The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.

모든 마우스 프로토콜은 건강 지침 국립 연구소에 따라이었고, 의학의 워싱턴 대학의 동물 연구위원회 (세인트 루이스, MO)에 의해 승인되었다. 1. 테스트 판 및 인클로저 준비 <ol><li> 유리 표면을 청소합니다. </li><li> 실험실 테이프로 유리판의 중앙에 표면에 T 형 필라멘트 열전쌍 프로브를 고정. </li><li> 플레이트의 중앙을 따라 한 줄로 유리 접시에 동물 인클로저를 놓습니다. </li><li> 중앙 동물 인클로저를 통해 열전쌍 프로브를 끼 우고 데이터 로거에 연결합니다. 자동 종료 기능을 비활성화하는 동안의 데이터 로거를 켜고 제공된 케이블로 컴퓨터에 데이터 로거를 연결합니다. <ol><li> 실험 기간 동안 판의 온도를 기록하는 경우, 플레이트 온도 기록을 시작하기 위해 데이터 로거 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 필요하다면, 다시 소프트웨어를 조정코드 플레이트 온도 매초마다. </li><li> 열 데이터 로거와 함께 패키지 소프트웨어를 사용하여 온도를 기록 시작합니다. </li></ol></li><li> 마우스 사이의 시각적 상호 작용을 방지하기 위해 검은 삽입 인클로저를 분리합니다. </li><li> 위치는 인클로저의 밑면이 편안한 장착 위치에서 볼 수 있도록 유리 아래에 반영한다. </li></ol> 2. 온난화 / 유리 접시를 냉각 <ol><li> 가온 물에 젖은 얼음, 드라이 아이스 알루미늄 상자를 채우고 유리판 상에 적절하게 위치 (드라이 아이스로 채워진 알루미늄 호일 패킷과 같은 유리를 냉각하기 위해 사용될 수있다;도 1) 2. <ol><li> 30 ° C에서 테스트를 위해, 멀리 동물 인클로저 (그림 2B) 2에서 &#39;약 0.25 알루미늄 상자를 배치합니다. <ol><li> 유리 기판의 양측에 가열 된 물이 순환 장치를 설정한다. 45 서큘 레이터 설정 - 60 ° C가, 우리뜨거운 물 (그림 1C) 2의 꾸준히 알루미늄 상자를 채우기 위해 전자. </li><li> 서큘 레이터의 위치를 같은 알루미늄 상자에서 뜨거운 물이 다시 직접 각면 (그림 1C)에 순환의 저수지에 배수 것을 2. </li></ol></li><li> 실온에서 테스트를 위해 상자를 빈 (그림 2) (2)를 둡니다. </li><li> (그림 2) 17 ° C에서 테스트를 위해, 거리 양쪽에 동물 우리에서 &#39;약 0.25 상자를 놓고 젖은 얼음 채우기 2. </li><li> (그림 2) 12 ° C에서 테스트를 위해, 거리 양쪽에 인클로저에서 &#39;약 1.25 상자를 놓고 드라이 아이스 채우기 2. </li><li> (그림 2) 5 ° C에서 테스트를 위해 약 0.25 &#39;&#39;거리 양쪽에 인클로저에서 상자를 놓고 드라이 아이스 채우기 2.<ol><li> 드라이 아이스와 유리를 냉각 할 때, 방에 이산화탄소 발생을 방지하기 위해 통풍이 있는지 확인하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 원하는 온도 범위에 도달하는 유리 기다립니다. </li><li> 접시에 인클로저에 마우스를 추가합니다. 주 : 백색 잡음 발생기 잡음 교란을 감소하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 마우스 적응 기다립니다. 참고 : 우리 시설에서이 약 2.5 시간이 필요하지만이 동물 하우징 및 취급 조건에 따라 상당히 다를 수 있습니다. </li><li> 상자를 따뜻하게 물, 젖은 얼음 또는 드라이 아이스의 전체 유지하도록하여 원하는 온도 범위에서 유리를 유지한다. 참고 : 우리의 장치와 함께 상자 얼음 대략 매 90 분 리필 할 필요가있다. 주 : 17 ° C 조건의 경우,이 얼음을 보충하기 전에 배수 구멍을 통해 알루미늄 상자에서 대부분의 물을 비우는 것이 도움이된다. 이것은 더 나은 온도, 및 PR을 안정화이벤트 오버 플로우 주 : 드라이 아이스의 정확한 양은 계절에 따라 다르지만, 일반적으로 온도를 일정하게 유지한다 상자의 전체 길이를 따라 완전 이상 박스 ¼ 유지한다. </li></ol> 고정 온도에서 3. 테스트 마우스 <ol><li> 행동 방 밖에서, 드라이 아이스의 전체 절반에 대한 얼음 양동이를 입력합니다. </li><li> 망치 또는 망치를 사용하여 미세 분말로 드라이 아이스를 분쇄. 참고 : 버킷을 너무 가득 채우면하는 것은 어려운 완전히 분말로 드라이 아이스 호감을 만들 것입니다. </li><li> 직선 면도날이나 가위를 사용하여, 3 ML의 주사기를 상단을 잘라. </li><li> 21 G 바늘을 사용하여, 주사기 (6 구멍 전체)에 대향하는 측면 (3) 구멍을 찌를. 주 : 드라이 아이스를 압축하면서이 구멍은 승화에 의해 생성 된 압력이 감소한다. 컷오프 주사기 여러 실험을 위해 재사용 될 수있다. </li><li> 주사기, 드라이 아이스 분말, 및 행동 방에 휴대용 스톱워치를 가져 가라. </li><li> 드라이 아이스 분말의 절반 전체 주사기 챔버를 입력합니다. 평면 객체와 주사기의 절단 끝을 잡고 단단히 플런저를 사용하여 분말을 압축합니다. 주의; 플라스틱 플런저는 구부리거나 압력에서 중단 될 수 있습니다. 이 경우, 새로운 주사기에서 플런저를 교체합니다. </li><li> 주사기의 가장자리를지나 압축 된 드라이 아이스 펠릿의 끝을 확장합니다. </li><li> 휴식을 충분히입니다 테스트 마우스. <ol><li> 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C에서 4 유리에 발 및하지를 테스트 마우스는 이동하지만, 19 완전히 잠이 없습니다. </li><li> 12 ° C 5 ° C에서, 이동하거나 점프 2 발, 4 발과하지에있는 테스트 마우스. </li></ol></li><li> 부드럽게, 타겟팅을 위해 거울을 사용하여 단단히 마우스 뒷발 (그림 1A)이 아래 유리 표면에 평평 펠릿 플러시를 누릅니다. 손으로 타이머를 시작합니다. </li><li> 타이머를 중지하고 마우스가 떨어져 냉각 된 유리에서 이동할 때 펠렛을 제거합니다. 참고 : 철수 운동이 수직 또는 수평이 될 수 있습니다. <ol><li> 마우스가 매우 간략하게 발을 이동 한 후 냉각 표면에 반환하는 경우 마우스가 떨어져 영구적 인 이동을하게 될 때까지, 타이밍과 자극을 계속합니다. 참고 : 우리 연구소는 대부분의 경우에 마우스 20 초 최대 자극 시간을 사용합니다. </li></ol></li><li> 각 동물의 각 발에 3 개 이상의 값을 수집 할 때까지이 테스트 절차를 반복합니다. 적어도 15 분에 의해 단일 ​​발에 적어도 7 분, 별도의 연속 시험하여 동일한 마우스에 반대 발을 테스트 별도의 시험. </li><li> 필요한 경우, 냉각 (그림 3) (1)의 서로 다른 속도를 생성하는 유리의 다른 두께를 사용합니다. 주 : 냉각 속도가 반비례 유리의 두께와 상관된다. </li></ol> 4. 콜드 적응하는 동안 마우스를 테스트 주 :이 작은지면 유리로 테스트 할 수 대체 프로토콜전자는 오히려 판을 안정화하고 마우스가 완전히 추운 환경에 적응 한 번 이상, 냉각시킨다. <ol><li> 장치를 설정하는 제 1 절에 나와있는 지침을 따르십시오. </li><li> RT (그림 7A) 2에서 기준 측정을 수행하기 위해 제 3 절에 나와있는 지침을 따르십시오. </li><li> 드라이 아이스와 알루미늄 상자를 사전 냉각. </li><li> 기준 철수 대기 시간을 측정 한 후, 멀리 인클로저의 양쪽에 접시 약 1.25 &#39;&#39;의 미리 냉각 된 상자의 위치 (그림 7a는, 화살표가 표시된 &quot;드라이 아이스 추가&quot;) 2. </li><li> 유리 접시가 냉각됨에 따라 가능한 한 자주 측정을, 측정을 수행 할 제 3 절에 나와있는 지침을 따르십시오. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and genetic neuron ablation studies26. It can be modified to measure responses to a variety of rates of cooling using different thicknesses of glass, and the size of the cold stimulus applied can be altered using different sized syringes. 
The most critical step for performing this assay properly is cooling or warming the glass plate evenly during testing. Carefully arranging the aluminum boxes so that they are evenly spaced on either side of the animal enclosures will help generate more uniform temperatures. Marking the glass plate to standardize aluminum box placement between experiments will also improve the reproducibility of the assay, although these markings may have to be periodically recalibrated to account for seasonal variations in building temperature.
It can also be challenging to maintain a consistent glass plate temperature over the course of the experiments. Ensuring that the aluminum boxes are always evenly filled with dry ice/wet ice/warmed water will yield experiments with stable plate temperatures. Additionally, under the 17 &#176;C testing condition it may become more difficult to maintain the temperature as the wet ice melts. We recommend draining excess water from the melted ice out of the aluminum boxes before refilling with more wet ice. 
The main limitation is that the mouse paw must be in contact with the glass surface in order to ensure a consistent cold stimulus. This can be an issue in some neuropathic models, such as the chronic constriction injury, which can cause paw curling. Other challenges to obtaining reproducible results with this assay include that the mice must be fully at rest, which requires adequate acclimation periods. If the mice are too active for testing, it may help to allow longer acclimation periods. Finally, groups that are planning to utilize this assay must also ensure that there is sufficient ventilation in the room in order to prevent CO2 buildup when using large amounts of dry ice.

설치류 냉 반응성 측정은 모두 정상 및 병리학 적 조건 하에서 인간 감기 감도의 전위 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것이 중요하다. 콜드 발바닥 분석 (CPA)는 원래 전 1 몇 년이, RT에 전달 차가운 자극에 재현, 모호하지 않은 쥐의 행동 반응을 생성하도록 설계 개발했다. 이러한 분석의보다 최근의 개선이 온도의 넓은 범위에서 감기 감도 측정 재현성있게되었다. 두 버전은 상대적으로 높은 처리량, 사용이 저렴하도록 설계되어 있습니다. 진보는 많은 다른 방법을 이용하여 행동 민감성 감기 메커니즘을 이해에서했다. 하나의 방법은 dabbing 또는 마우스 발에 분사하고 아세톤 마우스 발바닥 3,4 플릭 소비하는 시간의 양을 측정하는 것을 포함 아세톤 증발 시험이다. 불행하게도,아세톤의 증발에 대한 응답은 젖은 감각과 아세톤의 냄새에 의해 혼동된다. 또한, 아세톤 증발 시험에서인가되는 냉 자극을 적용 아세톤의 양을 기준으로 정량화하기 어렵다 변할 수있다. 마지막으로, 손상되지 않은 마우스는 기준선 아세톤 최소한 응답이 불가능이 방법 과민증의 부재 진통을 측정 할 수있다. 차가운 반응에 대한 또 다른 고전적인 분석은 꼬리가 차가운 물 5,6에 침지 한 후 철수 대기 시간을 측정 꼬리 영화 분석이다. 이 분석에서 행동 반응가 명확한 및 분석은 특정 온도에 대한 반응을 측정하는 동안, 동물은 잘 설명 스트레스 유발 진통 메커니즘 (7)를 통해 차가운 응답을 변경할 수있는, 테스트 기간 동안 억제해야합니다. 일반적으로 사용되는 또 다른 도구는 행동을 측정하는 냉각 판 테스트입니다마우스의 응답은 그들이 펠티어 냉각 판 8-10에 배치 된 후. 이 도구는 특정 온도에서 동물의 응답에 대한 정보를 제공하지만, 그것은 또한 일관성없이 사용되어왔다; 상이한 그룹 점프 8,11 수, 제 13 8,11- 응답 대기 시간을 포함한 다른 종류의 반응을 측정하고, 발과의 수는 매우 다른 결과 11,13,14 리프트. 콜드 플레이트 분석은 한번에 시험 할 수 하나만 동물로 비교적 낮은 스루풋이며 비싸고 깨지기 펠티에 소자를 필요로한다. 2 판 온도 환경 시험 동물이 서로 다른 온도 9,15- (17)이 연결 판에 보내는 시간의 상대적인 양을 측정 냉각 판 시험의 일반적으로 사용되는 파생 상품이다. 또 다른 유사한 분석은 일반적으로 사용되는 열 구배 분석 생쥐으로 다른 온도 대에서 보내는 시간의 양긴 금속 접시에 5 ° C와 45 ° C 사이의 범위는 (16)을 측정한다. 이러한 분석은 온도의 비교를 할 수 있지만, 그것은 행동이 온도 회피 또는 온도 취향을 나타내는 지 여부를 명확하지 않다. 마지막으로, 냉각 판 동적 분석은 마우스 (18) 주변의 온도 변화에 어떻게 반응하는지 측정하기 위해 사용되었다. 이 방법은 RT의 펠티어 장치에 마우스를 놓고 마우스 점프 또는 다른 판의 온도에서 자신의 발을 핥고 얼마나 측정하면서 1 ° C로 낮아진다 포함한다. 이 마우스는 냉각 환경에 적응하는 방법을 테스트하는 동안, 마우스는 냉각기 주위 온도의 환경에서 냉 자극에 반응하는 방법을 테스트하기위한 방법을 제공하지 않는다. 또한, 그것을 수행하기 위해 고가의 장비를 필요로하며, 그 감기 감도를 측정하기 전에 테스트 장비에 쥐를 적응 방법을 제공하지 않는다. 이러한 분석을 보완하기 위해, CPA는 ACCLIMA을 테스트다양한 온도 범위에서 잘 정의 냉 자극에 응답 테드 또는 차가운 주변 온도에 적응하는 과정. 그것은 저렴한 비용으로 높은 처리량 테스트를 위해 확장 할 수있는 가능성과 함께, 우리의 현재 장치에 한 번에 14 마우스까지 테스트 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>T-type thermocouple probe</td><td>Physitemp</td><td>IT-24p</td><td>Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td></tr><tr><td>Glass plate</td><td>Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)</td><td></td><td>We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4&#039;&#039;, but 3/16&#039;&#039; and 1/8&#039;&#039; are also useful</td></tr><tr><td>Thermal Data logger</td><td>Extech</td><td>EA15</td><td>Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&amp;amp;prodid=408)</td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td>The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe</td></tr><tr><td>Computer</td><td>If using Extech logger, any Pcwill work</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum boxes</td><td>Washington University in St. Louis machine shop</td><td></td><td>boxes are 3&#039; long, 4.5&#039;&#039; wide, and 3&#039;&#039; tall with a sealed lid.&amp;nbsp; There is a 1/2&#039;&#039; hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.</td></tr><tr><td>Heated water circulator</td><td>VWR</td><td></td><td>Any water circulator model with a pump will work</td></tr><tr><td>21 G needle</td><td>BD</td><td>305165</td><td>The exact needle size is not important</td></tr><tr><td>Hand timer</td><td></td><td></td><td>Any hand timer will work</td></tr><tr><td>Mirror</td><td></td><td></td><td>Any flat mirror will work</td></tr></tbody></table>

a simple and inexpensive method for determining cold sensitivity and adaptation in mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 시작 마우스에서 유발 행동 반응이 높은 재현성 (그림 4A) (20)이다. 뒷발에 따라 발생되는 냉 자극을 측정하기 위하여, 마우스를 케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진 칵테일로 마취하고 그의 발은 T 형 필라멘트 열전대 (도 4b) (20)의 상부에 유리에 고정 하였다. 유리 냉각하거나 원하는 테스트 범위로 가온 하였다. 판은 판 (도 5a) (2)의 길이를 따라 균일하게 냉각되어 있지만, 저온 구배가 동작 인클로저 (도 5B)이 양단에 발생되는 것은 아니다. 중앙부가 약간 따뜻 (도 5b)을 2 동안 인클로저의 양쪽에 드라이 아이스에 가까운 인클로저 부분은 냉각기이다. 가장 추운 온도에서 유SED, 마우스는 인클로저의 중앙 부분에서 대부분의 시간을 보낸다. 유리판 온도를 안정화 한 후 드라이 아이스 국소 자극이 발 / thermode 유리 아래에 배치 하였다. 이 설정에서 기록 된 온도 추적에 기초하여, CPA를 사용하여 생성 냉 자극이 각 온도 범위 (도 4C) 20 재현성 높은 것을 알 수있다. CPA 생성 냉 자극은 또한 냉각 (도 3)의 강도를 변화 시키도록 유리의 세 가지 다른 두께를 사용하여 측정 하였다. 냉각 속도는 반대로 유리의 두께와 관련되며, 이들의 두께는 임의의 (도 3) 필요에 따라 냉간 감도를 측정하는데 사용될 수있다. 이전 작업은 CPA가 마우스에서 진통과 과민 반응을 감지 할 수있는 것으로 나타났습니다. 모르핀의 1.5 ㎎ / kg의 피하 주사 후 30 분, 마우스는 크게 리터가생리 식염수를 피하 주사를 놓은 쥐보다 철수 onger 대기 시간 (그림 6A : 페로 니 사후 테스트와 ANOVA 주요 효과 *의 P &lt;0.05 2 웨이 30 분 ** P &lt;0.01; 그룹 당 n = 12) 1. 모르핀 / 식염수 후 60 분으로, 마우스에서 모르핀 대사의 속도와 일치 모르핀과 생리 식염수가 주입 된 그룹간에 차이가 없다. 완전 프로 인트 보조제 (CFA)을 주입 이전에 21 뒷발 후 염증 및 과민 반응을 야기하는 것으로 나타났다. ** P &lt;0.01를 2 시간의 *의 P &lt;0.05, 3 시간, 페로 니 사후 테스트 2 일원 분산 분석의 주요 효과 P &lt;0.001 : CFA 주사 후, CPA 탈퇴 대기 시간 (그림 6B 2, 3 시간 주입 후 감소 N = 12 그룹 별). 4 시간 CFA 주입 한 후, 마우스는 1.5 ㎎ / ㎏ 모르핀의 피하 주사를 부여했다. 모르핀 주입, CFA- 식염수 주입 된 마우스는 모두 증가 하였다 withdr 후 30 분간아왈이 3 시간에서 자신의 대기 시간을 기준으로 대기 시간 (그림 6B : 던넷 사후 검사 1 일원 분산 분석, CFA 4.5 시간의 $$$의 P &lt;0.001, 생리 식염수 4.5 시간 대 3 시간 대 CFA 3 시간 $$$ p &lt;0.001). 모르핀이 대사되었다 일단 시간 후에, CFA 주입 된 쥐가 다시 한 번 생리 식염수 주입 제어 마우스보다 낮은 철수 대기 시간이 있었다 (그림 6B : 2 웨이 페로 니 사후 테스트와 ANOVA ** P &lt;0.01) 1. 대부분의 포유 동물 종은 그들의 환경에 맞게 자신의 온도 감도를 적응할 수있는 능력을 가지고있다. 시험관 연구가이 적응 과정이 PIP이 가수 분해 22- 24에 의존하지만, 이전의 행동 도구는 생체 내에서이 가설을 검증 할 수 없습니다 것을 제안했다.을 CPA는 두 가지 방법이 적응을 정량화 할 수있다. 유리가 냉각됨에 따라 마우스의 철수 대기 시간을 테스트하여 ( <stro는 2 일이 같은 NG&gt;도 7a, C)는 CPA는 추위 적응을 측정 할 수 있습니다. 0 분 12.13 ± 0.8 초, 30 분 = 12.1 ± 1.6 초, 60 분 = 13.2 = : 접시는 추위 적응 CPA (그림 7B로 정량화 할 수있는 것보다 더 빨리 발생한다는 것을 시사 냉각됨에 따라 정상적인 조건에서 철수 대기 시간은 변경되지 않습니다 , 페로 니 사후 테스트 P&gt; 0.05과 1.1 초, 90 분 = 10.8 ± 1.2 초 1 일원 분산 분석을 ± N = 6) 2. 마우스가 판 전에 포스-C 억제제 U73122 (25)의 주사 intraplantar 주어진다 때, 손상 발생에 대한 적응을 제안, 철수 대기 시간이 감소된다 (그림 7C) 냉각된다 (그림 7D : 기본 = 11.29 ± 0.53 초, 30 분 = 던넷 사후 테스트, 주요 효과 P = 0.02, 개별 기준 대비 30 분의 P = 0.02 1 일원 분산 분석, N = 9), 8.09 ± 1.17 초. CPA는 AB를 측정 할 수 있습니다ility은 장시간 차가운 주변 온도에 적응. 야생형 마우스를 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 3 시간 동안 순응 후 CPA를 사용하여 시험하는 경우 금단 지연 시사 동일한 전혀 개시 온도하다 야생형 WT 30 ° C = 13.23 ± 0.5 초, 23 ° C = 12.8 ± 0.7 초, 17 ° C = 12.3 ± 0.9 초, 12 ° C = 12.8 ± 0.5 초, 1 : 마우스는 추운 주변 온도 (그림 2A 적응 페로 니 사후 테스트, P&gt; 0.05 N = 6 ~ 30 ° C에있어서, n =와 일원 분산 분석 (15) 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C) 20. 개시 온도는 TRPM8-KO 마우스의 금단 대기 시간을 감소 할 야생형 마우스와는 달리, (도 그들의 환경에 맞게 자신의 응답 임계 값을 적용 할 수없는 것을 시사 감소 8 : 1 웨이 반복 측정 ANOVA 페로 니의 포스트와 특별 검사는 메인 효과 P = 1.5 × 10 수컷-5 대 12 ° C의. 23 ° C의 P = 6 × 10-5, 17 ° C 대 23 ° C 형 P = 0.004; 여성의 주요 효과 P = 3.6 × 10 -5, 12 ° C 대 23 ° C 형 P = 9.25 × 10 -5, 17 ° C 대 23 ° C의 P = 0.0005; DF = 1, N = 11 명의 남성과 11 명의 여성) (20). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig1.jpg" /> CPA를 수행하기위한 그림 1. 콜드 발바닥 분석 (CPA) 장치 (2). (A) 도식. 그들이 쉴 때까지 마우스는 플라스틱 행동 인클로저에 유리 접시에 적응하고 있습니다. 드라이 아이스 펠렛 뒷발 아래 유리의 하측에인가되고,이 지연 측정된다 냉각 유리에서 철수. 구성의 CPA 장치 (B) 그림, 판 5 ° C의 온도를 식혀줍니다. 열 데이터 로거는 인클로저의 중심에및 알루미늄 박스는 양쪽 측면에 격납. 구성의 CPA 장치 (C) 그림, 30 ° C로 판을 따뜻하게합니다. 물 순환은 다시 서큘 레이터의 탱크로 드레인 측을 흘러 알루미늄 상자로 온수를 유동한다. 브레너 등. 2014이 허가 재사용. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig2.jpg" /> 도 2 CPA. (A) 중에 유리판 (2)의 온도는 CPA의 행동 실험 중에 유리판의 온도를 트레이싱 &#39;평균. 30 ° C, N = 1, 23 ° C, N = 5, 17 ° C, N = 7, 12 ° C, N = 7, 4 ° C, N = 5 (B) 도식 다이어그램 민주 공화국CPA의 서로 다른 온도 조건을 생성하는 방법을 onstrating. 브레너 등. 2014이 허가 재사용. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig3.jpg" /> 도 3은 유리의 두께에 반비례 한 냉각 속도와 관련된다. (A) 도식 실험 설계 (BD)를 다이어그램. 발 발바닥 밑 냉 자극시 온도가 정상적인 조건 세 유리 두께를 측정 한 후, 스티로폼 스페이서 멀리 유리 표면으로부터 발을 지탱. 모든 경우에, 멀리 유리에서 발을 지탱하는 발 측정 냉 자극 (N = 6 유리 두께 당)의 급격한 감소를 일으켰다. ( <strong&gt; E) 발 아래 온도는 스티로폼으로 누워 발을 하그리브스 복사열 자극하는 동안 측정 하였다. 발이 떨어져 유리 내놓고​​ 때 감기 발바닥 분석 달리 하그리브스 분석에서 열 자극이 크게 변하지이다 (N = 6). 브레너 등. 2012 일 허가를 재사용하는 것은 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig4.jpg" /> 그림 4. CPA 탈퇴 대기 시간이 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 시작 쥐 20. (A) 평균 철수 대기 시간이 일치한다. (B) 구성 CPA에게 차가운 자극을 측정합니다. 마취 된 쥐의 발은 위에 실험실 테이프로 유리판에 고정되고T 형 필라멘트 열전대. CPA 자극은 발과 열전대 모두 아래에있는 유리의 아래쪽에 배치됩니다. (C) 온도는 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 시작하는 CPA에서 발생. 검은 색 화살표는 각 조건에서 깨어 마우스의 평균 철수 대기 시간을 나타냅니다. 브레너 등의 허가를 재사용. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig5.jpg" /> 도 5 유리판 온도는 플레이트의 중앙에 위치 된 CPA이. (A) 열전대 T1 (블랙)에 일치한다. 열전대 T2 (적색)은 판의 오른쪽 가장자리에 가까운 행동 케이스에 넣었다. 온도 TRAcings과 오른쪽 (T1-T2)의 그래프는 실험의 과정을 통해 T1과 T2에서 거의 동일한 온도를 보여줍니다. (B) 열전대 (T1) (검정색)를 플레이트의 중앙에 위치시켰다. 열전대 T2 (적색)를 드라이 아이스로 채워진 알루미늄 상자에 가까운 벽, 중앙 행동 인클로저에 넣었다. 온도 트레이싱 및 오른쪽 (T1-T2)에서의 그래프는 플레이트가 안정된 온도에 도달하면 (T1 및 T2) 사이에 대략 12 ° C의 차이가 있음을 보여준다. 브레너 등의 허가를 재사용. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig6.jpg" /> 그림 6. CPA는 진통제와 과민 한을 측정 할 수있다. (A) (S)를1.5 mg을 ubcutaneous 주입 / kg 모르핀 30 분 주사 후 마우스의 철수 대기 시간 증가 (페로 니 사후 테스트 2 일원 분산 분석을 30 분 후 주입 ** P &lt;0.01). 주사 60 분 후 모르핀 주입 식염수 주입 된 마우스 사이에 유의 한 차이가 없다. (페로 니 사후 테스트 2 일원 분산 분석 * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01) (B) (10) UL의 Intraplantar 주입 완료 프로 인트 보조제 (CFA)는 마우스 2, 3 시간 포스트 분사의 철수 대기 시간을 감소시킵니다. 모든 마우스는 4 시간에서 모르핀의 피하 주사를 부여하고, 4.5 시간에서 모두 철수 대기 시간이 3 시간에 비해 유의하게 높았다 (Dunnet의 사후 테스트 1 일원 분산 분석, $$$ P &lt;0.001). (페로 니 사후 테스트 2 일원 분산 분석 ** p &lt;0.01), CFA의 주입 (모르핀 주사 후 1.5 시간) 후 5.5 시간은, CFA 주입 마우스는 여전히 식염수 주입 쥐보다 낮은 철수 대기 시간이 있었다. 허가를 재사용브레너 등. 2012 일. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig7.jpg" /> 유리판 (20)을 동적으로 냉각됨에 냉 적응 측정도 7. 유리판으로 CPA를 수행하는 (A) 회로도 냉각된다. 기준 온도는 드라이 아이스 컨테이너 플레이트에 첨가하고, RT로 측정하며, 유리판이 냉각됨에 움츠림 레이턴시를 측정한다. 유리 플레이트가 냉각됨에 따라 (B) 야생형 마우스들은 CPA (기준선 측정 될 수있는 것보다 더 빠르게 냉각 온도에 적응할 것을 시사 동일한 탈퇴 레이턴시가 = 12.8 ± 0.3 초, 30 분 = 13.67 ± 0.9 초, 60 분 = 11.03 ± 1.0 초, 90 분 = 11.31 ± 0.6 초, N = 3 생쥐; 페로 니 사후 테스트, 어떤 그룹 사이에 유의 한 차이) 1 일원 분산 분석. 유리판으로 CPA를 행하는 계통도 (C)는 PLC 억제제 인 U73122 또는 제어 화합물 U73343 intraplantar의 주사 후, 냉각된다. 플레이트 U73122 주입 후 냉각하면서 (D) 쥐 U73122 주위 온도에서 냉각에 적응하는 능력을 방해하는 것을 시사 금단 상당히 낮은 레이턴시를 갖는다. 브레너 등. 2014 (20)으로부터 허가를 재사용. 이 그림은 고통의 연구에 대한 국제 교류 협회 (IASP)의 허가를 재현 할 수 있습니다. 그림은 허가없이 다른 목적으로 복제 할 수 없습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt= &quot;그림 8&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52640 / 52640fig8.jpg&quot;/&gt; 그림 8. TRPM8-KO 마우스는 환경 (20) 냉각에 적응하지 TRPM8-KO 마우스는 페로 니 사후 테스트 (2 일원 분산 분석 측정 모든 시작의 온도에서 야생형 한배 새끼보다 더 높은 탈퇴 대기 시간을 갖는다. *** p &lt; 0.001). TRPM8-KO 마우스의 움츠림 잠복 또한 개시 온도가 감소함에 따라 감소한다 (본 페로 니 사후 시험 1 웨이 ANOVA; ## p &lt;0.01 ### p &lt;0.001), 출금에는 큰 변화가 없으나 시작 온도 감소 등의 야생형 한배 새끼의 대기 시간. 브레너 등. 2014 (20)으로부터 허가를 재사용. 이 그림은 고통의 연구에 대한 국제 교류 협회 (IASP)의 허가를 재현 할 수 있습니다. 그림은 허가없이 다른 목적으로 복제 할 수 없습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig8large.jpg" target="_blank">CLIC하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 케이.

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A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K 조회수.  Washington University in St. Louis. The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

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Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected with aging and is a strong predictor of neurodegenerative diseases. Thus, olfaction testing is used as a non-invasive diagnostic method to detect neurological deficits early on. In order to understand the mechanisms underlying olfactory network susceptibility, olfactory research in rodents has gained momentum in the past decade.
Here, we present a very simple, time efficient and reproducible olfactory testing method of innate odor perception and sensitivity in mice without the need of any prior food or water restriction. The tests are performed in a familiar environment to the mice, require only the scents and a 2 min session of odorant exposure. The analysis is performed, post-hoc, using computer-assisted commands on ImageJ and can be, therefore, carried out from start to end by one researcher.
This protocol does not require any special hardware or setup and is indicated for any laboratory interested in testing olfactory perception and sensitivity.

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

간단하고 컴퓨터 지원 마우스에 대한 후각 테스트를

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

연구

행동분석학

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

마우스에 현지 아나필락시스 측정

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

면역학 및 감염병학

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

신경과학

Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as photophobia. Whilst it is impossible to confirm that a mouse is experiencing migraine, light aversion can be used as a behavioral surrogate for the migraine symptom of photophobia. To test for light aversion, we utilize the light/dark assay to measure the time mice freely choose to spend in either a light or dark environment. The assay has been refined by introducing two critical modifications: pre-exposures to the chamber prior to running the test procedure and adjustable chamber lighting, permitting the use of a range of light intensities from 55 lux to 27,000 lux. Because the choice to spend more time in the dark is also indicative of anxiety, we also utilize a light-independent anxiety test, the open field assay, to distinguish anxiety from light-aversive behavior. Here, we describe a modified test paradigm for the light/dark and open field assays. The application of these assays is described for intraperitoneal injection of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in two mouse strains and for optogenetic brain stimulation studies.

Rodents are not able to report migraine symptoms. Here, we describe a manageable test paradigm (light/dark and open field assays) to measure light aversion, one of the most common and bothersome symptoms in patients with migraines.

마우스에서 가벼운 혐오감을 이용한 편두통과 같은 행동 조사

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as ...

Measuring Skeletal Muscle Thermogenesis in Mice and Rats

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. Surprisingly little evidence is available to link the neural, myocellular, and molecular mechanisms of thermogenesis directly to measurable changes in muscle temperature. This paper describes a method in which temperature transponders are utilized to retrieve direct measurements of mouse and rat skeletal muscle temperature.
Remote transponders are surgically implanted within the muscle of mice and rats, and the animals are given time to recover. Mice and rats must then be repeatedly habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage. Muscle temperature can also be measured during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed) to factor out changes in activity as contributors to the changes in muscle temperature induced by these stimuli.
This method has been successfully used to elucidate mechanisms underlying muscle thermogenic control at the level of the brain, sympathetic nervous system, and skeletal muscle. Provided are demonstrations of this success using predator odor (PO; ferret odor) as a contextual stimulus and injections of oxytocin (Oxt) as a pharmacological stimulus, where predator odor induces muscle thermogenesis, and Oxt suppresses muscle temperature. Thus, these datasets display the efficacy of this method in detecting rapid changes in muscle temperature.

Mice and rats are surgically implanted with remote temperature transponders and then habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage or during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed).

마우스와 쥐의 골격근 열발생 측정

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. ...

Urokinase-type Plasminogen Activator-induced Mouse Back Pain Model

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid induction of a persisting back pain model in mice are provided here using an injection of urokinase-type plasminogen activator (urokinase), a serine protease present in humans and other animals. The methodology for induction of persisting lower back pain in mice involves a simple injection of urokinase along the ligamentous insertion region of the lumbar spine. The urokinase inflammatory agent activates plasminogen to plasmin. Typically, the model can be induced within 10 min and hypersensitivity persists for at least 8 weeks.
Hypersensitivity, gait disturbance, and other standard anxiety- and depression-like measures can be tested in the persisting model.&#160;Back pain is the most prevalent type of pain. To improve awareness of back pain, the International Association for the Study of Pain (IASP) named 2021 the &#34;Global Year about Back Pain&#34; and 2022 the &#34;Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice.&#34; One limitation of the therapeutic advancement of pain therapeutics is the lack of suitable models for testing persistent and chronic pain. The&#160;features of this model&#160;are suitable for testing potential therapeutics aimed at the reduction of back pain and its ancillary characteristics, contributing to IASP&#39;s naming 2022 as the Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice.

Methods for simple, rapid induction of a back pain model in mice are provided here using an intraligament injection of urinary plasminogen activator.

우로키나아제(Urokinase)형 플라스미노겐 활성제(Plasminogen Activator)에 의한 생쥐 요통 모델

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid ...

갈색 지방 조직에서의 대사산물 교환 탐구

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

저자 스포트라이트: 지방 조직 대사 및 질병 예방을 위한 새로운 길 조명(Illuminating New Avenues for Adipose Tissue Metabolism and Disease Prevention) 

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

갈색 지방 조직에서 생체 내 대사산물 교환을 측정하기 위한 동정맥 대사체학

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

생화학

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

콜드 통각에 대한 소설 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

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