私たちは便利な議論のためのモハンマドサリーム、ジン呉とクリシュナンRaghunathanに感謝したいと思います。また、撮影中に支援するためのプリヤBeganiに感謝します。この作品は、国立衛生研究所R01 AI071727（AO）と（SLV）はR01 GM110052を付与することによってサポートされています。

1日目：小麦胚芽溶解物ベースのin vitro転写・翻訳システムを用いたGagタンパク質の発現 HIV-1のGagの調製<ol><li>冷凍庫から商業小麦胚芽CECFキットの全ての試薬を取り外します（小麦胚芽溶解物を-80ºCで保存されている。-20ºCで他の試薬）。氷の上で解凍し、 表1に示す成分を混合。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ミックス-1（摂食ミックス） </td><td></td></tr><tr><td>供給溶液</td><td> 900μlの</td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td> 80μlの</td></tr><tr><td>メチオニン</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 千μlの </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> ミックス-2（溶解物ミックス） </strオング&gt; </td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽溶解物</td><td> 15μlの</td></tr><tr><td> RNaseを含まない水</td><td> 7μlの</td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>メチオニン</td><td> 1μlの</td></tr><tr><td> TE緩衝液中のプラスミドDNA（1μgの/μl）を** </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>反応緩衝液</td><td> 15μlの</td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 50μlの </td></tr></tbody></table> 表1：コムギ胚芽反応に必要な混合物の組成物。 注：この実験は、GAG結合膜上のRNaseによるRNA除去の効果を調べるために設計されている場合は、RNaseフリー水でリボヌクレアーゼ阻害剤を交換してください。プラスミドDNAを、製造業者の指示に従って不純物から自由でなければなりません。しかし、Plasmids従来のではなく、エンドトキシンフリーを用いて調製し、プラスミド単離キットが正常に使用されてきました。製造元の指示はまた、ヌクレアーゼフリー水に溶解したDNAを使用することをお勧めします。 TE [1mMのEDTAを含む10mMトリス-HCl（pH7.4）]中に懸濁したDNAを使用する場合、TEにおけるEDTAの歩留まりに影響を与える可能性があるため、DNAの低濃度の使用を避けます。 0.8から1μgの/μlの濃度範囲でのTE緩衝液に溶解したプラスミドは、成功裡に使用されています。 <ol start="2"><li>最初の反応カセット（透明室）に供給混合物（ミックス-1）を追加します。その後、他のチャンバ（赤）に溶解液ミックス（ミックス-2）を追加します。それぞれの室に混合物を添加しながらそれは溶液成分の非効率的な交流につながるため、反応の効率を低下させる可能性があるため、任意の気泡を導入しないでください。 </li><li>キットに付属の接着フィルム付き室をカバーしています。 </li><li>カセットホルダーとincubaに反応カセットを挿入しますエッペンドルフサーモミキサーRに900rpmでの一定の振とう速度で24ºCで24時間のアセンブリをTE </li></ol> 2日目：電鋳と収穫小麦胚芽ライセートによってGUVsを準備 GUVsの調製<ol><li>このようなスクリューキャップテフロンライナーでライニングし、パラフィルムで包まれたガラスバイアル中のクロロホルムとメタノールのクロロホルムまたはこれらの混合物などの無機溶媒に溶解したアリコート脂質。ハミルトン型ガラスシリンジ、または利用可能な場合、クロロホルム-性プラスチックのヒントと脂質を扱います。 -20ºCの冷凍庫からGUVの調製のために使用される脂質を含有するガラスバイアルを取り出し。 <ol><li>バイアルを室温に平衡化されると、脂質懸濁液が明確であることを目視により確認してください。脂質の品質、このようなパルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン（POPS）とPI（4,5）P 2として特に酸性脂質は、成功した実験のために重要です。ある脂質を使用しないでくださいより長い2ヶ月アリコートインチ</li></ol></li><li>所望の温度に加熱ブロックを事前に温めます。この温度は、最も高いT mを有する脂質（複数可）の融解温度（T m）よりも少なくとも5ºC高くなければなりません。 </li><li>所望のモル脂質比に応じて必要な脂質量を計算します。 表2に示すように、ここで結合HIV-1のGagを研究するために、以下のモル比を使用します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 脂質ミックス </td><td> モル比 </td><td> 容量（μL中） </td><td> ストック濃度 </td></tr><tr><td> POPC + POPS +チョル</td><td> 46.​​6 + 23.3 + 30 </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC、POPS、チョル：10 mg / mlで</td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2 </td><tdROWSPAN = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8.3 + 6.25 + 58.19 </td><td> POPC、POPS、チョル：10 mg / mlで</td></tr><tr><td>脳-PI（4,5）P 2：1mg / mlの</td></tr></tbody></table> 表2：異なる脂質のボリュームはGUVsを得るために使用されます。 <ol start="4"><li>きれいなスクリューキャップガラスバイアル中の脂質の所望のボリュームを追加します。 </li><li>寸法25×50×1.1ミリメートル3と抵抗70から100Ω（カタログに記載されているように）の使用ITO被覆スライド。クリーンベンチ上の2つのITO被覆スライドを置きます。各エレクトロフォーメーションチャンバーは、二つのインジウムスズ酸化物（ITO）被覆ガラススライドを必要とします。スライドガラスの導電側はマルチメータを使用して抵抗をチェックすることにより、上を向いていることを確認します。これは、約200Ωの値を表示する必要があります。スライドの表面をやさしくリントフリーワイプを用いて70％エタノールで拭いてきれいであることを確認します。 </li><li>里によって注射器の針の外面を清掃してくださいクロロホルムでそれをnsingし、ヒートブロック上に注射器を置きます。 </li><li>上を向いて導電側をヒートブロック上に新しいITO被覆ガラススライドを置き、それは通常、約2〜3分所望の温度に平衡化することができます。ガラススライド上のITOコーティングが手続きを洗浄中に破損する可能性がある潜在的なリスクのためのITO被覆ガラススライドを再利用しないでください。 </li><li>均一でスライドガラス上の脂質の広がりはまだ迅速なため、各スライドの脂質混合物の40〜50マイクロリットルの容量を使用してください。クロロホルムなどの適当な有機溶媒との総容量を調整します。 <ol><li>スライドガラス上の脂質混合物の総体積の半分を置き、すぐに均一な脂質フィルム（スライド全体に針2-3回の移動）を残すために洗浄シリンジ（ステップ2.6）を使用して、脂質を広げます。薄いITOコーティングへの損傷を避けるために穏やかに脂質フィルムを広げて（ただし迅速に）。不均一な拡散またはサブ最適につながる可能性が広がるラフ利回りまたはGUVsの計算異質。 </li><li>そのため、後の次のステップに進む前に広がる脂質フィルムを検査することにより、均一な広がりを確保します。フィルムの不透明度が過度に不均一に表示された場合は、新しいスライドを使用して手順をやり直し。 </li></ol></li><li>コー​​ティングされた側を上に向けてペトリ皿の内側コートスライドを置きます。 </li><li>別のITO被覆スライドを用いて混合物の残りの手順を2.6から2.9を繰り返します。 </li><li>有機溶剤の痕跡を除去するために、60から90分間、従来の真空乾燥室​​でスライドの両方を含むペトリ皿を置きます。 </li><li>このプロセスの間に、ヒートブロック（ほとんどの場合、65ºC）とプリ暖かい300mMのインキュベーター中のスクロースの溶液と同じ温度にインキュベーターを設定します。 </li><li>乾燥させた後、ベンチにペトリ皿を持参し、清潔な表面上にスライドガラスを配置します。 </li><li>静かに70％エタノールとドライそれのcompleを使用して、PDMSガスケット（ 図1）をきれいにtely。 </li><li> 図1に示すように、脂質コーティングされたガラススライド上に置き、ゆっくりとしっかりとガスケットは水密シールを形成するように押してください。 PDMSガスケットとスライドとの間にギャップが存在しないことを確認してください。これは、蔗糖液を保持している浅い室が形成されます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> 図1：電鋳のために使用されるITO被覆ガラススライドのレイアウトは、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="16"><li>気泡のない予熱したショ糖溶液でチャンバーを埋めます。 </li><li>気密シールを作るために上に他のコーティングされたスライドを配置します。気泡がないことを確認してください。 図2に示すように、最終的な組み立てが表示されます。チャンバーusinを固定しますGバインダークリップ。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> 図2：エレクトロフォーメーション室（側面図）の概略図 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="18"><li>吸引により過剰のスクロースを取り外し、リントフリーワイプを使用してスライドを清掃してください。導電性の側面では、バーと均一に接触するように銅バーにスライドを固定します。ガラススライドの一方のみ導電側は1つの銅棒に接触していることを確認してください。 </li><li>ワニ口クリップを使用して、関数発生器の出力に銅バーを接続します。アセンブリが​​所望の温度に平衡化することを可能にするインキュベーターの内側にアセンブリを配置します。 </li><li> 10ヘルツの正弦波周波数と90分間、1 Vの電位差を適用します。 Ensur図3に示すように、電圧をマルチメータにより1 Vであるeが。90分間の処理を続行します。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> 図3：マルチメーターの電極は周波数と電流を測定するために配置された位置 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="21"><li> 90分後、ゆっくりと2 Hzまでの周波数を減少させ、さらに10分間電鋳を続けます。この間、 インビトロ翻訳反応における収穫は（3.1から3.2ステップ）。 </li><li>関数発生器のスイッチをオフにし、アセンブリは（インキュベーターをオフにすると、わずかに開いたインキュベータのドアを残して）ゆっくりと室温まで冷却することができます。 </li><li>冷却した後、発電機にケーブルを外しスライドアセンブリから。 GUVsは非常に壊れやすいこと、したがって、非常に穏やかに処理する必要があります。慎重にベンチにアセンブリをもたらします。 </li><li>優しく鉗子を使用して、トップスライドを除去することにより、チャンバーを分解します。きれいなチューブにカット千μlの先端と転送を使用して、スクロースを含む懸濁液GUVsを収穫。 GUVsの破壊を防止するために、穏やかにチューブを扱います。 </li><li>すぐにGUVsを使用してください。室温で保存した場合GUVs収穫後少なくとも90分間安定です。 </li></ol> 3.収穫インビトロ翻訳反応<ol><li>チューブにマイクロピペットを用いて赤チャンバーから所望のタンパク質を含むインビトロ翻訳反応を収穫。 </li><li> 、凝集したタンパク質を除去卓上遠心機で15分間、16,200×gで溶解物をスピンし、慎重に別のチューブに上清を転送します。 </li></ol> 4. GUV結合アッセイ<ol><li>切断されたチップを用いて、5を混在1;チューブに翻訳されたタンパク質とGUVsの5μLを含むin vitro翻訳反応のリットルと2-3分間室温でインキュベートします。 </li><li>きれいなカバースリップ上の小さな穴（3-4ミリの直径）とPDMSシートを取り付け、静かに、しっかりとカバーガラスに対してそれを押すことによって、気密シールを確保します。 </li><li>小さな穴にステップ4.1から10μlの混合物を配置します。 </li><li>画像室温で反転エピまたは共焦点蛍光顕微鏡下で混合物。 注：蒸発を防止するために、撮像チャンバは、カバースリップで覆うことができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells.">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li><li>Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+mechanisms+involving+RNA+and+lipids+regulate+HIV-1+Gag+membrane+binding+through+the+highly+basic+region+of+the+matrix+domain.">Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).</li><li>Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+matrix+domain+and+phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate+is+essential+for+efficient+gag+membrane+binding.">Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding.</a> J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).</li><li>Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+membrane-binding+domain+within+the+amino-terminal+region+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+protein+which+interacts+with+acidic+phospholipids.">Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids.</a> J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).</li><li>Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+(4,5)+bisphosphate+regulates+HIV-1+Gag+targeting+to+the+plasma+membrane.">Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).</li><li>Saad, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+targeting+HIV-1+Gag+proteins+to+the+plasma+membrane+for+virus+assembly.">Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).</li><li>Shkriabai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+HIV-1+Gag+with+assembly+cofactors.">Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors.</a> Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).</li><li>Vlach, J., Saad, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trio+engagement+via+plasma+membrane+phospholipids+and+the+myristoyl+moiety+governs+HIV-1+matrix+binding+to+bilayers.">Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).</li><li>Anraku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+analysis+of+the+interaction+between+HIV-1+Gag+and+phosphoinositide+derivatives+based+on+surface+plasmon+resonance.">Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).</li><li>Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag+associates+with+specific+uropod-directed+microdomains+in+a+manner+dependent+on+its+MA+highly+basic+region.">HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region.</a> J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).</li><li>Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gag+localization+and+virus-like+particle+release+mediated+by+the+matrix+domain+of+human+T-lymphotropic+virus+type+1+Gag+are+less+dependent+on+phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate+than+those+mediated+by+the+matrix+domain+of+HIV-1+Gag.">Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag.</a> J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).</li><li>Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+and+subcellular+localization+of+retroviral+Gag+proteins+are+differentially+regulated+by+MA+interactions+with+phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate+and+RNA.">Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA.</a> MBio. 5 (6), e02202 (2014).</li><li>Valentine, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+micelle+encapsulation+of+membrane-anchored+proteins+for+solution+NMR+studies.">Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies.</a> Structure. 18 (1), 9-16 (2010).</li><li>Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag+protein+can+sense+the+cholesterol+and+acyl+chain+environment+in+model+membranes.">HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).</li><li>Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+multimerization+on+membrane+association+of+Rous+sarcoma+virus+and+HIV-1+MA+proteins.">Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins.</a> J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).</li><li>Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+matrix+binding+to+membranes+and+nucleic+acids.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids.</a> J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol+bilayers.">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li><li>Darszon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassembly+of+protein-lipid+complexes+into+large+bilayer+vesicles:+perspectives+for+membrane+reconstitution.">Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).</li><li>Angelova, M. I., Sol&#233;au, S., M&#233;l&#233;ard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields.</a> Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li><li>Yamauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consensus+motif+for+N-myristoylation+of+plant+proteins+in+a+wheat+germ+cell-free+translation+system.">The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system.</a> FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).</li><li>Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain.">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li><li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+peroxides+promote+large+rafts:+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation.">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters.">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li><li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding.">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li><li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules.">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529 (2015).</li></ol>

We declare that we have no conflicting interests.

上記のようにGUV結合アッセイは、他のタンパク質 - 脂質相互作用アッセイは、その限界を持っているシナリオでは良い代替手段を提供します。このアッセイは、私たちは、脂質二重層の文脈における天然の長さのアシル鎖を有するミリストイル化​​完全長Gagおよび酸性脂質間の相互作用を検討およびGag-脂質の高密度ショ糖勾配または他のポスト結合処理により長い浮上遠心分離することなく、そうすることができます複合体。別の利点は、ギャグの動作を容易に、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイのような他のリアルタイム技術で実現されていない複雑な混合物（ 例えば 、細胞質ゾル成分の存在下）で調べることができることです。したがって、一つはここに記載のアッセイは、フィールドで使用される他のアッセイよりネイティブのコンテキスト内のGag-酸性脂質相互作用のリアルタイムの評価を可能にすることを主張することができます。 しかし、のような方法に関連する制限がありますよく。所与の製剤中GUVsが互いに類似の組成を有し、元の混合物に、電鋳をよく混合25,26中に存在する最も高い転移温度を有する脂質の転移温度以上行わなければならないことを確実にします。しかし、より長い時間、より高い温度への脂質の露出は、脂質分解25,27につながる可能性があります。したがって、（ 例えば 、DID）蛍光脂質色素を含めることによって有効に目視検査に加えて、GUVsの品質を制御するために、関心のある脂質の機能をテストすることが望まれる[ 例えば 、PI（4,5）P 2 ]脂質特異的プローブを使用して。さらに、一定の温度で相分離を生じさせるGUV組成物で、注意がタンパク質GUV相互作用を観察する際に正確に所望の温度を維持するように注意しなければなりません。別の制限は、より高いイオン強度のソリューションは、電気と互換性がないということです形成プロトコルは、ここで説明するので、GUVsを増殖させ、300mMのスクロース溶液26中に維持されます。注目すべきは、しかし、いくつかの研究は成功し、その変更された電鋳プロトコル28で生理的イオン強度での緩衝液を使用しています。 1つの重要な側面は、ギャグの量です。ウサギ網状赤血球溶解物ベースのシステムは、多くの場合、リポソーム浮遊アッセイにおける全長HIV-1のGagの調製のために使用されます。しかし、このシステムで得られた量のYFPタグ付きフルレングスのギャグはGUVsに結合したGagの可視化のためには不十分でした。この問題に対処するために、約8〜10は、ギャグのより高い量を倍得られる小麦胚芽ライセート系無細胞転写翻訳系は、現在のアッセイに使用しました。 GUV結合実験は、真核細胞溶解物の成分の非存在下で実施する必要がある場合、最近行われているようしかし、一方がフルオロフォアで標識された精製タンパク質を使用することができる（後述）。 それは特定の、膜へのGagの効率的な結合は、ミリスチン酸等の様々な因子によって調節協調プロセスであることが示されている、RNA、脂質頭部基とアシル鎖、およびGag-GAGの相互作用（参照29に概説）。 インビトロ系は、ここで説明するGAG結合膜の連携処理のイベントの順序を理解するために個別にまたは組み合わせての因子の役割に対処するために拡張することができます。これまで、記載されたアッセイシステムは、標準的な哺乳動物細胞由来のPI（4,5）P 2 -結合ドメイン（のギャグの結合における不飽和PIの予想外の役割（4,5）P 2アシル鎖を解明ではなく、ホスホリパーゼCデルタ1）24、リポソーム浮遊アッセイによって明らかにされていなかった発見のプレクストリン相同ドメイン。 GUVベースのアッセイ系はまたギャグ生物学の他の側面を理解するために使用されています。人工誘導multimを含むギャグ誘導体を用いていかだ様およびドメインのような非いかだでerizationモチーフとGUVsは、ケラーらは 「いかだ様」ドメインおよび多量体30にギャグパーティショニングとの関係を調べました。カールソンらの研究は 、膜結合型のGag 31によって様々なエンドソーム仕分けの輸送に必要な複合体（ESCRT）タンパク質の動員の順序を理解するためにGUVシステムおよび精製し、蛍光標識したギャグを使用しています。最近、別の研究では、フルオロフォア32と結合したギャグを使ってGUV上のGagによって誘発される小胞の出芽プロセスの再構築を報 ​​告しました。 HIV-1のGag多量体は、膜は、組立時にカーブしていると考えられる膜直下ギャグ格子の形成につながります。したがって、ギャグ、GUVアッセイシステムの更なる向上と、おそらくHIVアセンブリの少なくともよく理解態様で結合膜の曲率変化およびGag膜との間の関係は、foが行われているように分析することができます33他の細胞の曲率に敏感なタンパク質rを。 要約すると、このプロトコルを使用して、一方がミリストイル全長のGagの十分な量を取得し、GUV膜に結合したGagを可視化することができます。このプロトコルは、さらに、HIV-1アセンブリおよび出芽過程の様々な段階を調べるために開発することができます。

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）は、組み立ておよび大部分の細胞型における原形質膜（PM）から芽エンベロープウイルスです。 HIV-1ウイルス粒子のアセンブリは、Pr55 ギャグ （GAG）と呼ばれる55 kDaのウイルスコアタンパク質によって駆動されます。ギャグは、4つの主要な構造ドメイン、すなわち、マトリックス、カプシド、ヌクレオカプシド、およびP6、ならびに2のスペーサーペプチドSP1およびSP2で構成される前駆体ポリタンパク質として合成されます。組み立て中、マトリックス（MA）ドメインは、組立現場にギャグのターゲティングのために責任がある、カプシド（CA）ドメインはギャグ・ギャグの相互作用を媒介する、ヌクレオカプシド（NC）ドメインは、ウイルスゲノムRNAを募集し、p6の新兵の宿主因子を助けます原形質膜からのウイルス粒子の切断。 GAGはまた、N末端に14炭素脂肪酸またはミリスチン部分の添加により、共翻訳後修飾を受けます。 ギャグの結合膜はメートル以来、ウイルスのアセンブリのために不可欠な要件でありますウイルス粒子を産生しない膜結合に欠陥があるutants。我々と他の人はギャグの結合膜はMAドメイン内の二部の信号によって媒介されることが示されている：脂質二重層や高塩基性領域（と呼ばMAドメイン内の塩基性残基のクラスターとの疎水性相互作用を媒介N末端ミリスチン酸部分PM 1-4上の酸性脂質と相互作用HBR）。ポリリン酸化イノシチド5-ホスファターゼIV（5ptaseIV）、PM-特定の酸性リン脂質ホスファチジルの加水分解を触媒する酵素の異所性発現を使用してギャグ-膜の相互作用の研究（4,5）-bisphosphate [PI（4,5）P 2]ホスファチジルイノシトール-4-ホスフェートに、細胞中のGag-PMの局在をPI（4,5）P 2 3,5によって媒介されることを示唆しました。しかし、in vitroでの研究はギャグ-PI（4,5）Pの複数のメカニズムの詳細を理解することを目指して2相互作用は、多くの理由のために挑戦することが証明されています。ために生化学的実験のために、例えば、完全長ミリストイル化​​HIV-1の精製ギャグが原因精製中に凝集するギャグの傾向に少なくとも部分的には技術的に困難でした。したがって、このようなマイア-MAまたはマイア-MA-CA、または非ミリストイル化形態のようなHIV-1のGagの切断型は、しばしばギャグ精製（ 例えば 、核磁気共鳴、タンパク質フットプリント、および表面を必要とする研究で使用されていますプラズモン共鳴6-9）。あるいは、 インビトロ転写-翻訳反応において結合された他の生化学的研究1,2-における全長ミリストイル化HIV-1のGagを生成するために使用されてきました。典型的には、このシステムでは、ギャグをコードするプラスミドは、任意の細胞膜とメッセンジャーRNAを欠いているが、転写および翻訳のための機械が含まれている真核生物の細胞溶解物（ 例えば 、ウサギ網状赤血球溶解物）で転写および翻訳されます。反応後、ギャグを含む細胞溶解物を私と一緒に混合されます脂質とギャグの相互作用を分析するためのmbranes。ギャグミリストイル全長の調製の容易さに加えて、in vitro転写翻訳系を使用する方法は、GAG合成およびその後の膜結合反応は、より良い生理的条件を表すことができる「真核生物の細胞質ゾルのような」環境で発生するという利点を有します。このプロパティは、MAドメインに結合したRNA分子は競合的1,2,10-12に酸性脂質に結合するギャグを調節することを示した研究に貢献しました。これらの細胞溶解物で得られたGagタンパク質の合計量は高くないので、放射性標識アミノ酸を有するタンパク質の代謝標識は、それらの検出のために必要です。 ギャグ - 脂質相互作用を測定する方法に依存して、膜調製物の様々な使用されてきました。これらの各メソッドは、その長所と短所があります。ほとんどのNMRベースのアッセイは、短いアシルと脂質の使用を必要とします水溶性である鎖（ 例えば 、C4-およびC8-PI（4,5）P 2）6,8。細胞に見られる長いアシル鎖を有する脂質へのギャグの結合を試験するためのNMR法が開発されているが、それらはこれまで8,13のみミリストイルまたはnonmyristoylated MAで使用されています。あるいは、天然の長さのアシル鎖を有する脂質から調製されたリポソームは、リポソーム浮遊または蛍光リポソームビーズ結合アッセイ2,3,10,14-16などの生化学的方法に使用されてきました。しかしながら、これらのアッセイにおいて使用されるリポソームは、小さな直径を有し、従って、それらの膜は、急な正の曲率を有しています。対照的に、HIV-1感染細胞における粒子アセンブリの初期段階の間、ギャグほぼたGagの規模で平坦であるPMに結合し、続いて出芽中負の曲率を誘導します。そのため、急な正の曲率を有するリポソーム膜はギャグ - 脂質相互作用を研究するための理想的な脂質二重層ではないかもしれません。リポソームFLOTについてエーションアッセイ、別の潜在的な注意点は、実験結果に影響を与える可能性が遠心分離中高張ショ糖勾配にギャグ脂質複合体の露出があります。これらの制限を緩和し、補完的な実験システムを提供すること、ギャグ巨大単層小胞（GUVs）への結合についてのアッセイは、近年開発されてきました。 GUVsは、その直径が数十μmまで延びる単一の脂質二重層小胞です。したがって、これらの膜の曲率は、ギャグの規模でPMに似ています。また、原因光学顕微鏡下で目視検査を可能にし、その大きなサイズに、混合時にこれらの小胞への蛍光タグ付きまたは標識Gagタンパク質を結合膜が容易にギャグ - 脂質複合体のその後の処理を行わずに決定することができます。 ここではエレクトロフォーメーション法から得られたGUVsを使用して結合HIV-1のGag膜を研究するためのプロトコルについて説明します。このような穏やかな水和、ゲルアシスト水和、マイクなどの様々な方法rofluidic噴射、及び電鋳17-22 GUVsを取得するために使用されてきました。ここで説明されたプロトコルのために、エレクトロフォーメーション法は、高価なセットアップを必要とせずに、酸性脂質およびその使用比較的容易にGUVsを形成する際に、その効率の主に使用されます。ギャグの可視化は、蛍光レポーターを必要とするので、黄色蛍光タンパク質（YFP）は、遺伝的にギャグ（GAG-YFP）のC末端に付加されています。ギャグ-YFPタンパク質は連続交換-連続フロー（CECF）技術に基づいた小麦胚芽溶解物におけるインビトロ転写および翻訳反応によって得られます。この技術では、反応は、反応基質およびエネルギー成分の供給の阻害副産物の両方の除去は、透析に基づく機構で達成されます。これらの反応のために、T7プロモーターの制御下のGag-YFPをコードするプラスミドを用いています。先に示したように注目すべきは、小麦胚芽溶解物は、追加のコンポーネント2なしミリストイル化をサポート3,24。この方法を使用して、GUV膜24上のGagの可視化のためのGag-YFPミリストイル全長の十分な量を得ることができました。ここでは、PIに結合したGag（4,5）P 2を含むGUV膜が結合反応、次の長い以降の処理を行うことなく検査し、この方法はギャグ-膜結合アッセイを既存の補完とすることができることを提案することができるHIV-1でのプロトコルを記述しますさらに、HIV-1のGag-膜結合を理解するように拡張。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Meterman</td>
			<td>30XR</td>
			<td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Instek</td>
			<td>GFG-8216A</td>
			<td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO</td>
			<td>CG-90IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>21516-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80400</td>
			<td>Gauge 22S, Syringe number 702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td>
			<td>Sylgard, 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td>
			<td>BiotechRabbit, 
			Berlin, Germany</td>
			<td>BR1401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&#160;</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700041P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-PI(4,5)P2&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

HIV-1の構造タンパク質、Pr55 のGag（またはギャグ）は、ウイルスの組立プロセス中に細胞内で原形質膜に結合します。ギャグの膜結合は、ウイルス粒子産生の重度の障害でギャグ膜結合結果の欠陥以来、ウイルス粒子形成に必須の工程です。ギャグ脂質膜との相互作用のメカニズムの詳細は、NMRに基づくインビトロ方法を得るために、タンパク質フットプリント、表面プラズモン共鳴、リポソーム浮遊遠心分離、又は蛍光脂質ビーズ結合は、これまで開発されてきました。しかし、これらのin vitroの方法の各々は、その限界を有します。これらの制限の一部を克服し、以前に確立された方法に相補的なアプローチを提供するために、我々は、 インビトロアッセイを開発したHIV-1 Gagおよび脂質膜との相互作用」とは、細胞のような」環境で行われます。このアッセイでは、脂質膜に結合したGag目視YFP-taggeを用いて分析しますDのギャグは、電鋳技術により調製インビトロ翻訳システムとGUVs に小麦ベースの胚芽で合成します。ここでは、アッセイのために必要なミリストイル化​​完全長Gagタンパク質とGUV膜を得るために、およびGag-GUVは顕微鏡によって結合を検出するために、背景とプロトコルについて説明します。

<html>上記のプロトコルを使用して、我々は、POPC + POPS +チョルから成るGUVsを用意し（モル比：4.66：2.33：3）。この組成物は、約PMのPSおよびコレステロール濃度を反映するために選ばれました。ギャグの堅牢かつ効率的な結合は、脳-PI（4,5）P 2は、POPC + POPS + Cholの混合物（POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2 [モル比に含まれていた場合にのみ観察されました：4：2：3：1]この例では）（ 図4、A及びC）とパネルBとDを比較します。 POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2から成るGUVsに結合GAG-YFPは、膜表面上の蛍光強度の増加によって明らかです。この増加は、GUV境界（ 図4CおよびDのX-X &#39;）を横切る線に沿って蛍光強度プロファイル（ 図4、下）に見ることができます。 ロード/ 54293 / 54293fig4.jpg &quot;/&gt; 図4： ギャグは、脳-PI（4,5）P 2 -contianing GUVs に結合する POPC + POPS +チョル（AとC）とPOPC + POPS +チョル+のPI（4,5）P 2の共焦点断面。 GUVs（BおよびD）。ギャグ-YFPの配布は緑色で示されています。選択GUVs（黄色のボックス）の拡大画像がパネルGUVs（XにX &#39;）の反対側を横切るように描かれたランダムに選択されたラインは、画像の下に表示されているに沿って、CとDの蛍光強度プロファイルに示されています。バー=5μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes at JoVE.com

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K ビュー.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

ビデオ: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.