우리는 도움이 토론 모하메드 살림, 징 우 및 Krishnan Raghunathan에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 촬영하는 동안 도움을 프리 야 Begani 감사합니다. 이 작품은 (AO에) R01 AI071727 및 (SLV에) R01 GM110052은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원됩니다.

주 1 : 밀 배아 해물 기반 시험 관내 전사 번역 시스템을 사용 개그 단백질의 발현 HIV-1 개그 1. 준비 <ol><li> (-20 ºC에서 다른 시약을 밀 배아 해물는 -80 ºC에서 저장된다) 냉동고에서 상업 밀 배아 CECF 키트의 모든 시약을 제거합니다. 얼음을 해동하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 성분을 혼합한다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 믹스-1 (사료 혼합) </td><td></td></tr><tr><td> 수유 솔루션 </td><td> 900 μL </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> 80 μL </td></tr><tr><td> 메티오닌 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 1000 μL </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 믹스-2 (해물 믹스) </str옹&gt; </td><td></td></tr><tr><td> 맥아 해물 </td><td> 15 μL </td></tr><tr><td> 의 RNase없는 물 </td><td> 7 μL </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> 4 μL </td></tr><tr><td> 메티오닌 </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> TE 버퍼의 플라스미드 DNA (1 μg의 / μL) ** </td><td> 4 μL </td></tr><tr><td> 반응 완충액 </td><td> 15 μL </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 μL </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 50 μL </td></tr></tbody></table> 표 1 : 밀 배아 반응에 필요한 혼합물의 조성물. 주 : 결합 실험 개그 멤브레인의 RNase 의해 RNA 제거의 효과를 조사하기위한 경우의 RNase가없는 물 리보 뉴 클레아 제 저해제를 교체한다. 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 불순물이 없어야한다. 그러나, Plasmids 종래 사용하여 제조하지만, 독소가없는 플라스미드 아이솔레이션 키트는 성공적으로 사용 불가. 제조업체의 지시도 클레아없는 물에 용해 DNA를 사용하는 것이 좋습니다. TE [10 mM 트리스 - 염산 1 mM의 EDTA를 포함하는 (PH 7.4)]에 현탁 DNA를 사용하는 경우, TE의 EDTA는 수율에 영향을 미칠 수 있기 때문에, DNA의 낮은 농도를 사용하지 마십시오. 0.8-1 μg의 / μL의 농도 범위에서 TE 완충액 플라스미드가 성공적으로 사용되어왔다. <ol start="2"><li> 첫 번째 반응 카세트 (투명 챔버)에 공급 혼합물 (믹스-1)를 추가합니다. 그런 다음 다른 챔버 (빨간색)에 해물 믹스 (MIX-2)를 추가합니다. 각각의 챔버에 혼합물을 추가하는 동안 그 솔루션 구성 요소의 비효율적 인 교류로 이어질 때문에 반응의 효율을 감소시킬 수 있기 때문에, 모든 거품을 소개하지 마십시오. </li><li> 키트에 제공되는 접착 필름 챔버 커버. </li><li> 카세트 홀더 incuba으로 반응 카세트를 삽입테 에펜 도르프 써모 R. 900 rpm의 일정한 흔들림 속도에서 24 ºC에서 24 시간 동안 어셈블리 </li></ol> 주 2 : 전기 주조 및 수확 밀 배아 해물로 준비 GUVs GUVs 2. 준비 <ol><li> 테플론 라이너 늘어서 및 파라 필름으로 포장 스크류 캡 유리 병에 클로로포름 클로로포름의 혼합물 및 메탄올 등의 무기 용매에 용해 나누어지는 지질. 해밀턴 형 유리 주사기와 지질을 처리하거나, 사용 가능한 경우, 클로로포름에 강한 플라스틱 팁. -20 ºC 냉동고에서 GUV의 제조에 사용되는 지질을 함유하는 유리 바이알을 꺼내어. <ol><li> 유리 병을 실온으로 평형되면, 지질 현탁액은 분명 육안 검사에 의해 확인합니다. 이러한 팔미 토일 - 올레 오일 포스파티딜 세린 (POPS) 및 PI (4,5) P 2와 지질, 특히 산성 지질의 품질, 성공적인 실험을 위해 중요하다. 있는 지질을 사용하지 마십시오이상이 2 개월 분량 씩한다. </li></ol></li><li> 원하는 온도까지 가열 블록을 미리 가온. 이 온도는 가장 높은 T의 m과 지질 (들)의 융점 (T m에서)보다 적어도 5 ºC 높아야한다. </li><li> 원하는 몰 지질 비율에 따라 필요한 지질 볼륨을 계산합니다. 표 2에 나타낸 바와 같이 여기에 결합 HIV-1 개그 공부 다음 몰비를 사용한다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 지질 믹스 </td><td> 몰비 </td><td> 볼륨 (μL에서) </td><td> 주식 농도 </td></tr><tr><td> POPC +는 + Chol을 팝 </td><td> 46.​​6 + 23.3 + (30) </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC, POPS, Chol을 10 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol을 + 뇌-PI (4,5) P (2) </td><tdROWSPAN = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8.3 + 6.25 + 58.19 </td><td> POPC, POPS, Chol을 10 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> 뇌-PI (4,5) P 2 : 1 ㎎ / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 2 : 다른 지질 볼륨 GUVs를 얻기 위해 사용. <ol start="4"><li> 깨끗한 나사 덮인 유리 병에 지질의 원하는 볼륨을 추가합니다. </li><li> 사용 (카탈로그에 설명 된대로) 크기 25 × 50 X 1.1 mm 3, 저항 70-100 Ω을의 슬라이드를 ITO가 코팅. 클린 벤치에 두 ITO 코팅 된 슬라이드를 놓습니다. 각 전기 주조 챔버는 두 인듐 - 주석 - 산화물 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드를 요구한다. 유리 슬라이드의 도전 측이 멀티 미터를 사용하여 저항을 확인하여이 위를 향하도록되어 있는지 확인합니다. 그것은 약 200 Ω의 값을 표시해야합니다. 슬라이드의 표면이 부드럽게 보풀이없는 와이프를 사용하여 70 % 에탄올로 닦아 깨끗해야합니다. </li><li> RI에 의해 주사기 바늘의 외부 표면을 세정클로로포름을 nsing 및 열 블록에 주사기를 놓습니다. </li><li> 이 위를 향하도록 도전면 열 블록에 새로운 ITO 코팅 유리 슬라이드를 놓고는 일반적으로 원하는 온도를 2 ~ 3 분에 평형 수 있습니다. 유리 슬라이드에 ITO 코팅이 절차를 청소 중에 손상 될 수있는 잠재적 인 위험에 대한 ITO 코팅 유리 슬라이드를 재사용하지 말 것. </li><li> 균일 한 유리 슬라이드에 지질의 확산 아직 빠른에 대한 각각의 슬라이드에 대한 지질 혼합물의 40 ~ 50 μL의 볼륨을 사용합니다. 클로로포름 같은 적절한 유기 용매로 전체 볼륨을 조절합니다. <ol><li> 유리 슬라이드에서 지질 혼합물의 총 부피의 절반을하고 즉시 (슬라이드 걸쳐 바늘 2-3 회 이동) 균일 한 지질막을두고 세정 주사기 (단계 2.6)를 사용하여 지질 확산. 얇은 ITO 코팅의 손상을 피하기 위해 완만하게 (그러나 신속하게) 지질 막을 확산. 비 균일 한 확산 또는 차선의 원인이 확산 거친수율 또는 GUVs의 계산 이질성. </li><li> 따라서, 이후 다음 단계로 진행하기 전에 확산 지질 막을 조사하여 균일 한 확산을 보장한다. 필름의 불투명도가 과도하게 불균일 나타나면, 새로운 슬라이드를 사용하여 절차를 다시. </li></ol></li><li> 코팅 된면이 위를 향하도록 페트리 접시 내부에 코팅 된 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 반복 또 다른 ITO 코팅 된 슬라이드를 사용하여 혼합물의 나머지 부분에 대한 2.6-2.9 단계. </li><li> 유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 60 ~ 90 분 동안 종래의 진공 탈수 챔버에 슬라이드를 모두 함유하는 페트리 접시를 배치했다. </li><li> 이 과정에서, 열 블록 (대부분의 경우 65 ° C)와 미리 따뜻한 300 mM의 인큐베이터에서 수크로오스 용액과 동일한 온도로 설정 배양기. </li><li> 건조 후, 벤치에 페트리 접시를 가져 깨끗한 표면에 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 70 % 에탄올 건조 그것을 공단을 이용하여 PDMS 개스킷 (도 1)를 청소tely. </li><li> 그림 1과 같이 조심스럽게 단단히은 개스킷 형태의 그 물이 꽉 밀봉 그래서 누를 때 지질 코팅 된 유리 슬라이드에 놓습니다. PDMS의 가스켓과 슬라이드 사이의 간격이 없음을 확인합니다. 이는 수크로오스 용액을 보유 얕은 챔버의 형성을 초래한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> 그림 1 :. 전기 주조에 사용되는 ITO 코팅 유리 슬라이드의 레이아웃 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="16"><li> 모든 거품없이 미리 예열 자당 용액으로 챔버를 입력합니다. </li><li> 꽉 도장을 만들기 위해 상단에있는 다른 코팅 된 슬라이드를 놓습니다. 기포가 없는지 확인합니다. 최종 조립체는도 2에 도시 된 바와 같이. 나타나는 챔버 날기를 고정해야g 바인더 클립. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> 그림 2 :. 전기 주조 챔버 (측면보기)의 도식 표현 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="18"><li> 흡인하여 과량의 크로스를 제거하고 보풀이없는 와이프를 사용하여 슬라이드를 청소합니다. 도전 측면이 바 균일 한 접촉이되도록 구리 막대에 슬라이드를 고정합니다. 유리 슬라이드의 한 도전 측이 하나의 구리 막대와 접촉에 있는지 확인합니다. </li><li> 악어 클립을 사용하여 함수 발생기의 출력과 구리 막대를 연결한다. 어셈블리가 원하는 온도에 평형 수 있도록 인큐베이터 내부의 어셈블리를 놓습니다. </li><li> 10 Hz의 정현파의 주파수와 90 분 동안 1 V의 전위차를 적용한다. Ensur도 3에 도시 된 바와 같이 전압이 1 V로 멀티 인 E는. 90 분 동안 처리를 계속. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> 그림 3 :. 멀티 미터에서 전극 주파수 및 전류를 측정하기 위해 배치되는 위치 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="21"><li> 90 분 후, 천천히 2 Hz로 주파수를 감소시키고 추가로 10 분 동안 전기 주조를 계속한다. 이 기간 동안, 체외 번역 반응에서 수확 (3.1-3.2 단계). </li><li> 함수 발생기를 끄고 어셈블리 (인큐베이터을 끄고 약간 열린 인큐베이터 덮개를 두어)을 서서히 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 냉각 후, 발전기에 케이블을 분리슬라이드 어셈블리에서. GUVs은 매우 취약 할 수 있으므로 매우 조심스럽게 처리해야 할 수 있습니다. 조심스럽게 벤치에 어셈블리를 가져온다. </li><li> 부드럽게 집게를 사용하여 상부 슬라이드를 제거하여 챔버를 분해한다. 깨끗한 튜브에 상처 1,000 μL 팁과 전송을 사용하여 크로스 서스펜션 포함 GUVs을 수확. GUVs의 혼란을 방지하기 위해 부드럽게 튜브를 처리합니다. </li><li> 즉시 GUVs를 사용합니다. 실온 보관시 GUVs 수확 후 적어도 90 분 동안 안정하다. </li></ol> 3. 수확 체외 번역 반응 <ol><li> 관에 마이크로 피펫을 이용하여 적색 챔버로부터 원하는 단백질을 포함하는 생체 외 번역 반응 수확. </li><li> 집계 된 단백질을 제거 탁상 원심 분리기에서 15 분 동안 16,200 XG에서 해물 스핀 조심스럽게 다른 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li></ol> 4. GUV 바인딩 분석 <ol><li> 절단 팁을 사용하여, 5를 혼합1, 번역 단백질 및 튜브 GUVs 5 μl를 함유 관내 번역 반응 L, 2-3 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 깨끗한 커버 슬립에 작은 구멍 (3-4 mm 직경)와 PDMS 시트를 부착하고 부드럽게 단단히 coverslip에 대해 그것을 눌러 단단히 밀봉을 보장합니다. </li><li> 작은 구멍으로 단계 4.1에서 10 μl의 혼합물을 놓습니다. </li><li> 이미지 실온에서 반전 에피 나 공 초점 형광 현미경 혼합물. 주 : 증발을 방지하기 위해, 촬상 챔버는 커버 슬립에 의해 커버 될 수있다. </li></ol>

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L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain.">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li><li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+peroxides+promote+large+rafts:+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation.">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters.">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li><li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding.">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li><li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules.">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529 (2015).</li></ol>

We declare that we have no conflicting interests.

상술 한 바와 같이 GUV 결합 분석은 다른 단백질 지질 상호 작용을 분석 자신의 한계를 가지고 시나리오에서 좋은 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 지질 이중층의 맥락에서 기본 길이 아실 체인 myristoylated 전체 길이 개그 산성 지질 사이의 상호 작용을 검토하고 개그 지질의 고밀도 자당 그라디언트 또는 다른 후 바인딩 처리를 통해 긴 부상 원심 분리없이 그렇게 할 수 있습니다 단지. 또 다른 장점은 개그의 동작을 용이하게 이러한 표면 플라즈몬 공명 기반 분석과 같은 다른 실시간 기술에서 달성되지 않는다 (세포질 성분의 존재하에, 예) 복잡한 혼합물에서 검사 될 수 있다는 것이다. 따라서, 하나는 여기에 설명 된 분석의 분야에서 사용되는 다른 분석법보다 고유 컨텍스트 개그 산성 지질 상호 작용의 실시간 평가를 가능하게 할 수 있다고 주장한다. 그러나,이 방법 등과 관련된 제한이있다잘. 주어진 제조에 GUVs 서로 유사 조성 원래 혼합물에, 전기 주조는 잘 25,26 혼합물에 존재하는 가장 높은 전이 온도를 갖는 지질 전이 온도 이상에서 수행되어야하는지 확인한다. 그러나, 긴 시간 동안 높은 온도에 지질의 노출 지질 분해 25, 27으로 이어질 수있다. 따라서, 형광 지질 염료 (예 : DID)가 [예를 들어, PI (4,5) P이 관심있는 지질의 기능을 테스트하는 것이 바람직하다의 포함으로 가능 육안 검사 이외에도 GUVs의 품질을 제어 할 ] 지질 특정 프로브를 사용하여. 또한, 소정의 온도에서 상 분리를 야기 GUV 조성물과 함께주의 GUV 단백질 상호 작용을 관찰 할 때 정확하게 원하는 온도를 유지하기 위해주의해야한다. 또 다른 제한은 높은 이온 강도의 솔루션은 전기와 호환되지 않는 것입니다형성 프로토콜은 여기에 설명 된, 따라서 GUVs 성장 300 밀리미터 자당 용액 (26)에 유지된다. 특히, 그러나, 일부 연구는 성공적으로 개질 전기 주조 프로토콜 28 생리 이온 강도의 버퍼를 사용 하였다. 한 가지 중요한 측면은 개그의 양입니다. 토끼의 망상 해물 기반 시스템은 종종 리포좀 부양 분석에서 전체 길이 HIV-1 개그의 제조에 사용된다. 그러나, 이러한 시스템에서 획득 YFP 태깅 전장 개그 량 GUVs 결합 개그 시각화 불충분했다. 이 문제를 해결하기 위해, 약 8-10 개그 높은 금액을 접어 맺는 밀 배아 파쇄물 계 무 세포 전사 번역 시스템은, 현재의 분석에 사용 하였다. GUV 결합 실험은 진핵 세포 용 해물 성분의 부재 하에서 수행 될 필요가있는 경우 최근 행해졌 그러나, 하나는 형광 물질로 표지 정제 된 단백질을 사용할 수있다 (후술). 그것은 구체적이고 막에 개그의 결합 효율은 미리 스테이트 등 다양한 요인에 의해 규제 협력 과정임을 표시되었습니다, RNA, 지질 headgroups 및 아실 체인 및 개그-개그 상호 작용 (참조 29에서 검토). 시험 관내 시스템은 여기에 설명 결합 개그 막의 협동 프로세스의 이벤트의 순서를 이해하기 위해 개별적으로 또는 조합 인자의 역할을 다루기 위하여 확장 될 수있다. 지금까지 설명 된 분석 시스템은 정규 포유류 세포 유래의 PI의 개그의 결합이 아닌 불포화 PI (4,5) P (2) 아실 사슬의 예기치 않은 역할을 규명 (4,5) P (2)는 (도메인 - 결합 포스 포 리파제 C 델타 1) (24), 리포좀 부양 분석에 의해 밝혀지지했던 발견의 플렉스 트린 상동 도메인. GUV 기반 분석 시스템은 개그 생물학 다른 양상을 이해하는 데 사용되어왔다. 인공 유도 multim 함유 개그 유도체를 사용하여도메인 같은 뗏목 같은 비 뗏목, 켈러는 등.에 &#39;뗏목 같은&#39;도메인과 멀티 머화 (30) 개그 파티션 사이의 관계를 조사와 erization 모티브 GUVs. 칼슨 등의 연구가. 막 - 결합 개그 (31)에 의해 다양한 엔도 좀 정렬 운송에 필요한 단지 (ESCRT) 단백질의 채용의 순서를 이해하기 위해 GUV 시스템 및 정제 및 형광 표지 개그를 사용하고있다. 최근에, 또 다른 연구는 형광 (32)가 결합 개그를 사용하여 GUV의 개그에 의한 소포 신진 과정의 재구성을보고했다. HIV-1 개그 멀티 머화는 조립시 곡선에 막을 생각된다 submembrane 개그 격자의 형성을 유도. 따라서 개그-GUV 분석 시스템에있어서 개선과, 틀림없이 HIV 조립체의 가장 잘 이해 양태 바인딩 막 곡률 변화 개그 막 사이의 관계는 fo를 완료됨에 따라 분석 될 수있다다른 세포 곡률에 민감한 단백질 33 r에. 요약하면,이 프로토콜을 이용하여 하나 myristoylated 전장 개그 충분한 양을 획득하고 개그 GUV 막 결합 시각화 할 수있다. 이 프로토콜은 또한 HIV-1 조립 및 신진 프로세스의 다양한 단계를 조사하기 위해 개발 될 수있다.

인간 면역 결핍 바이러스 타입 1 (HIV-1) 대부분의 세포 유형에에서 조립 및 플라즈마 막 (PM)에서 싹 포락선 바이러스입니다. HIV-1 바이러스 입자의 어셈블리가 Pr55 개그 (개그)라고하는 55 kDa의 바이러스 코어 단백질에 의해 구동된다. 개그는 네 개의 주요 구조 영역, 즉 매트릭스, 캡시드, 뉴 클레오 캡시드 및 P6뿐만 아니라, 두 개의 스페이서 펩티드 SP1 및 SP2로 이루어지는 전구체 폴리 단백질로서 합성된다. 조립시, 매트릭스 (MA) 도메인 어셈블리 사이트 개그 타겟팅 할 책임이 캡시드는 (CA)가 도메인 개그-개그 상호 작용을 매개하는, 뉴 클레오 캡시드 (NC) 영역은 바이러스 게놈 RNA를 모집하고 P6 모집 호스트 요인이 처치 세포막에서 바이러스 입자 분열. 개그는 또한 N 말단에 14 개의 탄소 지방산 또는 미리 스틴 산 잔기의 첨가에 의해 공동 번역 후 변형을 겪는다. 개그의 결합 멤브레인 m 이후, 바이러스 조립에 필수적인 요구 사항입니다결합 막 중의 결함 utants 바이러스 입자를 생산하지 못한다. 지질 이중층 높은 기본 영역으로 불리는 석사 도메인 내에서 기본 잔류 물의 클러스터 (과 소수성 상호 작용을 매개 N- 말단 미리 스테이트 부분 : 우리와 다른 사람은 MA 도메인 내에서 양자 신호에 의해 매개된다 개그의 결합이 막 보여 주었다 PM을 1-4 산성 지질과 상호 작용 HBR). polyphosphoinositide 5 포스 파타 아제 IV (5ptaseIV), PM-특정 산성 인지질 phosphatidylinositol-의 가수 분해를 촉매하는 효소의 자궁외 표현을 사용 개그 멤브레인의 상호 작용 연구 (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] 포스파티딜 이노시톨-4 인산로, 세포에 개그-PM 현지화가 PI (4,5) P (2) 3,5에 의해 매개되는 것을 제안했다. 그러나, 시험 관내 연구 개그-PI (4,5) P의 더 자세한 기전을 이해 목표이 상호 작용은 여러 가지 이유로 도전적 입증되었다. 에 대한예, 생화학 실험 전체 길이의 정화 myristoylated HIV-1 개그 인해 정제 동안 집계 개그의 경향에 적어도 부분적으로 기술적으로 어렵다. 따라서, 이러한 MYR-MA 또는 MYR-MA-CA 또는 비 myristoylated 형태와 같은 HIV-1 개그의 절단 된 형태는 자주 개그 정제를 필요 연구에서 사용되어왔다 (예를 들면, 핵 자기 공명, 단백질 배출량 측정 및 표면 플라즈몬 공명 6-9). 대안 적으로, 시험 관내 전사 번역 반응에 연결된 다른 생화학 연구 1,2- 전체 길이 myristoylated 개그 HIV-1을 제조하는데 사용되어왔다. 일반적으로이 시스템에서, 개그 인코딩 플라스미드는 전사하고 세포막과 메신저 RNA를 결여하지만 전사 및 번역 기계를 포함하는 진핵 세포 용 해물 (예를 들면, 토끼 망상 해물)로 변환됩니다. 반응 후, 개그를 함유하는 세포 용 해물은 나와 혼합지질과 개그의 상호 작용 분석을위한 mbranes. 개그 myristoylated 전장의 제조 용이성에 더하여, 시험 관내 전사 번역 시스템을 사용하는 방법은 개그 합성 후의 막 결합 반응이 더 생리적 조건을 나타낼 수있는 &#39;진핵 세포질 형&#39;환경에서 발생하는 장점을 갖는다. 이 속성은 MA 도메인에 바인딩 RNA 분자가 개그가 경쟁 방식으로 1,2,10-12에 산성 지질에 결합 규제 것을 보여 주었다 연구에 기여했다. 이러한 세포 용 해물에서 얻은 개그 단백질의 총량이 높지 않기 때문에, 방사성 표지 된 아미노산과 단백질의 대사 표지는 검출이 필요하다. 상기 방법에 따라하기 개그 지질 상호 작용을 측정하기 위해, 막 제제의 다양한 사용되어왔다. 각 방법은 장점과 한계가있다. 대부분 NMR 기반 분석법 짧은 아실 지질의 사용을 필요수용성 (예를 들면, C8-C4- 및 PI (4,5) P 2) 6,8-있다 체인. NMR 방법들이 개발되고있는 세포에서 발견 긴 아실 체인을 갖는 지질 개그에 결합하는 것을 테스트하는 동안, 지금까지 8, 13 만 myristoylated 또는 nonmyristoylated MA로 사용되어왔다. 대안으로, 기본 길이 아실 체인을 지질로부터 제조 된 리포솜은 리포솜 부유 형광 리포솜 비드 결합 분석 2,3,10,14-16 같은 생화학 적 방법에 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석에 사용 된 리포좀은 작은 직경을 가지며, 따라서, 이들 막은 가파른 포지티브 곡률을 갖는다. 반대로, HIV-1 감염 세포에서 입자 조립체의 초기 단계 동안, 개그 거의 개그의 규모에 평면이 상기 PM에 결합하고,이어서 신진 중에 네거티브 곡률을 유도한다. 따라서, 가파른 긍정적 인 곡률 리포솜 막은 개그 지질 상호 작용을 연구하는 이상적인 지질 이중층하지 않을 수 있습니다. 리포좀 FLOT에 관해서ATION 분석, 다른 잠재적주의해야 할 점은 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 원심 분리 동안 고장 성 자당 기울기에 개그 지질 복합체의 노출이다. 이러한 제한을 완화하고 보완 실험 시스템을 제공하기 위해, 개그가 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 결합에 대한 분석은 최근에 개발되었다. GUVs는 그 직경이 수십 마이크로 미터까지 연장 단일 지질 이중층 소포이다. 따라서, 이러한 세포막의 곡률은 개그의 규모에 PM 유사합니다. 또한, 때문에 광학 현미경 하에서 육안 검사를 할 수 있습니다 대형 크기로 막 쉽게 개그 지질 복합체의 후속 처리없이 결정할 수있다 혼합에이 소포에의 찬란 태그 또는 라벨 개그 단백질을 결합. 우리는 여기에 전기 주조 방법에서 얻은 GUVs를 사용하여 결합 HIV-1 개그 멤브레인을 연구하는 프로토콜을 설명합니다. 같은 부드러운 수화 젤 이용한 수화, 마이크 등의 다양한 방법rofluidic 분사하고, 전기 주조는 17-22 GUVs을 얻기 위해 사용되었다. 여기에 설명 된 프로토콜의 경우, 전기 주조 방법은 산성 지질 비싼 설정 없이도 사용의 비교적 쉽게 형성 GUVs 주로 때문에 효율이 사용된다. 개그의 시각화 형광 기자를 필요로하기 때문에, 노란색 형광 단백질 (YFP)는 유 전적으로 개그 (개그-YFP)의 C ​​말단에 추가됩니다. 개그-YFP 단백질 연속 교환 연속 흐름 (CECF) 기술을 기반으로 밀 배아 용해질에서 시험 관내 전사 및 번역 반응에 의해 얻어진다. 이 기술에서, 반응은 반응 기질 및 에너지 구성 요소의 공급을 억제 부산물을 모두 제거하여 투석 기반기구에서 달성된다. 이들 반응 들면, T7 프로모터의 제어하에 개그-YFP를 코딩하는 플라스미드가 사용된다. 이전과 같이 참고로, 밀 배아 해물을 추가 구성 요소 (2)를하지 않고 미리 스토 일화를 지원3,24. 이 방법을 사용하면, GUV 막 (24)의 개그 시각화 개그-YFP myristoylated 전체 길이의 충분한 양을 얻을 수있다. 여기서 우리는 HIV-1 개그가 PI에 결합되는 프로토콜을 설명 (4,5) P 2 GUV 막을 함유하는 결합 반응을 다음과이 방법은 결합 분석을 기존의 개그 멤브레인을 보완 할 수 있다는 제안 긴 후속 처리없이 검사 할 수 또한 결합 HIV-1 개그 멤브레인을 이해하는 확장.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Meterman</td>
			<td>30XR</td>
			<td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Instek</td>
			<td>GFG-8216A</td>
			<td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO</td>
			<td>CG-90IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>21516-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80400</td>
			<td>Gauge 22S, Syringe number 702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td>
			<td>Sylgard, 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td>
			<td>BiotechRabbit, 
			Berlin, Germany</td>
			<td>BR1401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&#160;</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700041P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-PI(4,5)P2&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

HIV-1의 구조 단백질 Pr55 개그 (또는 개그)는 바이러스 조립 과정에서 세포의 세포막에 결합한다. 개그 결합 막은 바이러스 입자 생산에 심각한 손상 개그 막 결합 결과 결함 사람 바이러스 입자 형성을위한 필수 단계이다. 개그 지질 막 상호 작용 기전 상세을 얻기 위해, 시험 관내 방법은 NMR, 단백질 배출량 측정, 표면 플라즈몬 공명, 리포솜 부유 원심 분리 또는 형광 지질 비드에 기초하여 지금까지 개발 된 바인딩. 그러나, 이러한 시험 관내 방법은 각각의 한계를 갖는다. 이러한 한계들을 극복하고 이전에 설정된 방법에 보완적인 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 HIV-1 개그 지질 세포막 사이의 상호 작용은 &quot;셀 같은&quot;환경에서 개최되는 시험 관내 (in vitro) 분석을 개발했다. 이 분석에서, 개그 지질막 결합 시각적 YFP-tagge를 사용하여 분석D 개그 밀 합성 관내 번역 시스템 및 전기 주조 기술에 의해 제조 GUVs에서 세균 계. 여기에서 우리는 배경을 설명하고 프로토콜 분석에 필요한 myristoylated 전체 길이 개그 단백질과 GUV 막을 얻고 현미경으로 결합 개그-GUV를 검색 할 수 있습니다.

<html> 상기 프로토콜을 사용하여, 우리는 POPC + + Chol을 POPS 이루어지는 GUVs 제조 (: 4.66 : 2.33 : 3 몰비). 이 조성물은 대략 오후의 PS 및 콜레스테롤 농도를 반영하기 위해 선택되었다. 뇌-PI (4,5)는 P 2는 POPC + POPS + Chol을 혼합물에 포함 된 경우 강력하고 개그의 결합을 효율적으로 만 관찰되었다 (POPC + POPS + Chol을 + 뇌-PI (4,5) P 2 몰비 4 : 2 : 3 : 1이 예에서) (도 4, A 및 C)와 패널 B 및 D를 비교한다. POPC + 이루어지는 GUVs 결합 개그-Chol을 YFP는 + + 뇌 PI (4,5) P (2)이 막 표면에 대한 형광 강도의 증가로 명백하다 나옵니다. 이러한 증가는 또한 GUV 경계 (도 4C 및 D에 XX &#39;)을 가로 지르는 라인을 따라 형광 강도 프로파일 (도 4 하단)에서 볼 수있다. 로드 / 54293 / 54293fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 :. 개그는 뇌-PI (4,5) P 2 GUVs을 -contianing POPC + POPS + Chol을 (A 및 C)와 POPC + POPS + Chol을 + PI의 공 초점 단면 (4,5) P (2)에 결합 GUVs (B와 D). 개그-YFP의 분포가 녹색으로 표시됩니다. 선택된 GUVs (노란 박스)의 확대 사진 패널 C에 도시되어 D. 형광 강도는 이미지를 이하에 나타낸다 GUVs ( &#39;X로 X)의 양측을 통과하도록 그려 임의로 선택 라인을 따라 프로파일. 바 = 5 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K 조회수.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

비디오: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

연구

면역학 및 감염병학

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.