¿½o ao domínio ( o domínio de homologia plecstrina de fosfolipase C delta 1) 24, a conclusão de que não tinham sido reveladas por ensaios de lipossoma de flotação. sistemas de ensaio baseados em GUV também têm sido utilizados para compreender outros aspectos da biologia Gag. Usando um derivado Gag contendo um multim inducible artificialmotif erization e GUVs com a jangada-like e não-jangada como domínios, Keller et al. examinaram a relação entre o particionamento da mordaça para os domínios &#39;jangada-like&#39; e multimerização 30. Um estudo realizado por Carlson et al. Tem usado o sistema GUV e Gag purificada e marcada com fluorescência para compreender a ordem sequencial do recrutamento de vários complexos endossomal triagem necessários para o transporte (ESCRT) proteínas pelo Mordaça ligada à membrana 31. Recentemente, outro estudo relatou a reconstituição do processo de brotamento de vesículas induzida por Gag na GUV usando Gag conjugado com um fluoróforo 32. Gag de HIV-1 multimerização conduz à formação de rede da mordaça submembrane que é pensado para curvar as membranas durante a montagem. Portanto, com mais melhorias em sistemas de ensaio Gag-GUV, a relação entre as mudanças de curvatura da membrana e da membrana da mordaça de ligação, que é sem dúvida o aspecto menos bem compreendido de reunião HIV, pode ser analisado como está sendo feito for outras proteínas celulares sensíveis à curvatura 33. Em resumo, usando esse protocolo, pode-se obter quantidades suficientes de miristoiladas Gag full-length e visualizar Gag ligação a membranas GUV. Este protocolo pode ser desenvolvido para examinar vários estágios de HIV-1 montagem e processos de brotamento.

vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é um vírus com envelope que monta a e gomos a partir da membrana plasmática (PM) na maior parte dos tipos de células. A montagem do HIV-1 partículas de vírus é conduzida por a proteína de núcleo virai de 55 kDa chamado Pr55 Gag (GAG). Gag é sintetizado como um precursor de poliproteina composto por quatro domínios estruturais principais, isto é, matriz, da cápside, nucleocápside, e P6, bem como dois péptidos espaçadores SP1 e SP2. Durante a montagem, o (MA) de domínio matriz é responsável pelo direcionamento de mordaça para o local de montagem, o capsídeo (CA) de domínio medeia interações-Gag Gag, o (NC) de domínio nucleocï¿½side recruta RNA genômico viral, e fatores do hospedeiro p6 recrutas que auxiliam vírus cisão de partícula a partir da membrana plasmática. Gag também sofre uma modificação co-translacional pela adição de um ácido gordo de 14 carbonos ou radical miristato na sua extremidade N-terminal. ligação de Gag membrana é um requisito essencial para a montagem viral, uma vez que mutants que são defeituosos na ligação à membrana não produzem partículas virais. Nós e outros autores mostraram que a ligação de gag é mediada por sinais bipartidos dentro do domínio MA membrana: a porção miristato de N-terminal que medeia interacções hidrófobas com a bicamada lipídica e um aglomerado de resíduos básicos dentro do domínio MA denominado como região altamente básica ( HBR) que interage com lípidos ácidas sobre o PM 1-4. Estudos de gag-membrana interacções utilizando a expressão ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), uma enzima que catalisa a hidrólise do fosfolípido phosphatidylinositol- ácida PM-específico (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, em células sugeriram que Gag-AM localização é mediada por PI (4,5) P 2 3,5. No entanto, estudos in vitro visando a entender mais detalhes mecanicistas de Gag-PI (4,5) P 2 interações têm provado ser um desafio para um número de razões. Paraexemplo, a purificação de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 por experiências bioquímicas tem sido tecnicamente difícil, pelo menos em parte, devido à tendência de Gag para agregar durante a purificação. Assim, as formas truncadas de HIV-1 da mordaça, tais como Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou a forma não-miristoiladas têm sido frequentemente utilizada em estudos que necessitam de purificação da mordaça (por exemplo, ressonância magnética nuclear, a pegada de proteína, e a superfície ressonância de plasma de 6-9). Alternativamente, acoplados em reacções de transcrição-tradução in vitro têm sido utilizados para produzir de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 em outros estudos bioquímicos 1,2. Tipicamente neste sistema, um plasmídeo Gag-codificação é transcrita e traduzida com lisados ​​de células eucarióticas (por exemplo, os lisados ​​de reticulócitos de coelho) que são desprovidas de quaisquer membranas celulares e RNAs mensageiros mas contêm os mecanismos de transcrição e tradução. Após a reacção, os lisados ​​de células que contêm gag são misturados com membranes para análise das interações da mordaça com lipídios. Além da facilidade de preparação de comprimento completo miristoilada Gag, os métodos que utilizam o sistema de tradução in vitro de transcrição têm uma vantagem que a síntese de gag e reacções de ligação à membrana posterior ocorrer num meio &#39;eucariótica citosol-like &quot;, que podem representar melhor as condições fisiológicas. Esta propriedade contribuiu para os estudos que mostraram que as moléculas de RNA ligadas ao domínio MA regular Gag ligação a lípidos ácidas de forma competitiva 1,2,10-12. No entanto, uma vez que a quantidade total de proteínas Gag obtidos nestes lisados ​​de células não são elevadas, a marcação metabólica das proteínas com aminoácidos marcados radioactivamente é necessário para a sua detecção. Dependendo do método para medir as interações Gag-lípidos, têm sido utilizados uma variedade de preparações de membrana. Cada um desses métodos tem seus pontos fortes e limitações. A maioria dos ensaios baseados-RMN requerem a utilização de lípidos com acilo curtocadeias que são solúveis em água (por exemplo, C4-C8-e PI (4,5) P 2) 6,8. Enquanto os métodos de RMN de teste de ligação de Gag aos lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento encontradas nas células estão a ser desenvolvidos, eles foram usados ​​apenas com MA com ácido mirístico ou nonmyristoylated, até agora, 8,13. Em alternativa, os lipossomas preparados a partir de lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento nativos têm sido utilizados em métodos bioquímicos, tais como lipossomas ou flotação fluorescente talão lipossoma ensaios de ligação 2,3,10,14-16. No entanto, os lipossomas utilizados nestes ensaios têm pequenos diâmetros, e, assim, as suas membranas têm curvaturas acentuadas e positivos. Em contraste, durante a fase inicial de montagem de partículas em células de VIH-1 infectados, Gag se liga ao PM, que é praticamente planar na escala de Gag, e, subsequentemente, induz curvatura negativa durante a floração. Portanto, as membranas de lipossomas com curvatura acentuada e positivo pode não ser bicamadas lipídicas ideais para estudar as interações da mordaça-lipídico. Quanto Flot lipossomaensaios ation, outra ressalva potencial é que a exposição de complexos Gag-lipídicas para gradiente de sacarose hipertônica durante a centrifugação pode afetar o resultado experimental. Para atenuar estas limitações e proporcionar um sistema experimental complementar, para ensaios de ligação a GAG de gigantes vesículas unilamelares (GUVs) têm sido desenvolvidos nos últimos anos. GUVs são vesículas única bicamada lipídica cujos diâmetros se estendem a várias dezenas de micrómetros. Assim, a curvatura destas membranas se assemelha a PM na escala de Gag. Além disso, devido ao seu grande tamanho, que permite a inspeção visual sob microscópios ópticos, ligação à membrana proteínas da mordaça de fluorescência marcados ou rotulados com essas vesículas após a mistura pode ser facilmente determinada sem tratamento posterior dos complexos Gag-lipídicas. Nós aqui descrevemos um protocolo para estudar HIV-1 Gag membrana ligação usando GUVs obtidos a partir de um método eletroformação. Vários métodos, tais como a hidratação suave, hidratação assistida-gel, microfonerofluidic de jacto, e eletroformação 17-22 têm sido usados ​​para obter GUVs. Para o protocolo aqui descrito, o método da eletroformação é utilizado principalmente devido à sua eficiência na formação GUVs lípidos com ácidos e a sua relativa facilidade de utilização, sem a necessidade de instalações dispendiosas. Uma vez que a visualização de Gag necessita de um repórter fluorescente, amarela proteína fluorescente (YFP) está geneticamente adicionado ao C-terminal de Gag (gag-YFP). Proteínas gag-YFP são obtidos por reacções de transcrição in vitro e tradução em lisados ​​de gérmen de trigo com base na tecnologia contínua de permuta de fluxo contínuo (CECF). Nesta tecnologia, tanto a remoção de produtos secundários inibidores das reacções e fornecimento de substratos de reacção e componentes de energia são alcançados de um mecanismo baseado em diálise. Para estas reacções, é usado um plasmídeo que codifica Gag-YFP sob o controlo de um promotor de T7. É de notar, como mostrado anteriormente, lisados ​​de gérmen de trigo apoiar miristoilaï¿½o sem componentes adicionais 23,24. Usando este método, foi possível obter quantidades suficientes de comprimento completo miristoilada Gag-YFP para visualização de Gag em membranas GUV 24. Aqui nós descrevemos o protocolo com a qual o HIV-1 Gag ligação a PI (4,5) P 2 molecular contendo membranas GUV podem ser examinados sem processamento subsequente longa seguinte reacções de ligação e propor que este método complementa preexistente Gag-membrana ensaios de ligação e pode ser estendido para entender melhor o HIV-1 Gag-membrana vinculativo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Meterman</td>
			<td>30XR</td>
			<td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Instek</td>
			<td>GFG-8216A</td>
			<td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO</td>
			<td>CG-90IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>21516-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80400</td>
			<td>Gauge 22S, Syringe number 702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td>
			<td>Sylgard, 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td>
			<td>BiotechRabbit, 
			Berlin, Germany</td>
			<td>BR1401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&#160;</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700041P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-PI(4,5)P2&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

A proteína estrutural do VIH-1, Pr55 da mordaça (ou GAG), liga-se à membrana plasmática em células durante o processo de montagem do vírus. ligação de Gag membrana é um passo essencial para a formação de partículas de vírus, uma vez que um defeito no resultado de ligação à membrana da mordaça em grave comprometimento da produção de partículas virais. Para obter detalhes mecanísticos de interacções da membrana Gag-lipídicos, e métodos in vitro com base em RMN, a pegada de proteína, ressonância de plasma de superfície, a centrifugação dos lipossomas de flutuação, ou grânulo fluorescência ligação de lípidos têm sido desenvolvidos até agora. No entanto, cada um destes métodos in vitro tem as suas limitações. Para ultrapassar algumas destas limitações e proporcionar uma abordagem complementar com os métodos previamente estabelecidos, foi desenvolvido um ensaio in vitro em que as interacções entre o HIV-1 gag e membranas lipídicas ter lugar num ambiente de &quot;célula-like&quot;. Neste ensaio, Gag ligação a membranas lipídicas é visualmente analisadas usando-YFP Tagged Gag sintetizado em um germe de trigo baseada no sistema de tradução in vitro e GUVs preparados por uma técnica da eletroformação. Aqui nós descrevemos os antecedentes e os protocolos para obtenção de proteínas da mordaça completos com ácido mirístico e membranas GUV necessárias para o ensaio e para detectar Gag-GUV ligação por microscopia.

<html> Usando o protocolo acima, preparamos GUVs compostos por POPC + + POPS Chol (razão molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composição foi escolhida para aproximadamente reflectir as concentrações de colesterol e de PS PM. Robusto e eficiente ligação de Gag foi observada somente quando o cérebro-PI (4,5) P 2 foi incluída na mistura POPC + POPS + Chol-PI cerebral (4,5) P 2 [razão molar (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1], neste exemplo) (Figura 4, comparar os painéis B e D com a e C). Ligação a GUVs compostos por POPC + gag-YFP POPS Chol + + cérebro-PI (4,5) P 2 é evidente pelo aumento na intensidade de fluorescência na superfície da membrana. Este aumento pode também ser visto em perfis de intensidade de fluorescência (Figura 4, parte inferior) ao longo da linha que atravessa a fronteira GUV (XX &#39;na Figura 4C e D). carga / 54293 / 54293fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Gag se liga ao cérebro-PI (4,5) P 2 -contianing GUVs A seção transversal confocal de POPC + POPS + Chol (A e C) e POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P 2. GUVs (B e D). Distribuição de Gag-YFP é mostrado em verde. imagens ampliadas das GUVs selecionados (caixas amarelas) são mostrados em painéis C e intensidade D. Fluorescência perfis ao longo de linhas escolhidas aleatoriamente desenhados para atravessar os lados opostos do GUVs (X para X &#39;) são mostrados abaixo das imagens. Bar = 5 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K visualizações.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

Vídeo: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em&gt; In vitro</em&gt; Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.