Gostaríamos de agradecer a Scott Hamilton, e membros do laboratório O&#39;Halloran para a leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também o nosso revisor anônimo pelos excelentes sugestões e comentários perspicazes.

1. Construção de GFP Tagged EGL-4 Animais Expressando <ol><li> Clonar o traducional fusão GFP :: EGL-4 sob o promotor para o gene odr-3 (2678 pb utilização directamente a montante do codão de iniciação): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. A expressão ODR-3 unidades promotoras nos pares de neurônios amphid: AWA, AWB; AWC, e fracamente em ASH. </li><li> Injectar o plasmídeo (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 do tipo selvagem (em N2) animais aos 50 ng / ul com os marcadores de co-injecção, utilizando técnicas padrão de transformação de linha de germe 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / uL), e (p) odr-1 :: DsRed 10 (25 ng / ul). O promotor odr-1 expressão unidades no AWC e pares AWB amphid neurônio, eo ofm-1 promotor expressão unidades nos coelomocytes. </li><li> Submeter os animais transgénicos que expressam os arrays extracromossómicos detalhados no Passo 1.2 para a Ultra Violeta (UV) / trimetilpsoraleno (TMP) protocolo de integração11. </li><li> Bleach sincronizar os 12 animais e cultivá-las em Nematóides de crescimento Media (NGM) placas contendo OP50 E. coli para a fase de L4. Lave L4 animais fora das placas NGM com tampão M9 para remover OP50 E. coli. </li><li> Remover o tampão M9 e adicionar 50-100 ul de 30 ug / ml de solução de trabalho de TMP para o sem-fim pellet no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Enrole a 1,5 ml em tubos de microcentrífuga de folha para bloquear a luz ambiente, e agitar suavemente num agitador rotativo durante 15 min na folha embrulhado tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfira os vermes na solução de TMP / worm para uma placa NGM grande unseeded. </li><li> Expor os vermes na placa NGM de UV 350 μJ (X100), utilizando um Stratalinker 2400. Em seguida, adicionar a uma placa de vermes NGM contendo OP50 e incubar no escuro durante 5 horas. </li><li> Escolha 50 vermes transgênicos para cerca de 10 placas semeadas (2-5 vermes cada placa). Transferência P0 é a placas novas a cada 24 horas durante 3 dias. </li><li> Escolha 250 F1 clonal umnimals (1 animal por placa). Clonar animais F2 2-4 fora de cada placa F1. Verifique animais F3 para procurar uma linha de transmissão de 100% olhando (p) ofm-1 :: GFP padrão de expressão sob um microscópio de dissecação fluorescente. </li><li> Outcross a linha final integrado (s) com os animais de tipo selvagem N2 5 vezes. Vamos remeter para a linha final integrada como pyIs500, eo GFP-tagged EGL-4 molécula como GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. Cultivo e Manutenção de Animais para Ensaios translocação nuclear <ol><li> Cultivar as pyIs500 animais a 25 ° C em placas de 10 cm padrão NGM (ver abaixo para receita) semeado com E. OP50 coli 13 (Figura 1). </li><li> No dia 1, escolher 4-5 L4 pyIs500 animais de placas cultivadas a 25 ° C para cinco separados 10 centímetros OP50 E. coli semeadas placas e incubar a 25 ° C (isto é, L4 4-5 animais por placa). </li><li> No dia 4, lavar adulto populations de pyIs500 animais fora das placas NGM grandes usando S-Basal tampão (veja abaixo a receita). Usar pipetas de vidro descartáveis ​​para transferência dos animais, como eles vão ficar ao lado de ponteiras plásticas. </li></ol> 3. Longo prazo Odor Induzida nucleares ensaios de translocação <ol><li> Lavar os pyIs500 animais 3 vezes em S-Basal para remover as bactérias. Não centrifugar animais entre as lavagens, mas sim que os animais possam resolver por gravidade em um tubo de microcentrífuga estacionário de 1,5 ml. É crítico para assegurar que todas as bactérias é removido, e que pates NGM estão livres de contaminação, como bactérias residuais irá afectar negativamente o resultado do ensaio de translocação. Além disso, descobrimos que a autoclavagem os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga produz uma propriedade &quot;pegajosa&quot; nas paredes interiores do tubo que faz com que animais de ficar para os lados, e assim usar não autoclavados 1,5 microtubos ml. </li><li> Enquanto os animais estão se instalando entre as lavagens, fazer-se tele adaptação solução. Adicionam-se 100 ml de S-tampão basal para se formar um cilindro de 100 ml. Adicionar adaptando odor para o S-basal e selar o cilindro usando uma tira de Parafilm. Se se realizarem adaptação benzaldeído adicionar 7,5 ul de benzaldeído em 100 ml de S-basal, para adaptação butanona adicionar 11 ul de 2-butaone a 100 ml de S-basal. Inverta suavemente (não agite) o cilindro de se formar contendo S basais e odor 30 vezes para criar uma emulsão uniforme. </li><li> Após a lavagem final de S-basal, que os animais possam assentar e remover todo o líquido. Rotular um tubo &quot;+ ve&quot; ou &quot;adaptar&quot; e o outro tubo &quot;ve-&quot; ou &quot;unadapt&quot;. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura de adaptação ao tubo de microcentrífuga de adaptação (+ ve) e adicionar 1 ml de S-Basal ao tubo de microcentrífuga unadapted controle (-ve). Tente para manter o número de animais entre 100 e 200 em cada um dos tubos. Com alguma prática, é possível estimar a quantidade aproximada de animais de um pellet por olho. </li><li> Coloque um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga tampa protetoraa cada tubo (impede as tampas de abertura de estalo) e colocar os tubos num rotor durante 80 min. Nós descobrimos que a exposição odor entre 60 min e 80 min produz resultados semelhantes (ambos resultam em respostas de adaptação a longo prazo). No entanto, 80 minutos de exposição fornece resultados mais consistentes em nossas mãos. Assim, todos os nossos ensaios a longo prazo são padronizados de adaptação usando uma exposição de 80 min odor (fig. 2). </li><li> Após 80 min, lava-se 3 vezes em animais de S-basal. Permitir que os animais se contentar por gravidade entre cada lavagem. </li></ol> 4. Curto prazo Odor-nucleares induzidas ensaios de translocação <ol><li> No caso de curto-prazo adaptação odor, usar o mesmo protocolo como a longo prazo por ensaios de translocação odor induzidas (Passos 3,1-3,4), no entanto, em vez de incubação dos animais na adaptação pyIs500 odor por 80 min, utilizar uma exposição de 30 min . A quantificação do odor induzidas ensaios de translocação nuclear descritas abaixo (Passo 5) é o mesmo para a longo prazo e curto-tuloexposições m. </li></ol> 5. Marcando o Odor induzido evento de translocação nuclear <ol><li> Fazer almofadas de agarose a 2% contendo 5 mM de azida de sódio (NaN3) por dissolução de electroforese em gel de agarose em dH 2 0. Colocar uma única gota de agarose fundida contendo NaN 3 em uma lâmina de vidro de microscópio. Colocar imediatamente uma outra lâmina de microscópio de vidro sobre a primeira lâmina para achatar a gota de agarose fundida. Deixar durante 30 segundos, e então suavemente desmembrar o microscópio desliza deixando uma lâmina de microscópio com uma almofada de agarose plana de ~ 1 mm. </li><li> Após a lavagem final de S-basal, permitir que os vermes se estabelecer no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover todo o líquido. Em seguida, adicione os animais gota a gota sobre as almofadas de agarose de várias lâminas de microscópio. É importante manter o número de animais por slide para entre 50 e 100. Muitos animais por slide irá complicar pontuação e muitas vezes criar um brilho dispersando depois azul-luz de excitação. O excesso de líquido podeser mau a partir do bloco de agarose através de um pequeno Kim-wipe. Colocar um vidro de 0,5 milímetros tampa deslize para a almofada e deixar em repouso durante 2 min para permitir a NaN 3 a imobilizar os animais. Nota, os animais podem ser recuperados a partir das lâminas, depois de pontuação. Os animais recuperar da anestesia depois NaN 3 ~ h 1 se transferido para uma placa de NGM semeado em uma gota de tampão M9. </li><li> Neste ponto, é imperativo que cada experimentador conceber uma chave para controlar quais slide é o slide (+ ve) experimental e que deslizam é ​​o controle (-ve) slide, e passar os slides para outra pessoa que irá cegamente marcar o GFP: EGL-4 padrão de localização. Isto vai controlar a qualquer enviesamento experimentador. </li><li> Pontuação entre 50 e 100 animais por slide usando um microscópio vertical fluorescente com objetivos de ampliação de 10x, 40x e 63X e GFP / RFP filtros. Em primeiro lugar, localizar animais com a ampliação de 10X usando brilhante-campo de iluminação. Em segundo lugar, localizar o neurônio AWC desligando o bright-campo de iluminação e de utilização do filtro de RFP. Os (p) odr-1 :: unidades DsRed expressão em AWB e neurônios AWC. Os neurónios têm AWC distintivas ovais em forma de corpos celulares, em comparação com os corpos celulares AWB que são mais pequenos e de forma circular (Figura 2). </li><li> Uma vez que o corpo celular AWC foi localizado, mude para o filtro GFP e registrar a localização de GFP: EGL-4 como nuclear ou citoplasmática. Usando um contador permite o experimentador para manter olhando para o ocular ao marcar o slide. Nota: 5,1-5,5 passos são repetidos pelo menos 3 vezes em dias diferentes para produzir resultados estatisticamente significativos (Figuras 1-2). </li></ol> 6. Monitoramento GFP-tagged EGL-4 durante a recuperação de adaptação a longo prazo Odor <ol><li> Após o passo 3.5, dividir as populações de animais pyIs500 em alíquotas múltiplas e pontuação para GFP nuclear contra citoplasmática :: EGL-4 no CTA no ponto zero de tempo (isto é, após 80 min de exposição) e mpontos ultiple subsequentes de tempo (Figura 3). </li><li> Transferir tanto o controlo (-ve) e experimental (+ ve) animais usando pipetas de vidro descartáveis ​​em placas NGM. </li><li> Permitir que os animais recuperassem durante vários períodos de tempo e re-examinar a localização de GFP :: EGL-4in AWC em cada ponto de tempo como nos Passos 5,1-5,5. </li></ol> 7. Materiais Placas NGM: Para adicionar a 1 L 1 L DDH 2 0: 21 g de Bacto-Agar, 3 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,5 g de Bacto-peptona. Mídia autoclave. Depois de agar autoclavagem, o frio até a temperatura lê 54 ° C. Adicionar as soluções seguintes: 25 ml de tampão de fosfato de potássio 1M; 1 ml 1 M de sulfato de magnésio (MgSO 4), 1 ml de cloreto de cálcio 1 M (CaCl 2), 1 ml de colesterol em etanol (5 estoque mg / ml). 1 M Dibásico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Por 500 ml: Em 400 ml de DDQ 2 O, dissolver 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Ajuste o volume para 500 L com DDH 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter. Monobásico 1 M KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Para 1 litro: Em 800 ml de DDQ 2 O, dissolver 136,1 g monobásico KH 2 PO 4. Ajustar o volume a 1 litro com DDQ 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter. 1 M fosfato de potássio (K 3 PO 4), pH 6,0, tampão: Para 1 litro: Em uma unidade estéril de 1 L Filtro, adicionar 868 ml de 1 M monobásico KH 2 PO 4. Permita que a unidade para filtrar, em seguida, adicionar 132 ml de 1 M Dibásico K 2 HPO 4. Permita que a unidade para filtrar todo o líquido. Remover unidade de filtro e ajustar o pH a 6,0. Armazenar à temperatura ambiente. S-basal: para 1 L: adicione 50 ml 1M K 3 PO 4 Buffer, pH ~ 6,0 e 20 ml de NaCl 5M aq. Encha até 1 L comDDH 2 O. Autoclavar Solution. M9: Para 1 litro: 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O. Encha até 1 L com DDQ 2 0. Esterilizar em autoclave.

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. 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Não há conflitos de interesse declarados.

A entrada odor induzida nuclear de um GFP-tagged EGL-4 molécula aqui descrita proporciona uma leitura robusto molecular de adaptação olfactiva em C. elegans. O odor induzidas ensaios de translocação nuclear são simples e requerem apenas alguns dias de tempo de preparação. O animal pyIs500 que construímos para estes ensaios, expressa um marcador, que ilumina o neurónio AWC, bem como a expressão da GFP-tagged proteína EGL-4. Assim, sentimos que um experimentador com pouca ou nenhuma experiência de trabalho com esta classe de neurônio pode muito rapidamente (talvez depois de analisar uma dúzia de animais poucos) começam a se sentir confortável identificação da célula correta e pontuação para nuclear contra citoplasmática EGL-4. Pode ser útil para o leitor consulte Jove artigo 835 que descreve a análise da GFP em C. elegans 15. Para garantir que os dados gerados é da mais alta qualidade, sugerimos as seguintes diretrizes:1) Todos os resultados deve ser feito às cegas, 2) placas de cultivo contendo qualquer traço de contaminação (fungos ou bactérias) não pode ser utilizado; 3) vermes que a fome experiente durante o cultivo nunca devem ser utilizadas e 4) misturas de adaptação deve ser feita no dia da experimentação. Todos os sistemas sensoriais apresentam exemplos de plasticidade neuronal. A transmissão de sinais para o núcleo é uma característica altamente conservada de formas estáveis ​​de plasticidade neuronal 16. Através do desenvolvimento de uma leitura molecular de plasticidade olfactiva que representa uma translocação nuclear de um PKG em neurónios estimulados, proporcionar uma plataforma de dissecção rápida e detalhada da plasticidade neuronal dentro de um modelo in vivo. Usando a nossa leitura molecular da adaptação olfativa começamos a descrever alguns dos eventos que moldam adaptação olfativa em C. elegans 5,6,7. No entanto, isto é apenas um começo, e ao estudar esse processo como uma função de umge, sexo, infecção ou dieta que podem revelar importantes temas da plasticidade neuronal no circuito e nível de sistemas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptona </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Fosfato de Potássio Dibásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Kimwipes - Pequeno </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% </td><td> Escudo de ouro QuímicaCo. </td><td> 43196-115 </td><td> odores diluição para os ensaios de quimiotaxia </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Sulfato de Magnésio </td><td> Biomedicals MP </td><td> 150136-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Azida de sódio 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestésico </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarose almofadas </td></tr><tr><td> Benzaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Butanona, ACS grau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Microtubos - 1,5 ml coloridas </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur 5-3/4 copo descartável &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> Integração UV </td></tr><tr><td> Garrafa de vácuo Filter - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

Durante a estimulação sustentada neurónios sensoriais mais irá adaptar a sua resposta, diminuindo a sua sensibilidade ao sinal. A resposta de adaptação ajuda a atenção forma e também protege as células de mais de estimulação. Adaptação no circuito olfativo de C. elegans foi descrita pela primeira vez por Colbert e Bargmann 1,2. Aqui, os autores definiram parâmetros do paradigma adaptação olfativa, que eles usaram para projetar uma tela de genética para isolar mutantes defectivos na sua capacidade de adaptação a odores voláteis sentidas pelas células Asa Amphid tipo C (AWC) neurônios sensoriais. Quando wildtype C. elegans animais são expostos a um odor atraente sentiu-AWC 3 para 30 min irão adaptar a sua capacidade de resposta ao odor e ignorará o odor a adaptar de um ensaio de quimiotaxia de comportamento de ~ 1 hora. Quando wildtype C. elegans animais estão expostos a um odor AWC-sentia atraente para ~ 1 hora então eles vão ignorar o odor adaptação em achemotaxis ensaio comportamental para ~ 3 hr. Estas duas fases de adaptação olfativa em C. elegans foram descritos como de curto prazo de adaptação olfactiva (induzida após 30 min de exposição odor), e a longo prazo de adaptação olfactiva (induzida após 60 min de exposição odor). Mais tarde, o trabalho de L&#39;Etoile et al., 4 descoberto uma proteína quinase G (PKG) chamado EGL-4 que é necessário tanto para a adaptação a curto prazo e de longo prazo em neurônios olfativos AWC. A EGL-4 proteína contém uma sequência de localização nuclear que é necessário para respostas a longo prazo de adaptação olfativa, mas dispensáveis ​​para respostas de curto prazo de adaptação olfativa no 4 AWC. Ao marcar EGL-4 com uma proteína verde fluorescente, foi possível visualizar a localização da EGL-4 no AWC durante a exposição prolongada odor. Usando esta totalmente funcional GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula temos sido capazes de desenvolver um visor molecular de adaptação a longo prazo no olfactory 5 AWC. Usando este mleitura olecular de adaptação olfactiva temos sido capazes de realizar as duas telas para a frente e reverso genéticos para identificar os animais mutantes que exibem padrões defeituosos localização subcelular de GFP :: EGL-4 em 6,7 a AWC. Aqui descrevemos a: 1) a construção de GFP :: EGL-4 animais que expressam, 2) o protocolo para o cultivo de animais para os ensaios a longo prazo de translocação induzida odor nuclear, e 3) a pontuação do odor a longo prazo induzida evento de translocação nuclear e recuperação (re-sensibilização) da GFP nuclear :: EGL-4 estado.

Um exemplo do padrão de localização da GFP :: EGL-4in a CTA, antes e após exposição prolongada odor é mostrado na Figura 2. Antes da exposição prolongada odor, GFP :: EGL-4 está localizada no citosol da CTA (Figura 2B), e após 80 min de exposição odor GFP :: EGL-4 é localizada para o núcleo da CTA (Figura 2D). No nível comportamental, os animais com citosólica GFP :: EGL-4 em AWC são atraídas para uma fonte pontual de odor (Figura 2C representa graficamente os resultados dos ensaios de quimiotaxia representativos de animais inadaptados - observe o índice de quimiotaxia 3 é perto de 1). Animais apresentando GFP nuclear :: EGL-4 no AWC não são atraídas para um ponto fonte do odor adaptação (gráficos Figura 2E resultados representativos dos ensaios de quimiotaxia de animais adaptados - Anote o índice de quimiotaxia é próximo de zero). Para gerar dados estatisticamente significativos do odor induzidas por ensaios de translocação nuclear,os experimentos deve ser feita pelo menos 3 vezes e em dias separados. Para uma descrição detalhada do ensaio de quimiotaxia, pode ser útil fazer referência ao artigo Jove 2490 14. Uma vez EGL-4 entra no núcleo dos neurônios AWC ela provoca alterações estáveis ​​e de longa duração na fisiologia AWC que persistem mesmo quando EGL-4 já não é no núcleo (Figura 3). Após 80 min de exposição de animais odor irá ignorar um ponto fonte do odor adaptação (Figura 3 painel superior, barra de luz na esquerda), e esta adaptação vai persistir mesmo depois de 120 minutos de recuperação (Figura 3 painel superior, barra de luz à direita). Depois de 80 minutos de exposição ao odor GFP: EGL-4 observa-se no núcleo da CTA (Figura 3 painel inferior, a barra de luz do lado esquerdo). Esta entrada nuclear é necessária e suficiente para induzir a adaptação a longo prazo no 5 AWC. Após 120 min de recuperação, os animais não exibem GFP nuclear :: EGL-4 (Figura 3 painel inferior, a barra de luz à direita) ainda continua a ignorar uma fonte de ponto do benzaldeído odor adaptar ao nível comportamental. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4443/4443fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral do protocolo para os ensaios a longo prazo de translocação induzida odor nucleares. Em primeiro lugar, os animais que expressam GFP :: EGL-4 (pyIs500 animais) são cultivadas a 25 ° C em placas de NGM semeados com E. OP50 coli. Em segundo lugar, os animais são expostos a uma mistura de adaptação odor (grupo experimental) ou S-Basal tampão (grupo de controlo). Em terceiro lugar, os animais são pontuados às cegas através da contagem do número de animais que exibem GFP nuclear :: EGL-4 no AWC e o número de animais que exibem citoplasmática GFP :: EGL-4 no AWC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4443/4443fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; Um exemplo do padrão de localização da GFP :: EGL-4 no AWC antes e após exposição prolongada odor é mostrado. (A) imagem confocal do neurônio AWC expressando GFP solúvel. (B) imagem confocal de um animal (não exposto) ingênuo exibindo GFP :: EGL-4 durante todo o citosol do neurônio AWC. (C) Os animais não adaptadas exibem um elevado índice de quimiotaxia próximo de 1, quando testado para se comportamentalmente uma fonte pontual de odor. (D) de imagem confocal de um animal exposto a odor por 80 min exibindo GFP :: EGL-4 no núcleo do AWC. (E) Os animais que exibem GFP nuclear :: EGL-4 apresentam um índice de quimiotaxia próximo de zero (normalmente ~ 0,2), quando testado para se comportamentalmente o odor adaptando AWC. Este valor é modificado com a permissão de O&#39;Halloran et al. 6 Figura 2B. Antes da exposição prolongada odor, GFP :: EGL-4 está localizada no citosol da AWC. Figura 2C. No nível comportamental, os animais com GFP citosólica :: EGL-4 em AWC são atraídas para um ponto azedoce do odor. Este gráfico foi gerado a partir de resultados de ensaios de quimiotaxia representativos de animais inadaptados. Note-se a quimiotaxia de índice é próximo de 1. Figura 2D. Após 80 min de exposição odor GFP :: EGL-4 é localizada para o núcleo do AWC. Figura 2E. Animais expositoras GFP nuclear :: EGL-4 no AWC não são atraídos a uma fonte de ponto do odor adaptação. Este gráfico foi gerado a partir de resultados de ensaios de quimiotaxia representativos de animais adaptados. Note-se a quimiotaxia de índice é próximo de zero. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4443/4443fig3.jpg" /> Figura 3. EGL-4 Uma vez que entra no núcleo dos neurônios AWC ela provoca alterações estáveis ​​e de longa duração na fisiologia AWC que persistem mesmo quando EGL-4 não está mais no núcleo. Os animais expostos ao odor (80 min), são deixadas a recuperar a partir da exposição a longo prazo odor e pontuados para citoplasmático contra nuclearlocalização de GFP :: EGL-4. (Painel superior) Após 120 min de recuperação, os animais que foram expostos ao odor por 80 min ainda estão adaptados ao nível comportamental. (Painel inferior) Após 120 min de recuperação os animais que foram expostos ao odor por 80 min já não exibem GFP nuclear :: EGL-4. Assim, nuclear EGL-4 chama estável de longa duração alterações na fisiologia da CTA que persistem após EGL-4 não está mais no núcleo. A Figura é modificado com a permissão de Lee et al. 5. Figura 3 painel superior. Após 80 min de exposição de odores animais irão ignorar uma fonte pontual de adaptar o odor, e esta adaptação vai persistir mesmo depois de 120 minutos da recuperação. Figura 3 painel inferior. Depois de 80 minutos de exposição ao odor :: GFP EGL-4 observa-se no núcleo do AWC. Esta entrada nuclear é necessária e suficiente para induzir a adaptação a longo prazo no AWC. Após 120 min de recuperação, esses animais não exibem GFP nuclear :: EGL-4 ainda ainda ignorar um ponto source do benzaldeído odor adaptar ao nível comportamental.

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A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

10.7K visualizações.  George Washington University. Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory Caenorhabditis elegans. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neurociência

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...