Os autores agradecem a Dale Leitman pelo treinamento inicial no uso de ensaios transitórios de transfecção para determinar a atividade estrogênica de alimentos vegetais primatas. Graças a Bradford Westrich e C. Eric Johnson por ajudar a montar equipamentos de laboratório e treinar alunos em métodos de extração. Finalmente, obrigado à Universidade de Indiana por financiar esta pesquisa.

1. Preparação de materiais vegetais
<ol><li>Congelar itens de plantas secas que foram coletados frescos usando um liofilizador.<ol>
<li>Para proteger as amostras da luz, cubra câmaras com papel alumínio durante o processo de secagem.</li>
		<li>Para garantir que as amostras estejam completamente secas, lyophilize até que as câmaras não sintam mais frio para tocar e os materiais vegetais não percam mais massa quando pesados.</li>
		<li>Armazene plantas secas em sacos de resíduos estéreis e baixos na ausência de luz até a moagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Triture finamente amostras usando um moinho de moagem com tela de malha de 0,85 mm.<ol>
<li>Guarde as amostras de terra nos sacos na ausência de luz até a extração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extração de metabólitos secundários de plantas
<ol><li>Para extrair os metabólitos secundários da planta, utilize uma razão de 1 g de amostra seca para 10 mL de metanol de grau HPLC.<ol>
<li>Pesar a amostra sobre um equilíbrio analítico e adicioná-lo a um frasco de Erlenmeyer de tamanho adequado (125 – 250 mL). Em seguida, adicione o volume apropriado de metanol. Regisso da massa de amostra extraída.</li>
		<li>Cubra a solução de metanol vegetal com papel alumínio e, em seguida, gire a velocidade de 100 rpm à temperatura ambiente (RT) por 3 dias em um agitador orbital, permitindo que os compostos potencialmente estrogênicos se dissolvam no metanol.</li>
		<li>Decante o supernatante em um sistema de filtragem por gotejamento usando papel filtro (125 mm).</li>
		<li>Usando um evaporador rotativo, seque o extrato da planta até que a amostra esteja espessa, mas derramada, em um frasco de fundo redondo de 300 mL. Despeje a amostra em um frasco de fundo redondo de 50 mL, enxaguando o frasco grande com uma pequena quantidade de metanol. Continue a secar a amostra no pequeno frasco até que o metanol esteja completamente evaporado.</li>
		<li>Pesar o resíduo amostral usando um equilíbrio analítico. Registrar massa de resíduos.</li>
		<li>Dissolva o extrato vegetal em sulfóxido de dimetila (DMSO) a uma concentração de 0,1 g de extrato a 2 mL de DMSO. Vórtice até homogeneizar.</li>
		<li>Armazene a solução de extrato de planta-DMSO a 4 °C em frascos de vidro âmbar até o ensaio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>ATENÇÃO: As plantas podem produzir produtos químicos biologicamente ativos desconhecidos, e o DMSO é um veículo que pode transportá-los através de membranas celulares. Use equipamentos de proteção individual e cuidados adequados ao manusear essas amostras.
3. Receptor de estrogênio humano β ensaio de transfecção12
NOTA: É necessária técnica asséptica e uma capa de fluxo laminar para o primeiro dia do protocolo de ensaio.
<ol><li>Prepare diluições de 17β-Estradiol para a curva padrão.<ol>
<li>Transfira o Meio de Triagem Média e Composto de Recuperação celular (CSM) do armazenamento do congelador e descongele em um banho de água de 37 °C.</li>
		<li>Rotular tubos de microcentrifusagem Intermediários 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.</li>
		<li>Preencha INT1 com 995 μL de CSM, INT2 com 615 μL de CSM, tubo 1 com 900 μL de CSM e tubos 2-8 com 600 μL de CSM. Reserve o tubo 8.</li>
		<li>Transfira 5 μL de 100 μM 17β-Estradiol Para INT1. Descarte a ponta. Vórtice.</li>
		<li>Antes de cada transferência, enxágue a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 10 μL de INT1 para INT2. Descarte a ponta.</li>
		<li>Enxágüe a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 100 μL de INT2 para o tubo 1. Descarte a ponta. Transfira 300 μL do tubo 1 para o tubo 2. Repita para os tubos 3 a 7. Descarte 300 μL do tubo 7 em recipiente de resíduos. O tubo 8 é um Zero e não recebe estradiol. As concentrações finais das normas emplacardas são: 400, 133,3, 44,44, 14.815, 4.938, 1.646, 0,5487 e 0 pM estradiol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare compostos amostrais.<ol>
<li>Amostras de vórtice.</li>
		<li>Pegue 4 μL de cada amostra de planta em DMSO e adicione a 496 μL de CSM para produzir uma solução DMSO de 0,8%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descongele rapidamente células repórteres.<ol>
<li>Recupere o tubo do meio de recuperação celular do banho de água de 37 °C. Desinfete a superfície externa usando 70% de etanol.</li>
		<li>Recuperar células repórteres a partir de -80 °C de armazenamento e descongelar transferindo 10 mL do CRM pré-aquecido para o tubo de células congeladas.</li>
		<li>Feche o tubo de Células Repórteres e transfira para um banho de água de 37°C por 5-10 min.</li>
		<li>Recupere o tubo de suspensão celular repórter do banho de água. Inverter o tubo das células várias vezes suavemente para quebrar agregados de células e produzir uma suspensão homogênea. Limpe a superfície do tubo com 70% de etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento de ensaio<ol>
<li>Dispense 100 μL da Suspensão da Célula repórter em cada poço usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Dispense 100 μL de amostras em triplicado em poços de ensaio apropriados.</li>
		<li>Transfira a placa para uma incubadora de 37 °C, umidificada de 5% de CO2 por 22-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descongele substrato de detecção e tampão de detecção em uma geladeira escura durante a noite para se preparar para o dia 2.</li>
	<li>Pouco antes do fim da incubação da placa, remova o Substrato de Detecção e o Tampão de Detecção da geladeira e coloque em área de pouca luz até que seja equilibrado para RT. Uma vez no RT, inverta cada tubo suavemente várias vezes para misturar completamente as soluções.<ol>
<li>Imediatamente antes da incubação estar concluída, despeje todo o conteúdo do Buffer de Detecção no tubo do Substrato de Detecção para criar reagente de detecção de Luciferase. Misture suavemente para não produzir espuma.</li>
		<li>Uma vez que a incubação esteja completa, inverta a placa para descartar o conteúdo em um recipiente de resíduos apropriado. Bata suavemente a placa em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotículas dos poços.</li>
		<li>Adicione 100 μL do Reagente de Detecção de Luciferase a cada poço. Deixe a placa de ensaio descansar em RT por 15 minutos. Não agite o prato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placas de 96 poços.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+(Procolobus+rufomitratus)+hormonal+state+and+behavior.">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li><li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution.">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li><li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. 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Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de repórter ERβ desenvolvido para triagem individual de agentes farmacêuticos também é adequado para triagem de alimentos vegetais para fitoestrogênios biologicamente ativos através do ERβ. Considerações importantes no protocolo incluem tratar as amostras da planta com cuidado: material vegetal fresco precisa ser seco rapidamente para evitar moldagem ou outra degradação biológica, e precisa ser mantido longe da luz para evitar a fotolise dos compostos18. O protocolo de ensaio12 fornecido pelo fabricante é claro e precisa de pouquíssimas modificações para fins de triagem. A curva padrão sugerida pelo fabricante foi modificada neste protocolo para aumentar o número de pontos que caem na faixa exponencial da curva(Figura 1),preservando os platôs superior e inferior. É possível usar esse ensaio para análise quantitativa, mas nosso objetivo é associar plantas com alta atividade a efeitos biológicos, escolha de alimentos e outros comportamentos nos animais que as consomem.
Para ilustrar ainda mais a eficácia da extração e do ensaio incluímos uma curva de resposta a dose com extrato de soja (Figura 2) e determinamos que, dada a potência do protocolo de extração normal, a soja deve ser diluída extensivamente antes que o sinal caia para 50% no máximo. Isso destaca o fato de que em altas concentrações de fitoestrogênios o sinal plana a um sinal máximo estável. Em concentrações muito baixas, o sinal pode não ser forte o suficiente para ser distinguido do fundo. É importante trabalhar com altas concentrações de extratos, a fim de detectar fitoestrogênios presentes em baixas quantidades em uma amostra, minimizando falsos negativos. Inicialmente, o laboratório utilizou um maior volume de DMSO em relação ao resíduo vegetal da extração de metanol (ou seja, 10 mL de DMSO a 0,1 g de resíduo vegetal). As amostras foram muito diluídos para induzir uma forte luminescência em amostras positivas. Devido a uma porcentagem máxima de DMSO para viabilidade celular repórter e restrições de volume dentro dos poços na placa, a concentração de extrato de amostra deve ser otimizada ao adicionar DMSO aos resíduos da planta. Um controle positivo como a soja deve ser incluído em cada placa, para confirmar que as células são viáveis e capazes de luminescência, e que a concentração do extrato é suficiente para obter uma resposta.
Este ensaio detecta compostos que se ligam ao ERβ, mas nem todos os fitoestrogênios têm o mesmo mecanismo de ação. Este protocolo de ensaio pode ser modificado incubando as células com uma combinação de estradiol e os compostos vegetais para detectar se há atividade antiestrogênio em uma amostra9,12. O estradiol tem grande afinidade com o ER, por isso a presença de fitoestrogênios pode ter atividade biológica antiestrogênica na presença de estradiol bloqueando os receptores, o que reduz a resposta aos estrogênios. A atividade antiestrogênica seria detectada por uma redução na ativação total com concentração crescente de extrato vegetal. Este ensaio não detectará outros métodos de ação, como a vinculação às ERs19ligadas à membrana . Além disso, alguns fitoestrogênios não são biologicamente ativos até serem metabolizados por micróbios intestinais20. É possível que algumas plantas que não têm ou baixa atividade estrogênica em seu estado nãoetabolizado tenham maior atividade estrogênica pós-metabolização que este ensaio não detectaria.
O ensaio de repórter ERβ foi escolhido para exemplificar a triagem de fitoestrogênios para atividade em plantas porque fitoestrogênios competem por ligação com estradiol mais fortemente ao ERβ do que ao ERα21. A triagem para a atividade ERα é possível através de um ensaio semelhante, no qual as células são transfectadas com o gene ERα em vez de ERβ.
Após uma triagem positiva para fitoestrogênios ativos, os compostos ativos podem ser identificados com métodos de cromatografia. De fato, nesse ponto os compostos isolados podem ser testados usando este ensaio e as concentrações médias máximas efetivas (EC50) podem ser determinadas usando uma série de diluição como medida de potência do composto.
Este ensaio é uma maneira confiável e simples de testar a atividade estrogênica biológica, tendo em mente suas limitações na amplitude dos mecanismos de atividade estrogênica. Possui várias melhorias em relação aos ensaios transitórios de transfecção, mais notavelmente a facilidade de uso, a estabilidade das células e a sensibilidade do ensaio.
Pouco se sabe sobre a prevalência de fitoestrogênios em alimentos vegetais silvestres consumidos por humanos ou animais silvestres22,mas estudos mostram que a exposição a PSMs estrogênicos na dieta pode ter efeitos duradouros23. Ter um ensaio simples e robusto que detecta esses compostos, em conjunto com estudos que avaliam quantidades comidas e quando são comidos, é um passo poderoso na determinação da função de incluir alimentos estrogênicos na dieta e os efeitos desses compostos em sistemas fisiológicos.

As plantas são uma fonte necessária de alimento para muitos animais, fornecendo calorias e nutrientes críticos à sobrevivência, reprodução, crescimento, desenvolvimento e comportamento1. As plantas produzem milhares de produtos químicos, muitos como adaptações para seu próprio crescimento, manutenção e reprodução estomáticas. Outros compostos, considerados metabólitos secundários vegetais (PSMs), têm funções menos claras, embora algumas sejam tóxicas e provavelmente usadas como defesa contra herbívoro e parasitismo (por exemplo, alcaloides, taninos)2,3. Alguns desses produtos químicos têm a capacidade de afetar processos fisiológicos de longo prazo em animais, como o funcionamento endócrino, embora por que esses fitoquímicos endócrinos-ativos interagem com o sistema endócrino vertebrado ainda não está claro2,4.
Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endocrinos mais bem estudados, são PSMs polifenóficos que imitam estrutural e funcionalmente estrogênios, interagindo diretamente com o eixo gânico hipotalmo-pituitário do sistema endócrinovertebrado 5. A ingestão de fitoestrogênios na dieta humana está associada à proteção contra alguns cânceres, doenças cardíacas e sintomas da menopausa, embora outros efeitos incluam problemas de fertilidade. De fato, os efeitos fisiológicos desses compostos foram descobertos na década de 1940, quando a infertilidade em ovelhas foi atribuída ao seu pasto no trevo rico em fitoestrogênio(Trifolium subterrareum)6. Quando ingeridos, fitoestrogênios podem passar para as células e imitar os efeitos do estrogênio. Embora os fitoestrogênios tivessem efeitos negativos na fertilidade das ovelhas, a relação entre fitoestrogênios e fisiologia não é simples. Como ovelhas, rinocerontes brancos do sul apresentam sensibilidade a compostos estrogênicos em ração derivada de altas quantidades de soja e alfafa. Filhas de mulheres alimentadas com essa dieta durante a gravidez são menos propensas a se reproduzir7. No entanto, outros estudos têm demonstrado que fitoestrogênios também podem ter efeitos positivos, incluindo a maturação de folículos ovarianos em camundongos mais velhos8, prevenção de certos cânceres, atividade antioxidante e efeitos antiproliferativos9.
A amplitude dos efeitos dos fitoestrogênios não é surpreendente, dado que os estrogênios afetam uma ampla gama de funções biológicas, incluindo crescimento, desenvolvimento e regulação dos sistemas nervosos reprodutivos e centrais10. Embora existam muitos mecanismos de ação, fitoestrogênios muitas vezes têm a capacidade de modificar, melhorar ou interromper a sinalização de estrogênio através de sua capacidade de agir como ligantes para os receptores de estrogênio intranuclear alfa e beta (ERα e ERβ). Muitos fitoestrogênios têm uma estrutura de anel fenólico semelhante aos estrogênios que lhes permite ligar receptores de estrogênio. Aqueles com atividade estrogênica agonizante funcionam como estrogênio, formando um complexo ativado de ligante ER que pode escurecer e se ligar a um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e desencadear transcrição genética11. Assim, estrogênios e fitoestrogênios regulam a atividade celular e as funções do sistema através de suas ações como fatores de transcrição.
Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de ovário de hamster chinês projetadas para expressar altamente ERβ, que foram transfectadas com o gene de luciferase de hamster(Photinus pyralis) ligado a um promotor do ERE12. Quando os compostos estrogênicos estão presentes, eles se ligam ao ER, escurecem e se ligam ao ERE, levando à transcrição do gene da luciferase. Após a adição de uma solução de substrato, a luciferase catalisa uma reação que leva à emissão de fótons. Portanto, amostras positivas produzem amostras leves e negativas.
Este ensaio comercialmente disponível elimina a necessidade de laboratórios transfetarem as células mamíferas com o gene repórter e o receptor de estrogênio13,14, que era instável e variável em eficácia. O ensaio fornece uma plataforma de transfecção estável que permite determinar rapidamente e simplesmente se uma planta tem atividade estrogênica através da ligação do receptor.
Testamos a hipótese de que a soja tem maior atividade estrogênica do que todos os outros alimentos, dadas as suas concentrações conhecidas de isoflavonas estrogênicas15 utilizando alimentos humanos de mercearias locais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

As plantas são uma fonte de alimento para muitos animais, e podem produzir milhares de produtos químicos. Alguns desses compostos afetam processos fisiológicos nos vertebrados que os consomem, como a função endócrina. Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endócrinos mais bem estudados, interagem diretamente com o eixo gândalo hipotalmo-pituitário do sistema endócrino vertebrado. Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de mamíferos projetadas para expressar altamente o receptor de estrogênio beta (ERβ) e que foram transfectadas com um gene de luciferase. A exposição a compostos com atividade estrogênica resulta nas células produtoras de luz. Este ensaio é uma maneira confiável e simples de testar a atividade estrogênica biológica. Possui várias melhorias em relação aos ensaios transitórios de transfecção, mais notavelmente, à facilidade de uso, à estabilidade das células e à sensibilidade do ensaio.

Vinte e dois extratos de frutas e vegetais comumente encontrados em dietas humanas foram examinados para a presença de compostos estrogênicos. Uma variedade de alimentos foram avaliados, incluindo leguminosas, como soja, ervilhas de neve e ervilhas, já que a família de ervilhas é uma fonte conhecida de fitoestrogênios16, além de figos, tâmaras, milho, cenoura, maçãs, bananas, morangos, tomate, couve e repolho. Compostos disruptores endócrinos são encontrados em substâncias comuns (por exemplo, plásticos e pesticidas) e alguns são biologicamente ativos através das ERs17. Quando possível, tanto itens orgânicos quanto nonorganicamente cultivados foram avaliados para explicar a possibilidade de que pesticidas com atividade estrogênica poderiam ter afetado os resultados.
Cada item de alimento vegetal foi banhado em triplicado e o luminômetro relatou a atividade de cada poço em Unidades de Luz Relativa (RLUs). Os níveis de fundo das RLUs são determinados na curva padrão com o Padrão 8, a concentração zero e usados para referência.  O valor de ativação da dobra, que é o multiplicador acima do RLU para o ponto Zero na curva, é calculado pela equação:
Ativação do Fold = ÷ (RLU) ÷ Padrão 8 (RLU)
Para fins interpretativos, a atividade estrogênica é apresentada de forma ordina, qualitativa de Alta, Med, Baixa ou Nenhuma Atividade. Altos níveis de atividade registram-se acima do valor de ativação padrão 4 vezes. As quedas médias entre o Padrão 5 e o Padrão 4, e os baixos valores estão entre a Norma 6 e a Standard 5. Quaisquer amostras com valores de ativação de dobra abaixo do Padrão 7 são consideradas Sem Atividade. Referindo-se à Tabela 1, a soja, tanto orgânica quanto não orgânica, triou em altos níveis de atividade, enquanto todos os outros itens de frutas e hortaliças não registraram atividade. Comparar os resultados da soja com a curva padrão(Figura 1),mostra que, cultivadas organicamente ou não, pontuam alto fora da curva para níveis de atividade estradiol nesta concentração. O extrato de soja, uma fonte potente conhecida das isoflavonas daidzein e genistein9,foi ainda utilizado para determinar a diluição produzindo um sinal de 50% ao máximo(Figura 2). Este extrato requer 422 vezes mais diluição para produzir metade do sinal do nosso protocolo de diluição padrão.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Produzir item</td>
			<td>Orgânico/ Não Orgânico</td>
			<td>Unidades de Luz Relativa (Lum)</td>
			<td>Ativação do fold</td>
			<td>Ativação da dobra (Média)</td>
			<td>Atividade de fitoestrogênio</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Soja</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>1687</td>
			<td>29.016</td>
			<td rowspan="3">31.06</td>
			<td rowspan="3">Alta</td>
		</tr><tr><td>2023</td>
			<td>34.796</td>
		</tr><tr><td>1706</td>
			<td>29.353</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Soja</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>2041</td>
			<td>35.106</td>
			<td rowspan="3">32.05</td>
			<td rowspan="3">Alta</td>
		</tr><tr><td>1956</td>
			<td>33.647</td>
		</tr><tr><td>1593</td>
			<td>27.399</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Ervilhas</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>53</td>
			<td>0.919</td>
			<td rowspan="3">0.92</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>49</td>
			<td>0.836</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Snap Ervilhas</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>66</td>
			<td>1.142</td>
			<td rowspan="3">1.21</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>60</td>
			<td>1.032</td>
		</tr><tr><td>85</td>
			<td>1.462</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Milho</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>29</td>
			<td>0.502</td>
			<td rowspan="3">0.53</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.513</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.575</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Morango</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>35</td>
			<td>0.609</td>
			<td rowspan="3">0.77</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.808</td>
		</tr><tr><td>51</td>
			<td>0.884</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Morango</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>56</td>
			<td>0,75x</td>
			<td rowspan="3">0.88</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.678</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Banana</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>32</td>
			<td>0.544</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.489</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Banana</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>33</td>
			<td>0.564</td>
			<td rowspan="3">0.60</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>41</td>
			<td>0.712</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Banana</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>37</td>
			<td>0.64</td>
			<td rowspan="3">0.70</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.805</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kale</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>26</td>
			<td>0.447</td>
			<td rowspan="3">0.47</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>26</td>
			<td>0.444</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.519</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kale</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>40</td>
			<td>0.685</td>
			<td rowspan="3">0.63</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.485</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.719</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Repolho</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>33</td>
			<td>0.568</td>
			<td rowspan="3">0.54</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>27</td>
			<td>0.468</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.588</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Repolho</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>44</td>
			<td>0.757</td>
			<td rowspan="3">0.66</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.585</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.626</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Apple</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>30</td>
			<td>0.523</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>0.437</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.509</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Apple</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>41</td>
			<td>0.705</td>
			<td rowspan="3">0.62</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>37</td>
			<td>0.63</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tomate</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>51</td>
			<td>0.874</td>
			<td rowspan="3">0.87</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>57</td>
			<td>0.974</td>
		</tr><tr><td>44</td>
			<td>0.76</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tomate</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>61</td>
			<td>1.056</td>
			<td rowspan="3">1.19</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>81</td>
			<td>1.386</td>
		</tr><tr><td>66</td>
			<td>1.128</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Cenoura</td>
			<td rowspan="3">Orgânico</td>
			<td>33</td>
			<td>0.575</td>
			<td rowspan="3">0.51</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.561</td>
		</tr><tr><td>22</td>
			<td>0.382</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Cenoura</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>31</td>
			<td>0.53</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>21</td>
			<td>0.365</td>
		</tr><tr><td>38</td>
			<td>0.657</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Fig</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>29</td>
			<td>0.506</td>
			<td rowspan="3">0.61</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.716</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.619</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Datas</td>
			<td rowspan="3">Não orgânico</td>
			<td>29</td>
			<td>0.495</td>
			<td rowspan="3">0.59</td>
			<td rowspan="3">Sem atividade</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>35</td>
			<td>0.602</td>
		</tr></tbody></table>Mesa 1. Resultados representativos do Sistema de Ensaios ERβ Reporter para triagem de frutas e hortaliças para atividade fitoestrogênio. A atividade positiva é indicada por Alta, Med, Baixa ou Nenhuma Atividade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig1.jpg"> Figura 1. Diluição serial de 17β-Padrão Estradiol (Padrão 1 a 8 concentrações = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0,5487 e 0 pM, respectivamente) usando o Sistema de Ensaios ERβ Reporter. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig2.jpg"> Figura 2. O ensaio do ERβ Reporter usando uma diluição serial do extrato de soja para determinar a diluição que rendeu uma relação sinal-fundo que é de 50% do sinal máximo. A partir do método de extração padrão dissolvendo o extrato vegetal em sulfóxido de dimetila (DMSO) a uma concentração de 0,1 g de extrato a 2 mL de DMSO, a soja deve ser diluída 422 vezes para obter um sinal de 50% da resposta máxima. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Otimizamos um receptor de estrogênio comercialmente disponível β ensaio para triagem de alimentos primatas humanos e não humanos para atividade estrogênica. Validamos este ensaio mostrando que a conhecida soja humana estrogênica registra alta, enquanto outros alimentos não mostram atividade.

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K visualizações.  Indiana University. Otimizamos um receptor de estrogênio comercialmente disponível β ensaio para triagem de alimentos primatas humanos e não humanos para atividade estrogênica. Validamos este ensaio mostrando que a conhecida soja humana estrogênica registra alta, enquanto outros alimentos não mostram atividade.

Vídeo: Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  β Reporter Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Bioquímica

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Exibição Inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis disorder and damage of intestinal mucosa and seems to be associated with an increased risk of colon neoplastic transformation. Accumulating evidence indicates that estrogens and estrogen receptors affect not only hormone-sensitive tissues, but also other tissues not directly related to estrogens, such as the lungs or colon. Here, we describe the protocol for the successful immunofluorescence staining of estrogen receptors in colon obtained from a murine model of TNBS-induced Crohn&#39;s disease. A detailed protocol for the induction of Crohn&#39;s disease in mice and intestine preparation is provided as well as a step-by-step immunohistochemical procedure using formalin-fixed paraffin-embedded intestine sections. The described methods are not only useful for estrogen receptor detection and estrogen signaling investigation in vivo but can also be applied to for other proteins which may be involved in the development of colitis.

The protocol presents a complete validated TNBS-induced murine model of Crohn&#39;s disease and methods for visualization of estrogen receptors by immunohistochemistry using immunofluorescence of formalin-fixed colon sections embedded in paraffin.

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest advantage of NMR-based fragment screening is its ability not only to detect binders over 7-8 orders of magnitude of affinity but also to monitor purity and chemical quality of the fragments and thus to produce high quality hits and minimal false positives or false negatives. A prerequisite within the FBS is to perform initial and periodic quality control of the fragment library, determining solubility and chemical integrity of the fragments in relevant buffers, and establishing multiple libraries to cover diverse scaffolds to accommodate various macromolecule target classes (proteins/RNA/DNA). Further, an extensive NMR-based screening protocol optimization with respect to sample quantities, speed of acquisition and analysis at the level of biological construct/fragment-space, in condition-space (buffer, additives, ions, pH, and temperature) and in ligand-space (ligand analogues, ligand concentration) is required. At least in academia, these screening efforts have so far been undertaken manually in a very limited fashion, leading to limited availability of screening infrastructure not only in the drug development process but also in the context of chemical probe development. In order to meet the requirements economically, advanced workflows are presented. They take advantage of the latest state-of-the-art advanced hardware, with which the liquid sample collection can be filled in a temperature-controlled fashion into the NMR-tubes in an automated manner. 1H/19F NMR ligand-based spectra are then collected at a given temperature. High-throughput sample changer (HT sample changer) can handle more than 500 samples in temperature-controlled blocks. This together with advanced software tools speeds up data acquisition and analysis. Further, application of screening routines on protein and RNA samples are described to make aware of the established protocols for a broad user base in biomacromolecular research.

Fragment-based screening by NMR is a robust method to rapidly identify small molecule binders to biomacromolecules (DNA, RNA, or proteins). Protocols describing automation-based sample preparation, NMR experiments &#38; acquisition conditions, and analysis workflows are presented. The technique allows for optimal exploitation of both 1H and 19F NMR-active nuclei for detection.

Triagem de fragmentos baseada em RMN em uma amostra mínima, mas no modo de automação máxima

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...