The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.

Todos os protocolos de mouse estavam de acordo com os institutos nacionais de saúde e orientações foram aprovadas pelo Comitê de animal Estudos da Escola de Medicina da Universidade de Washington (St. Louis, MO). 1. Preparando a Placa e Recintos Testing <ol><li> Limpar a superfície do vidro. </li><li> Segurar a sonda termopar filamento do tipo T à superfície no meio da placa de vidro com fita adesiva de laboratório. </li><li> Colocar o animal independente sobre a placa de vidro em uma única linha ao longo do meio da placa. </li><li> Passe a sonda termopar através do cerco animal centro e ligar para o registrador de dados. Vire o registrador de dados enquanto a desativação do recurso de auto-desligamento, e anexar o registrador de dados para o computador com o cabo fornecido. <ol><li> Se a gravação da temperatura da placa durante o experimento, abra o software registrador de dados para começar a gravar temperaturas placa. </li><li> Se necessário, ajustar o software de recabo a temperatura da placa de uma vez a cada segundo. </li><li> Começar a gravar temperaturas usando o software fornecido com o registrador de dados térmico. </li></ol></li><li> Separe o recinto com pastilhas pretas para evitar a interação visual entre camundongos. </li><li> Posição espelhos por baixo do vidro de modo que a parte de baixo das caixas é visível a partir de uma posição sentada confortável. </li></ol> 2. O aquecimento / resfriamento da placa de vidro <ol><li> Preencha caixas de alumínio com água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco e posicioná-los de forma adequada sobre a placa de vidro (pacotes de folhas de alumínio preenchidos com gelo seco também pode ser usado para resfriar o vidro; Figura 1) 2. <ol><li> Para os testes, a 30 ° C, posicione as caixas de alumínio de aproximadamente 0,25 &#39;&#39; longe dos recintos de animais (Figura 2B) 2. <ol><li> Definir um circulador de água aquecida em ambos os lados da placa de vidro. Definir o circulador para 45 - 60 ° C, e nósenviar um e-lo para preencher as caixas de alumínio com um fluxo constante de água quente (Figura 1C) 2. </li><li> Posicionar os circuladores de tal modo que a água quente a partir das caixas de alumínio escoa directamente de volta para dentro do reservatório da bomba de circulação em cada um dos lados (Figura 1C) 2. </li></ol></li><li> Para os testes à temperatura ambiente, deixar as caixas vazias (Figura 2) 2. </li><li> Para os testes a 17 ° C, posicione as caixas de aproximadamente 0,25 &#39;&#39; longe dos recintos de animais de cada lado e encher com gelo molhado (Figura 2) 2. </li><li> Para os testes a 12 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 1,25 &#39;&#39; distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) 2. </li><li> Para os testes, a 5 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 0,25 &#39;&#39; distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) 2.<ol><li> Quando arrefecer o copo com gelo seco, verifique se não há ventilação suficiente para evitar o acúmulo de CO 2 no quarto. </li></ol></li></ol></li><li> Espera para o vidro para atingir a gama de temperatura desejada. </li><li> Adicionar os ratos para os compartimentos da placa. NOTA: Um gerador de ruído branco podem ser utilizados para diminuir as perturbações de ruído. </li><li> Aguarde até que os ratos para se aclimatar. NOTA: Em nosso serviço isso leva aproximadamente 2,5 horas, mas isso pode variar significativamente com base nas condições de manipulação e de alojamento dos animais. </li><li> Manter o vidro no intervalo de temperatura desejado, garantindo que as caixas são mantidas cheias de água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco. NOTA: Com o nosso aparelho as caixas precisam ser recarregados com gelo aproximadamente a cada 90 min. NOTA: Para a 17 ° C condição, é útil para esvaziar a maior parte da água das caixas de alumínio através dos furos de drenagem antes de enchê-lo com gelo. Isto irá estabilizar a temperatura melhor, e prevento estouro NOTA: A quantidade exacta do gelo seco irá variar sazonal, mas, em geral, mantendo as caixas de mais do que ¼ cheio ao longo de todo o comprimento da caixa, será manter a temperatura constante. </li></ol> 3. Teste o Mice em temperaturas fixas <ol><li> Do lado de fora da sala de comportamento, encher um balde de gelo sobre meio cheio de gelo seco. </li><li> Usando um martelo ou malho, esmagar o gelo seco em um pó fino. NOTA: O excesso de balde irá tornar mais difícil para esmagar completamente o gelo seco em pó. </li><li> Usando uma lâmina de navalha ou tesoura, corte a parte de cima de uma seringa de 3 ml. </li><li> Usando uma agulha de 21 G, picar 3 furos em lados opostos da seringa (total de 6 furos). NOTA: Estes furos vai diminuir a pressão gerada por sublimação, enquanto comprime o gelo seco. A seringa de corte pode ser reutilizada para vários experimentos. </li><li> Pegue na seringa, o pó de gelo seco, e um cronômetro de mão na sala de comportamento. </li><li> Encha a câmara de seringa meio cheio de pó de gelo seco. Segurar a extremidade cortada da seringa de encontro a um objecto chato, e firmemente comprimir o pó usando o êmbolo. Seja cuidadoso; o êmbolo plástico pode entortar ou quebrar com a pressão. Se isso acontecer, substitua o êmbolo de uma seringa nova. </li><li> Estender a ponta do comprimido sedimento gelo seco além da extremidade da seringa. </li><li> Ratos de teste que são completamente em repouso. <ol><li> A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, os ratinhos de teste, que têm todas as 4 patas sobre o vidro e não se deslocam, mas não totalmente 19 adormecido. </li><li> A 12 ° C e 5 ° C, os ratos de teste que são em 2 patas ou 4 patas e não em movimento ou de salto. </li></ol></li><li> Usando os espelhos para segmentação, gentil mas firmemente alisar o resplendor pellet contra a superfície de vidro debaixo da pata traseira do mouse (Figura 1A) 2. Comece a mão-timer. </li><li> Parar o temporizador e remover o sedimento quando o rato afasta-se do vidro arrefecida. NOTA: O movimento de retrocesso pode ser vertical ou horizontal. <ol><li> Se o mouse se move muito rapidamente a pata e, em seguida, retorna para a superfície de refrigeração, continuar a cronometragem e estimulando até que o rato faz um movimento permanente de distância. NOTA: O nosso laboratório usa um tempo máximo de 20 segundos de estímulo para os ratos, na maioria dos casos. </li></ol></li><li> Repita este procedimento até que o teste pelo menos três valores em cada pata de cada animal são coletados. Experimentações separadas testando as patas opostos no mesmo rato por, pelo menos, 7 min, e ensaios consecutivos separados em qualquer única pata por, pelo menos, 15 min. </li><li> Se for necessário, utilizam diferentes espessuras de vidro para gerar diferentes taxas de arrefecimento (Figura 3) 1. NOTA: A taxa de arrefecimento está inversamente correlacionada com a espessura do vidro. </li></ol> 4. Testando o Ratos Durante Fria Adaptação NOTA: Este é um protocolo alternativo que permite testar como o plat de vidroe esfria, ao invés de uma vez que a placa se estabilizou e os ratos estão totalmente adaptados ao ambiente frio. <ol><li> Siga as instruções listadas na Seção 1 para configurar o aparelho. </li><li> Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas de base na RT (Figura 7A) 2. </li><li> Pré-resfriar as caixas de alumínio com gelo seco. </li><li> Uma vez que as latências de retirada da linha de base foram medidos, posicione as caixas prï¿½arrefecida na placa aproximadamente 1,25 &#39;&#39; longe dos gabinetes de ambos os lados (Figura 7A, seta rotulado como &quot;gelo seco adicionado&quot;) 2. </li><li> Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas como a placa de vidro esfria, tomando medidas o mais rápido possível. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Behavioral+Assay+for+Measuring+Cold+Sensation+in+Mice.">A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice.</a> Plos ONE. 7 (6), 8 (2012).</li><li>Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+measure+cold+adaptation+in+freely+behaving+mice.">A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2014).</li><li>Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+signs+of+ongoing+pain+and+cold+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Pain. 59 (3), 369-376 (1994).</li><li>Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+increased+expression+of+transient+receptor+potential+melastatin+8+in+oxaliplatin-induced+cold+allodynia+in+mice.">Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice.</a> Neuroscience letters. 458 (2), 93-95 (2009).</li><li>Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+manifestations+of+an+experimental+model+for+peripheral+neuropathy+produced+by+spinal+nerve+ligation+in+the+primate.">Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate.</a> Pain. 56 (2), 155-166 (1994).</li><li>Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cold+water+tail-flick:+A+novel+analgesic+test+that+distinguishes+opioid+agonists+from+mixed+agonist-antagonists.">Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists.</a> European Journal of Pharmacology. 119 (1-2), 23-29 (1985).</li><li>Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menthol+receptor+TRPM8+is+the+principal+detector+of+environmental+cold.">The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold.</a> Nature. 448 (7150), 204-208 (2007).</li><li>Obata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrpA1+induced+in+sensory+neurons+contributes+to+cold+hyperalgesia+after+inflammation+and+nerve+injury.">TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (9), 2393-2401 (2005).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirt+functions+as+an+endogenous+regulator+of+TRPM8.">Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8.</a> Nature communications. 4, 2179 (2013).</li><li>Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+thermal+selection+behavior+in+mice+lacking+transient+receptor+potential+vanilloid+4.">Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (5), 1304-1310 (2005).</li><li>Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+code+for+Mammalian+thermosensation.">The cellular code for Mammalian thermosensation.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (13), 5533-5541 (2013).</li><li>Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -. J., Barrot, M., Poisbeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+thermal+allodynia+and+hyperalgesia+using+dynamic+hot+and+cold+plate+in+rodents.">Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents.</a> The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10 (7), 767-773 (2009).</li><li>Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mechanical+and+thermal+nociceptive+sensitivity+in+the+laboratory+mouse+by+behavioral+state.">Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state.</a> The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9 (2), 174-184 (2008).</li><li>Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+set+point+for+thermal+adaptation+requires+phospholipase+C-mediated+regulation+of+TRPM8+in+vivo.">A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo.</a> Pain. , (2014).</li><li>Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+neuronal+cold+sensor+TRPM8+is+regulated+by+phospholipase+C+via+the+phospholipid+phosphoinositol+4,5-bisphosphate.">Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate.</a> The Journal of biological chemistry. 284 (3), 1570-1582 (2009).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurokinin-1+receptor+enhances+TRPV1+activity+in+primary+sensory+neurons+via+PKCepsilon:+a+novel+pathway+for+heat+hyperalgesia.">Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (44), 12067-12077 (2007).</li><li>Wang, H., Zylka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mrgprd-expressing+polymodal+nociceptive+neurons+innervate+most+known+classes+of+substantia+gelatinosa+neurons.">Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (42), 13202-13209 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and genetic neuron ablation studies26. It can be modified to measure responses to a variety of rates of cooling using different thicknesses of glass, and the size of the cold stimulus applied can be altered using different sized syringes. 
The most critical step for performing this assay properly is cooling or warming the glass plate evenly during testing. Carefully arranging the aluminum boxes so that they are evenly spaced on either side of the animal enclosures will help generate more uniform temperatures. Marking the glass plate to standardize aluminum box placement between experiments will also improve the reproducibility of the assay, although these markings may have to be periodically recalibrated to account for seasonal variations in building temperature.
It can also be challenging to maintain a consistent glass plate temperature over the course of the experiments. Ensuring that the aluminum boxes are always evenly filled with dry ice/wet ice/warmed water will yield experiments with stable plate temperatures. Additionally, under the 17 &#176;C testing condition it may become more difficult to maintain the temperature as the wet ice melts. We recommend draining excess water from the melted ice out of the aluminum boxes before refilling with more wet ice. 
The main limitation is that the mouse paw must be in contact with the glass surface in order to ensure a consistent cold stimulus. This can be an issue in some neuropathic models, such as the chronic constriction injury, which can cause paw curling. Other challenges to obtaining reproducible results with this assay include that the mice must be fully at rest, which requires adequate acclimation periods. If the mice are too active for testing, it may help to allow longer acclimation periods. Finally, groups that are planning to utilize this assay must also ensure that there is sufficient ventilation in the room in order to prevent CO2 buildup when using large amounts of dry ice.

Medir a capacidade de resposta fria em roedores é importante para melhorar a compreensão dos potenciais mecanismos de sensibilidade frio em seres humanos, tanto em condições normais e patológicas. The Cold Plantar Assay (CPA), originalmente desenvolvido há vários anos um, é projetado para gerar, respostas inequívocas murino comportamentais reprodutíveis a um estímulo frio entregue na RT. Mais recentes melhorias deste ensaio permitiu a medida reprodutível de sensibilidade frio a uma vasta gama de temperaturas de 2. Ambas as versões também são projetados para ser relativamente alto rendimento, e barato de usar. Uma grande quantidade de progresso tem sido feito na compreensão dos mecanismos de sensibilidade frio usando outros métodos comportamentais. Um método é o teste de evaporação de acetona, enxugando ou que envolve a pulverização acetona na pata do rato e medindo a quantidade de tempo que o rato gasta sacudindo a 3,4 pata. Infelizmente,as respostas a acetona evaporação são confundidos pela sensação molhada e o cheiro da acetona. Além disso, o estímulo frio que é aplicado no teste de acetona evaporação pode variar de acordo com a quantidade de acetona aplicada, e é difícil de quantificar. Finalmente, os ratinhos lesionados têm respostas mínimas para acetona a linha de base, o que torna impossível de medir a analgesia na ausência de hipersensibilidade com este método. Outro ensaio clássico para respostas frias é o ensaio da ponta da cauda, ​​onde a latência para retirada é medida após a cauda está imerso em 5,6 água fria. Enquanto as respostas comportamentais neste ensaio são inequívocos e o ensaio mede as respostas a uma temperatura específica, os animais devem ser imobilizados durante os testes, o que pode alterar a capacidade de resposta fria através bem descritos mecanismos analgésicos estresse induzido por 7. Outra ferramenta utilizada é o teste de placa fria, que mede o comportamentorespostas dos ratos depois de serem colocados sobre uma placa arrefecida com Peltier 8-10. Enquanto esta ferramenta fornece informações sobre as respostas de animais em temperaturas específicas, ele também tem sido usado de forma inconsistente; diferentes grupos foram medidos diferentes tipos de resposta incluindo o número de saltos 8,11, a latência a primeira resposta 8,11- 13, e o número de pata elevadores 11,13,14 com resultados muito diferentes. O teste de placa de frio é também relativamente baixa taxa de transferência uma vez que apenas um animal pode ser testada ao mesmo tempo, e necessitam de um dispositivo de Peltier caros e frágeis. O teste de preferência temperatura 2 placa é um derivado normalmente usado para o teste de placa fria, que mede a quantidade relativa de tempo em que os animais passam em 2 placas conectadas de diferentes temperaturas 9,15- 17. Outro ensaio utilizado é semelhante ao ensaio de gradiente térmico, em que a quantidade de tempo que os ratos passam em diferentes zonas de temperaturavariando entre 5 ° C e 45 ° C em uma placa de metal é medida a longo 16. Enquanto estes ensaios permitir a comparação das temperaturas, não está claro se o comportamento representa aversão temperatura ou a preferência de temperatura. Finalmente, o ensaio de placa fria dinâmica tem sido usado para medir como ratos responder às mudanças nas temperaturas ambiente 18. Este método envolve a colocação de ratos em um dispositivo Peltier RT e aumentando-a para 1 ° C enquanto mede o quanto os ratos saltar ou lamber as patas em diferentes temperaturas de placas. Enquanto isto testa como ratos se adaptar a um ambiente de arrefecimento, ele não fornece uma maneira de testar como os ratos responder a um estímulo frio na definição de uma temperatura ambiente mais fresco. Além disso, requer equipamentos caros para realizar e não fornece uma maneira de se aclimatar ratos para o equipamento de teste antes de medir a sua sensibilidade frio. Para complementar estes ensaios, o CPA testa a ACCLIMAted respostas a um estímulo frio bem definida em uma variedade de faixas de temperatura, ou durante o processo de adaptação a temperaturas ambientes frios. Pode testar-se a 14 ratinhos de cada vez com o nosso aparelho actual, com o potencial de ser barata aumentada a escala para ensaios de elevado rendimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Name</td>
			<td style="width:320px;">Company</td>
			<td style="width:353px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-type thermocouple probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>IT-24p</td>
			<td>Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plate</td>
			<td>Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4&#39;&#39;, but 3/16&#39;&#39; and 1/8&#39;&#39; are also useful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal Data logger</td>
			<td>Extech</td>
			<td>EA15</td>
			<td>Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&#38;prodid=408)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309657</td>
			<td>The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>If using Extech logger, any Pcwill work</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum boxes</td>
			<td>Washington University in St. Louis machine shop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>boxes are 3&#39; long, 4.5&#39;&#39; wide, and 3&#39;&#39; tall with a sealed lid.&#160; There is a 1/2&#39;&#39; hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated water circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Any water circulator model with a pump will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">305165</td>
			<td>The exact needle size is not important</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hand timer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Any hand timer will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mirror</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Any flat mirror will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and inexpensive method for determining cold sensitivity and adaptation in mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

As respostas comportamentais induzidos de ratinhos a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C são altamente reprodutível (Figura 4A) 20. A fim de medir o estímulo frio sendo gerado sob a pata traseira, os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina / acepromazina e cocktail suas patas foram assegurados no vidro na parte superior de um termopar de tipo T filamento (Figura 4B) 20. O vidro foi arrefecida ou aquecida para a faixa de teste desejada. Embora a placa é arrefecida de maneira uniforme ao longo do comprimento da placa (Figura 5A) 2, deve notar-se que um gradiente de frio é gerada entre os compartimentos de comportamento (Figura 5B) 2. As partes do invólucro que estão mais próximos do gelo seco em ambos os lados dos compartimentos são mais frias, enquanto que as partes centrais são ligeiramente mais quente (Figura 5B) 2. Em temperaturas mais baixas used, os ratos passam a maior parte do seu tempo nas partes centrais do gabinete. Uma vez que a temperatura da placa de vidro tinha estabilizado, um estímulo gelo seco focal foi colocado sobre o vidro por baixo da pata / thermode. Com base nos vestígios de temperatura registadas a partir desta configuração, é evidente que os estímulos frios gerados usando o CPA são altamente reprodutíveis em cada intervalo de temperatura (Figura 4C) 20. O estímulo frio gerado na PCR também foi medida com três espessuras diferentes de vidro para variar a intensidade do arrefecimento (Figura 3). A taxa de arrefecimento está inversamente relacionada com a espessura do vidro, e qualquer destas espessuras podem ser utilizadas para medir a sensibilidade ao frio, conforme necessário (Figura 3). Trabalhos anteriores mostraram que o APG pode detectar a analgesia e hipersensibilidade em ratinhos. 30 min após a injecção subcutânea de 1,5 mg / kg de morfina, os ratos têm significativamente longer latência de retirada de ratinhos que receberam injecções subcutâneas de solução salina (Figura 6A: 2-way ANOVA principal efeito * p &lt;0,05 com Bonferroni post-hoc; 30 min ** p &lt;0,01; n = 12 por grupo) 1. Por 60 min após a morfina / soro fisiológico, não há diferença entre a saline- e grupos de injecção de morfina, o que é consistente com a taxa de metabolismo da morfina em ratos. Adjuvante Completo de Freund (CFA) foi previamente demonstrado que causam inflamação e hipersensibilidade após injecção 21 da pata traseira. Após injecções CFA, as latências de retirada da CPA diminuir 2 e 3 h pós-injecção (Figura 6B: 2-way ANOVA principal efeito p &lt;0,001 com Bonferroni post-hoc de teste; 2 hr * p &lt;0,05, 3 h ** p &lt;0,01 n = 12 por grupo). 4 horas após a injecção de CFA, os ratinhos receberam injecções subcutâneas de 1,5 mg / kg de morfina. 30 min após a injecção de morfina, tanto CFA- e ratinhos injectados com soro fisiológico tinha aumentado withdrawal latências em relação às suas latências em 3 horas (Figura 6B: 1-way ANOVA com teste post-hoc de Dunnett; CFA 3 hr vs. CFA 4,5 hr $$$ p &lt;0,001, salina 3 hr vs. salina 4,5 hr $$$ p &lt;0,001). Uma hora mais tarde, uma vez que a morfina tinha sido metabolizada, os ratinhos injectados com CFA mais uma vez teve latências de retirada mais baixos do que os ratinhos de controlo injectados com soro fisiológico (Figura 6B: 2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; ** p &lt;0,01) 1. A maioria das espécies de mamíferos têm a capacidade de se adaptar a sua sensibilidade à temperatura para coincidir com o seu ambiente. In vitro, estudos têm sugerido que este processo de adaptação depende PIP 2 hidrólise 22- 24, mas as ferramentas comportamentais anteriores não foram capazes de validar essa hipótese in vivo. A A CPA é capaz de quantificar esta adaptação de duas maneiras diferentes. Ao testar a latência de retirada de ratinhos como o vidro arrefece ( <strong&gt; Figura 7A, C), o CPA pode medir a adaptação ao frio, como acontece 2. Em condições normais, a latência de retirada é alterado conforme o prato esfria, o que sugere que a adaptação ao frio acontece mais rápido do que pode ser quantificado com o CPA (Figura 7b: ​​0 min = 12,13 ± 0,8 seg, 30 min = 12,1 ± 1,6 seg, 60 min = 13,2 ± 1,1 seg, 90 min = 10,8 ± 1,2 s 1-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni p&gt; 0,05, n = 6) 2. No entanto, quando os ratinhos são dadas injecções intraplantar da fosfolipase-C U73122 25 inibidor antes da placa é arrefecida (Figura 7C) suas latências de retirada são diminuídos, sugerindo que a adaptação é prejudicada (Figura 7D: linha de base = 11,29 ± 0,53 sec, 30 min = 8,09 ± 1,17 s; 1-way ANOVA com teste de Dunnett post-hoc, o efeito principal p = 0,02, individuais de linha de base vs. 30 min p = 0,02, n = 9). A CPA também pode medir a abilid a adaptar-se a temperaturas ambientes frios durante longos períodos de tempo. Quando ratinhos do tipo selvagem são testados usando o CPA depois de ter sido aclimatados durante 3 horas a 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C, a latência de retirada é a mesma temperatura em toda a partir, sugerindo que o de tipo selvagem ratos adaptados à temperatura ambiente mais frio (Figura 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 seg, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 segundos, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 seg, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 s, 1- ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, p &lt;0,05 n = 6 para 30 ° C, n = 15 para 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C) 20. Ao contrário dos camundongos selvagens, como a temperatura de partida diminui as latências de retirada de camundongos TRPM8-KO diminuir, sugerindo que eles são incapazes de adaptar o seu limiar de resposta para se adequar ao seu ambiente (Figura 8: 1-way ANOVA de medidas repetidas com Bonferroni pós- teste hoc; machos principal efeito p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C, p = 6 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,004; fêmeas principal efeito p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 machos e 11 fêmeas) 20. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig1.jpg" /> Figura 1. The Cold Plantar Assay (CPA) aparelho 2. (A) Esquema para a realização do CPA. Ratos são aclimatados em uma placa de vidro em caixas plásticas de comportamento até que eles estão em repouso. Um sedimento de gelo seco é aplicado ao lado de baixo do vidro debaixo da pata traseira, e a latência para retirar o vidro de arrefecimento é medido. (B) Imagem do aparelho CPA, em configuração para arrefecer a chapa até 5 ° C. O registrador de dados térmica está no centro das caixas, E as caixas de alumínio flanquear o invólucro em ambos os lados. (C) de imagem do aparelho de CPA, em configuração de aquecer a placa a 30 ° C. O circulador de água flui a água quente para a caixa de alumínio, que, em seguida, flui para fora da fuga no lado de trás para dentro do reservatório da bomba de circulação. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig2.jpg" /> Figura 2. A temperatura da placa de vidro durante o CPA 2. (A) Média de traçados de temperatura da placa de vidro no decurso de experiências comportamentais no CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C, n = 7, 12 ° C, n = 7, 4 ° C n = 5. (B) os diagramas esquemáticos demmonstrando como gerar as diferentes condições de temperatura na CPA. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig3.jpg" /> Figura 3. A espessura do vidro é inversamente correlacionada com a taxa de arrefecimento 1. (A) Esquema de diagramação do projeto experimental (BD). A temperatura durante o estímulo frio debaixo da planta do pé da pata foi medido em todos os três espessuras de vidro sob condições normais, e que os espaçadores de isopor sustentando a pata de distância da superfície do vidro. Em todos os casos, sustentando a pata longe do vidro causou uma diminuição dramática no estímulo frio medida na pata (n = 6 por espessura de vidro). ( <strong&gt; E) A temperatura debaixo da pata foi medido durante Hargreaves estimulação calor radiante com a pata apoiado com isopor. Ao contrário do ensaio plantar frio, o estímulo térmico no ensaio de Hargreaves é basicamente inalterado quando a pata é sustentado fora do vidro (n = 6). Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2012 1 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig4.jpg" /> Figura 4. latências de retirada são consistentes CPA 20. (A) a latência de retirada de ratinhos médio a partir de 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C. (B) Configuração para medir CPA estímulo frio. A pata de um rato anestesiado é preso na placa de vidro com fita de laboratório em cimade um filamento de termopar de tipo T. O estímulo de CPA é colocado no lado inferior do vidro debaixo tanto pata e termopar. (C) As temperaturas geradas no CPA a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C. As setas pretas representam as latências médias de retirada para os ratos acordados em cada condição. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig5.jpg" /> Figura 5. temperaturas da chapa de vidro são consistentes na CPA 2. (A) Termopar t1 (preta) foi colocado no centro do prato. T2 termopar (vermelho) foi colocado no compartimento comportamental mais próximo da extremidade direita da placa. Os tra temperaturacings e o gráfico na extremidade direita (t1-t2) mostram temperaturas quase idênticas, t1 e t2 durante todo o decurso da experiência. (B) t1 termopar (preta) foi colocado no centro do prato. T2 termopar (vermelho) foi colocado no compartimento de comportamento central, na parede mais próxima das caixas de alumínio cheio de gelo seco. Os traçados no gráfico de temperatura e na extremidade direita (t1-t2) mostram que existe uma diferença de cerca de 3 ° C entre t1 e t2, uma vez que a chapa tenha atingido uma temperatura estável. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig6.jpg" /> Figura 6. A CPA pode medir analgesia e hipersensibilidade 1. (A) Subcutaneous injecção de 1,5 mg / kg de morfina aumenta a latência de retirada de ratinhos 30 minutos após a injecção (2-way ANOVA com Bonferroni post-hoc, 30 min após injecção ** p &lt;0,01). 60 min após a injecção, não há nenhuma diferença significativa entre os ratos injectados com soro fisiológico e injectados morfina. (B) injecção intraplantar de 10 ul Adjuvante Completo de Freund (CFA) diminui a latência de retirada de ratinhos 2 e 3 h pós-injecção (2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01). Todos os ratos receberam injeções subcutâneas de morfina em 4 horas, e todas as latências de retirada em 4,5 horas foram significativamente maiores em comparação com 3 horas (1-way ANOVA com teste post-hoc de Dunnet; $$$ p &lt;0,001). 5,5 horas após a injecção de CFA (1,5 h após a injecção de morfina), os ratinhos injectados com CFA ainda tinham latências de retirada mais baixas do que os ratos injectados com soro fisiológico (2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; ** p &lt;0,01). Reutilizado com permissão deBrenner et al. 2012 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig7.jpg" /> Figura 7. Medição de adaptação ao frio, como a placa de vidro esfria dinamicamente 20. (A) Esquema para a realização da CPA como a placa de vidro está esfriando. As temperaturas de linha de base são medidos à temperatura ambiente, os recipientes de gelo seco são adicionados à placa, e a latência de retirada é medida como a placa de vidro arrefece. (B) ratinhos de tipo selvagem tem o mesmo como latência de retirada da placa de vidro arrefece, o que sugere que eles se adaptam a temperaturas de arrefecimento mais rápido do que pode ser medido com o CPA (linha de base = 12,8 ± 0,3 seg, 30 min = 13,67 ± 0,9 seg, 60 min = 11,03 ± 1,0 seg, 90 min = 11,31 ± 0,6 seg, n = 3 murganhos; 1-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, não há diferenças significativas entre todos os grupos). (C) Esquema para a realização da CPA como a placa de vidro está esfriando, após intraplantar injeções da U73122 inibidor PLC ou o U73343 composto de controlo. (D) Os ratos têm latências de retirada significativamente mais baixas, enquanto a placa é de arrefecimento após injecção U73122, U73122 sugerindo que interfere com a capacidade de se adaptar a arrefecer temperatura ambiente. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 20. Esta figura foi reproduzida com a autorização da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). A figura não pode ser reproduzido por qualquer outro fim sem permissão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt= &quot;Figure 8&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52640 / 52640fig8.jpg&quot; /&gt; Camundongos Figura 8. TRPM8-KO não se adaptam ao resfriamento ambiental 20 ratos TRPM8-KO têm latências de retirada mais altas do que do tipo selvagem ninhada em todas as temperaturas a partir medidos (2-way ANOVA com teste de Bonferroni post-hoc;. *** P &lt; 0,001). A latência de retirada de camundongos TRPM8-KO também diminui à medida que a temperatura diminui de partida (1-way ANOVA com Bonferroni post-hoc teste; ## p &lt;0,01, ### p &lt;0,001), enquanto não há nenhuma mudança significativa na retirada latência da mesma ninhada de tipo selvagem como as diminuições de temperatura de partida. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 20. Esta figura foi reproduzida com a autorização da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). A figura não pode ser reproduzido por qualquer outro fim sem permissão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, cliquem</a>k aqui para ver uma versão maior desta figura.

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A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K visualizações.  Washington University in St. Louis. The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

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Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

Aparelho novo e Método para Reforço de Drogas

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Neurociência

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended upon this work to develop a simple quantitative measure of forepaw dexterity that is sensitive to lateralized impairments and age-dependent changes. Rodents learn skillful forepaw and digit movements to manage thin pasta pieces, which they eagerly consume. We have previously described methods for quantifying vermicelli handling in rats and showed that the measures are very sensitive to forelimb impairments resulting from unilateral ischemic lesions, middle cerebral artery occlusions and unilateral striatal dopamine depletion [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. &amp; Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods 170, 229-244 (2008)]. Here we present a more detailed protocol for this test in rats and compare it with a newly developed version for mice, the Capellini Handling Test. Rats and mice are videotaped while handling short lengths of uncooked vermicelli or capellini pasta, respectively, with a camera positioned to optimize the view of paw movements. Slow motion video playback allows for the identification of forepaw adjustments, defined as any distinct removal and replacement of the paw, or of any number of digits, on the pasta piece after eating commences. Forepaw adjustments per piece are averaged over trials per each testing session. Repeated testing permits sensitive quantitative analysis of changes in forepaw dexterity over time. Protocols for pre-testing habituation and handling practice, as well as procedures for characterizing atypical handling patterns, are described. Because rats and mice perform the pasta handling tests slightly differently, species-specific differences in administration and scoring of these tests are highlighted. All animal use was in accordance with protocols approved by the University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee.

The Vermicelli and Capellini Handling Tests of forepaw dexterity take advantage of the natural inclination of rodents to manipulate food items using skillful forepaw and digit movements. Animals are videotaped while handling short strands of uncooked dry pasta. Slow motion video playback allows for the quantification of forepaw adjustments.

O Vermicelli e Testes Handling Capellini: Simple medidas quantitativas da função forepaw dexterous em ratos e camundongos

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Um método geral para a avaliação de Incubação de Craving Sacarose em Ratos

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...