The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.

Tutti i protocolli topo erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dal comitato Animal Studies di Washington University School of Medicine (St. Louis, MO). 1. Preparare la piastra di prova e Contenitori <ol><li> Pulire la superficie del vetro. </li><li> Fissare la T-tipo di sonda termocoppia filamento alla superficie al centro della lastra di vetro con il nastro di laboratorio. </li><li> Posizionare dello stabulario sulla lastra di vetro in una singola linea lungo il centro del piatto. </li><li> Infilare la sonda della termocoppia attraverso il recinto degli animali centro e collegarlo alla data logger. Girare il data logger sulla mentre disattivare la funzione di spegnimento automatico, e collegare il logger al computer con il cavo fornito. <ol><li> Se si registra la temperatura della piastra durante l&#39;esperimento, aprire il software datalogger per iniziare a registrare le temperature della piastra. </li><li> Se necessario, modificare il software di ricavo la temperatura della piastra ogni secondo. </li><li> Iniziare il rilevamento della temperatura utilizzando il software fornito con il data logger termico. </li></ol></li><li> Separare il recinto con inserti neri per impedire l&#39;interazione visiva tra i topi. </li><li> Posizione rispecchia sotto il vetro in modo tale che la parte inferiore delle recinzioni è visibile da una posizione seduta comoda. </li></ol> 2. riscaldamento / raffreddamento della lastra di vetro <ol><li> Riempire scatole di alluminio con acqua riscaldata, ghiaccio umido, o ghiaccio secco e posizionare in modo appropriato sulla lastra di vetro (pacchetti di stagnola alluminio riempiti con ghiaccio secco può essere utilizzato anche per raffreddare il vetro; Figura 1) 2. <ol><li> Per la prova a 30 ° C, posizionare le scatole di alluminio circa 0,25 &#39;&#39; lontano dai recinti degli animali (Figura 2b) 2. <ol><li> Impostare un circolatore acqua riscaldata su entrambi i lati della piastra di vetro. Impostare il circolatore a 45 - 60 ° C, e civia e per riempire le scatole di alluminio, con un flusso costante di acqua calda (Figura 1C) 2. </li><li> Posizionare i circolatori tale che l&#39;acqua calda dalle scatole di alluminio drena direttamente nel serbatoio del circolatore su ciascun lato (Figura 1C) 2. </li></ol></li><li> Per il test a temperatura ambiente, lasciare le caselle vuote (Figura 2) 2. </li><li> Per la prova a 17 ° C, posizionare le caselle circa 0,25 &#39;&#39; lontano dai recinti di animali su entrambi i lati e riempire con ghiaccio umido (Figura 2) 2. </li><li> Per la prova a 12 ° C, posizionare le caselle circa 1,25 &#39;&#39; di distanza dalle recinzioni su entrambi i lati e riempire con ghiaccio secco (Figura 2) 2. </li><li> Per le prove a 5 ° C, posizionare le caselle circa 0,25 &#39;&#39; distanti custodie su entrambi i lati e riempire con ghiaccio secco (Figura 2) 2.<ol><li> Quando il raffreddamento del bicchiere con ghiaccio secco, assicurarsi che vi sia sufficiente ventilazione per evitare l&#39;accumulo di CO 2 nella stanza. </li></ol></li></ol></li><li> Attendere che il vetro per raggiungere il campo di temperatura desiderata. </li><li> Aggiungere i topi ai contenitori sulla piastra. NOTA: Un generatore di rumore bianco può essere utilizzato per ridurre i disturbi acustici. </li><li> Attendere che i topi si adatti. NOTA: Nella nostra struttura questo richiede circa 2,5 ore, ma puo &#39;variare notevolmente in base stabulazione degli animali e le condizioni di manipolazione. </li><li> Mantenere vetro nel range di temperatura desiderato garantendo che le scatole siano pieni di acqua riscaldata, ghiaccio umido o ghiaccio secco. NOTA: Con il nostro apparato le caselle devono essere riempite con ghiaccio circa ogni 90 min. NOTA: Per la condizione di 17 ° C, è utile svuotare la maggior parte dell&#39;acqua dalle scatole di alluminio attraverso i fori di scarico prima di riempire con ghiaccio. Ciò stabilizzare la temperatura migliore e prtroppopieno evento NOTA: La quantità esatta del ghiaccio secco varia stagionalmente, ma in generale mantenendo caselle più di ¼ completi lungo tutta la lunghezza della scatola manterrà costante la temperatura. </li></ol> 3. Test del Mice a temperature fisse <ol><li> Al di fuori della sala del comportamento, riempire un secchio di ghiaccio pieno per metà di ghiaccio secco. </li><li> Con un martello o mazzuolo, schiacciare il ghiaccio secco in una polvere finissima. NOTA: eccessivo del secchio renderà difficile schiacciare completamente il ghiaccio secco in polvere. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio o forbici, tagliare la parte superiore di una siringa da 3 ml. </li><li> Utilizzando un ago 21 G, colpire 3 fori ai lati opposti della siringa (totale di 6 buche). NOTA: Questi fori diminuirà la pressione generata dalla sublimazione comprimendo il ghiaccio secco. La siringa cut-off può essere riutilizzato per diversi esperimenti. </li><li> Prendere la siringa, polvere ghiaccio secco, e un cronometro portatile nella stanza comportamentale. </li><li> Riempire la camera di siringa di mezzo pieno di polvere di ghiaccio secco. Tenere l&#39;estremità tagliata del siringa contro un oggetto piatto, e saldamente comprimere la polvere utilizzando lo stantuffo. Stai attento; lo stantuffo di plastica può piegarsi o rompersi dalla pressione. Se questo accade, sostituire lo stantuffo di una nuova siringa. </li><li> Estendere la punta del pellet ghiaccio secco compressa oltre il bordo della siringa. </li><li> Topi di prova che sono completamente a riposo. <ol><li> A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, i topi che hanno tutte 4 zampe sul vetro e non si muove, ma non completamente addormentato 19. </li><li> Al 12 ° C e 5 ° C, i topi di prova che sono su 2 zampe o 4 zampe e non in movimento o saltare. </li></ol></li><li> Utilizzando gli specchi per il targeting, delicatamente ma con fermezza premere il filo pellet piatto contro la superficie di vetro sotto il mouse hindpaw (Figura 1A) 2. Avviare la mano-timer. </li><li> Arrestare il timer e rimuovere il pellet quando il mouse si allontana dal vetro raffreddato. NOTA: Lo spostamento di retrocessione può essere verticale o orizzontale. <ol><li> Se il mouse si muove molto brevemente la zampa e poi ritorna alla superficie di raffreddamento, continuano i tempi e stimolando il mouse fino a quando fa una mossa permanente di distanza. NOTA: Il nostro laboratorio utilizza un tempo massimo di 20 sec stimolo per topi nella maggior parte dei casi. </li></ol></li><li> Ripetere questa procedura di test fino a quando vengono raccolti almeno 3 valori per ogni zampa di ciascun animale. Prove separate test zampe opposte sulla stessa mouse almeno 7 min, e prove consecutive separati per ciascuna zampa di almeno 15 min. </li><li> Se necessario, utilizzare diversi spessori di vetro per generare differenti tassi di raffreddamento (Figura 3) 1. NOTA: Il tasso di raffreddamento è inversamente correlato con lo spessore del vetro. </li></ol> 4. Verifica del Mice Durante fredda Adattamento NOTA: Questo è un protocollo alternativo che consente di testare la piattaforma di vetroe si raffredda, piuttosto che una volta che il piatto si è stabilizzata ei topi hanno completamente adattato per l&#39;ambiente freddo. <ol><li> Seguire le istruzioni di cui alla sezione 1 per impostare l&#39;apparecchio. </li><li> Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3 di prendere misurazioni di base a RT (Figura 7A) 2. </li><li> Pre-raffreddare le scatole in alluminio con ghiaccio secco. </li><li> Una volta latenze ritiro di base sono stati misurati, posizionare le caselle preraffreddato sul piatto circa 1,25 &#39;&#39; di distanza dalle recinzioni su entrambi i lati (Figura 7A, freccia etichettato come &quot;ghiaccio secco ha aggiunto&quot;) 2. </li><li> Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3 di prendere misure come la lastra di vetro si raffredda, le misurazioni il più spesso possibile. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and genetic neuron ablation studies26. It can be modified to measure responses to a variety of rates of cooling using different thicknesses of glass, and the size of the cold stimulus applied can be altered using different sized syringes. 
The most critical step for performing this assay properly is cooling or warming the glass plate evenly during testing. Carefully arranging the aluminum boxes so that they are evenly spaced on either side of the animal enclosures will help generate more uniform temperatures. Marking the glass plate to standardize aluminum box placement between experiments will also improve the reproducibility of the assay, although these markings may have to be periodically recalibrated to account for seasonal variations in building temperature.
It can also be challenging to maintain a consistent glass plate temperature over the course of the experiments. Ensuring that the aluminum boxes are always evenly filled with dry ice/wet ice/warmed water will yield experiments with stable plate temperatures. Additionally, under the 17 &#176;C testing condition it may become more difficult to maintain the temperature as the wet ice melts. We recommend draining excess water from the melted ice out of the aluminum boxes before refilling with more wet ice. 
The main limitation is that the mouse paw must be in contact with the glass surface in order to ensure a consistent cold stimulus. This can be an issue in some neuropathic models, such as the chronic constriction injury, which can cause paw curling. Other challenges to obtaining reproducible results with this assay include that the mice must be fully at rest, which requires adequate acclimation periods. If the mice are too active for testing, it may help to allow longer acclimation periods. Finally, groups that are planning to utilize this assay must also ensure that there is sufficient ventilation in the room in order to prevent CO2 buildup when using large amounts of dry ice.

Misurare reattività freddo nei roditori è importante per migliorare la comprensione dei potenziali meccanismi di sensibilità freddo negli esseri umani sia in condizioni normali e patologiche. The Cold plantare Assay (CPA), originariamente sviluppato diversi anni fa 1, è stato progettato per generare risposte riproducibili, inequivocabili murine comportamentali a uno stimolo freddo consegnato a RT. Miglioramenti più recenti di questo test hanno permesso la misurazione riproducibile di sensibilità fredda in un ampio intervallo di temperature 2. Entrambe le versioni sono inoltre progettati per essere relativamente alto rendimento, e poco costoso da utilizzare. Una grande quantità di progressi sono stati compiuti nella comprensione dei meccanismi di sensibilità a freddo utilizzando altri metodi comportamentali. Un metodo è il test di evaporazione acetone, che comporta tamponando o spruzzando acetone sulla zampa mouse e misurando la quantità di tempo che il mouse spende portando l&#39;3,4 zampa. Purtroppo,le risposte alla acetone evaporazione sono confusi dalla sensazione umida e l&#39;odore del acetone. Inoltre, lo stimolo fredda che viene applicato durante la prova di evaporazione acetone può variare in base alla quantità di acetone applicata, ed è difficile da quantificare. Infine, i topi hanno risposte indenni minime quantità di acetone al basale, rendendo impossibile misurare l&#39;analgesia in assenza di ipersensibilità con questo metodo. Un altro test classico per le risposte a freddo è il test coda flick, dove la latenza di recesso viene misurata dopo la coda è immerso in 5,6 acqua fredda. Mentre le risposte comportamentali in questo saggio sono inequivocabili e il test misurano risposte ad una temperatura specifica, gli animali devono essere trattenuti durante la prova, che possono alterare la risposta fredda attraverso ben definite meccanismi analgesici da stress 7. Un altro strumento comunemente usato è il test della piastra fredda, che misura il comportamentorisposte di topi dopo che sono posti su una piastra di Peltier raffreddato 8-10. Mentre questo strumento fornisce informazioni sulle risposte animale a temperature specifiche, è stato anche utilizzato incoerente; diversi gruppi hanno misurato diversi tipi di risposte incluso il numero di salti 8,11, la latenza alla prima risposta 8,11- 13, e il numero di ascensori paw 11,13,14 con risultati molto diversi. Il saggio piastra fredda è relativamente bassa capacità, come solo un animale può essere testato per volta, e richiede un dispositivo Peltier costosi e fragili. Il test preferenza temperatura 2-piastra è un derivato comunemente usato per il test della piastra fredda che misura la quantità relativa di tempo che gli animali passano su 2 piastre collegate delle diverse temperature 9,15- 17. Un altro simile test comunemente usato è il saggio gradiente termico, in cui la quantità di tempo che i topi passano in differenti zone di temperaturacompresa tra 5 ° C e 45 ° C su una piastra metallica lunga 16 viene misurata. Mentre questi test permettono il confronto delle temperature, non è chiaro se il comportamento rappresenti avversione temperatura o di preferenza temperatura. Infine, la dinamica dosaggio piastra fredda è stato usato per misurare quanto topi rispondono alle mutevoli temperatura ambiente 18. Questo metodo prevede il posizionamento mouse su un dispositivo Peltier RT e rampa verso il basso per 1 ° C durante la misurazione di quanto i topi saltano o leccarsi le zampe a temperature diverse placche. Mentre questo test come topi adattarsi ad un ambiente di raffreddamento, non fornisce un modo per testare come topi rispondono ad uno stimolo freddo nella cornice di una temperatura ambiente più fresco. Inoltre, richiede attrezzature costose effettuare e non fornisce un modo per acclimatare topi all&#39;apparecchiatura prova prima di misurare la loro sensibilità fredda. Per completare questi test, il CPA testa il ACCLIMAted risposte ad uno stimolo fredda ben definito in una varietà di campi di temperatura, o durante il processo di adattamento a temperature ambiente freddo. Si può testare fino a 14 topi alla volta con il nostro apparato attuale, con la possibilità di essere a buon mercato in scala per i test high-throughput.

<table><tbody><tr><td>T-type thermocouple probe</td><td>Physitemp</td><td>IT-24p</td><td>Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td></tr><tr><td>Glass plate</td><td>Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)</td><td></td><td>We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4&#039;&#039;, but 3/16&#039;&#039; and 1/8&#039;&#039; are also useful</td></tr><tr><td>Thermal Data logger</td><td>Extech</td><td>EA15</td><td>Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&amp;amp;prodid=408)</td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td>The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe</td></tr><tr><td>Computer</td><td>If using Extech logger, any Pcwill work</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum boxes</td><td>Washington University in St. Louis machine shop</td><td></td><td>boxes are 3&#039; long, 4.5&#039;&#039; wide, and 3&#039;&#039; tall with a sealed lid.&amp;nbsp; There is a 1/2&#039;&#039; hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.</td></tr><tr><td>Heated water circulator</td><td>VWR</td><td></td><td>Any water circulator model with a pump will work</td></tr><tr><td>21 G needle</td><td>BD</td><td>305165</td><td>The exact needle size is not important</td></tr><tr><td>Hand timer</td><td></td><td></td><td>Any hand timer will work</td></tr><tr><td>Mirror</td><td></td><td></td><td>Any flat mirror will work</td></tr></tbody></table>

a simple and inexpensive method for determining cold sensitivity and adaptation in mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Le risposte comportamentali indotte da topi a partire da 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C sono altamente riproducibili (Figura 4A) 20. Per misurare lo stimolo freddo generato sotto il hindpaw, i topi sono stati anestetizzati con ketamina / xilazina / acepromazina cocktail e le zampe sono state fissate sul vetro sulla cima di una termocoppia di tipo T filamento (Figura 4B) 20. Il vetro è stato raffreddato o riscaldato alla gamma di test desiderato. Sebbene la piastra viene raffreddato uniformemente lungo la lunghezza della piastra (Figura 5A) 2, va notato che un gradiente fredda viene generato attraverso le custodie comportamento (Figura 5B) 2. Le parti del contenitore che sono più vicini al ghiaccio secco su entrambi i lati dei contenitori sono più fredde, mentre le parti centrali sono leggermente più caldo (Figura 5B) 2. Nelle temperature più fredde used, i topi trascorrono la maggior parte del loro tempo nelle parti centrali del contenitore. Una volta che la temperatura della piastra di vetro si era stabilizzato, uno stimolo ghiaccio secco focale è stato posizionato sul vetro sotto la zampa / thermode. Sulla base delle tracce temperatura registrati da questa configurazione, è chiaro che gli stimoli freddi generati utilizzando CPA sono altamente riproducibili ad ogni intervallo di temperatura (Figura 4C) 20. Lo stimolo fredda generata nel CPA è stata determinata sulla base di tre differenti spessori di vetro per variare l&#39;intensità del raffreddamento (Figura 3). Il tasso di raffreddamento è inversamente proporzionale allo spessore del vetro, e qualsiasi di questi spessori può essere utilizzata per misurare la sensibilità fredda come necessario (Figura 3). Il lavoro precedente ha mostrato che il CPA può rilevare analgesia e ipersensibilità nei topi. 30 min dopo iniezioni sottocutanee di 1,5 mg / kg di morfina, i topi hanno significativamente longer latenza per il ritiro di topi dato iniezioni sottocutanee di soluzione fisiologica (Figura 6 a: 2-way ANOVA principale effetto * p &lt;0.05 con il test di Bonferroni post-hoc; 30 min ** p &lt;0.01; n = 12 per gruppo) 1. Con 60 min dopo la morfina / soluzione salina, non c&#39;è differenza tra il saline- e gruppi morfina-iniettato, che è coerente con il tasso di metabolismo morfina in topi. Completa di Freund Adjuvant (CFA) è stato precedentemente dimostrato di causare infiammazione e ipersensibilità dopo hindpaw iniezione 21. Dopo iniezioni CFA, le latenze ritiro CPA diminuiscono 2 e 3 ore dopo l&#39;iniezione (Figura 6B: 2-way ANOVA effetto principale p &lt;0,001 con Bonferroni post-hoc test; 2 ore * p &lt;0,05, 3 ore ** p &lt;0.01 n = 12 per gruppo). 4 ore dopo l&#39;iniezione CFA, i topi hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di 1,5 mg / kg di morfina. 30 minuti dopo l&#39;iniezione di morfina, sia CFA- e topi soluzione salina iniettata era aumentato withdrAwal latenze rispetto ai loro latenze alle 3 ore (Figura 6B: 1 ANOVA con test post-hoc di Dunnett, CFA 3 ore contro CFA 4,5 hr $$$ p &lt;0,001, saline 3 ore contro salina 4.5 hr $$$ p &lt;0.001). Un&#39;ora più tardi, una volta che la morfina è stata metabolizzata, i topi CFA-iniettati, ancora una volta ha avuto latenze ritiro inferiori rispetto ai topi di controllo Salina-iniezione (figura 6B: 2-way ANOVA con test di Bonferroni post-hoc; ** p &lt;0.01) 1. La maggior parte delle specie di mammiferi hanno la capacità di adattare la loro sensibilità alla temperatura per abbinare il loro ambiente. In vitro, gli studi hanno suggerito che questo processo di adattamento dipende PIP 2 idrolisi 22- 24, ma gli strumenti comportamentali precedenti non erano in grado di convalidare questa ipotesi in vivo. Il CPA è in grado di quantificare questo adattamento in due modi diversi. Testando la latenza ritiro di topi come raffredda il vetro ( <strong&gt; Figura 7A, C), il CPA può misurare adattamento al freddo come accade 2. In condizioni normali la latenza di ritiro è invariato come la piastra si raffredda, suggerendo che l&#39;adattamento al freddo avviene più velocemente di quanto può essere quantificato con il CPA (Figura 7B: 0 min = 12.13 ± 0,8 sec, 30 min = 12.1 ± 1.6 sec, 60 min = 13.2 ± 1.1 sec, 90 min = 10,8 ± 1,2 sec 1 ANOVA con Bonferroni post hoc di prova p&gt; 0.05, n = 6) 2. Tuttavia, quando i topi sono date intraplantar iniezioni della fosfolipasi C-inibitore U73122 25 prima che il piatto è raffreddato (Figura 7C) le latenze di astinenza sono diminuite, il che suggerisce che l&#39;adattamento è compromessa (Figura 7D: baseline = 11.29 ± 0.53 sec, 30 min = 8.09 ± 1.17 sec, 1 ANOVA con test di Dunnett post-hoc, effetto principale p = 0,02, individuale basale vs 30 min p = 0.02, n = 9). Il CPA può anche misurare l&#39;ability di adattarsi a freddo temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo. Quando topi wild-type sono testati utilizzando CPA dopo essere acclimatati per 3 ore a 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C la latenza recesso stesse temperature affatto partenza, suggerendo che il wild-type topi adattato alla temperatura ambiente più fredda (Figura 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 sec, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 sec, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 sec, 12 ° C = 12.8 ± 0.5 sec, 1- ANOVA con test di Bonferroni post-hoc, p&gt; 0.05 n = 6 per 30 ° C, n = 15 a 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C) 20. A differenza dei topi wild-type, mentre la temperatura iniziale diminuisce le latenze ritiro di topi TRPM8-KO diminuire, suggerendo che esse sono in grado di adattare la loro soglia di risposta per soddisfare il loro ambiente (Figura 8: 1-way ripetute misure ANOVA con Bonferroni post- Test hoc; maschi effetto principale p = 1.5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C 23 ° C vs p = 0,004; femmine effetto principale p = 3.6 x 10 -5, 12 ° C rispetto a 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C rispetto a 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 maschi e 11 femmine) 20. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig1.jpg" /> Figura 1. Il freddo plantare Assay (CPA) apparato 2. (A) Schema per eseguire la CPA. I topi sono acclimatati su una lastra di vetro in custodie comportamentali plastica fino a quando sono a riposo. Un pellet di ghiaccio secco viene applicato alla parte inferiore del vetro sotto il hindpaw, e la latenza di ritirarsi dal vetro raffreddamento viene misurata. (B) Immagine dell&#39;apparato CPA, in configurazione per raffreddare la piastra a 5 ° C. Il data logger termico è al centro delle custodie, E le scatole di alluminio fiancheggiano il contenitore su entrambi i lati. (C) Immagine dell&#39;apparato CPA, in configurazione per riscaldare la piastra a 30 ° C. Il circolatore acqua scorre acqua calda nella scatola di alluminio, che poi fuoriesce lo scarico sul lato posteriore nel serbatoio del circolatore. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig2.jpg" /> Figura 2. La temperatura della lastra di vetro durante il CPA 2. (A) Averaged tracciati temperatura della lastra di vetro durante gli esperimenti comportamentali nella CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) diagrammi schematici demonstrating come generare le diverse condizioni di temperatura nel CPA. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig3.jpg" /> Figura 3. Lo spessore del vetro è inversamente correlato con la velocità di raffreddamento 1. (A) Schema diagrammi disegno sperimentale (BD). La temperatura durante fredda plantare stimolo sotto la zampa è stato misurato su tutte tre spessori di vetro in condizioni normali, e distanziali polistirolo propping la zampa lontano dalla superficie del vetro. In tutti i casi, propping la zampa di distanza dal vetro causato una diminuzione drammatica nella stimolo freddo misurata alla zampa (n = 6 per spessore del vetro). ( <strong&gt; E) La temperatura sotto la zampa è stata misurata durante Hargreaves stimolazione calore radiante con la zampa appoggiato con polistirolo. A differenza del dosaggio plantare fredda, lo stimolo termico nel saggio Hargreaves è sostanzialmente inalterata quando la zampa è appoggiato distanza dal vetro (n = 6). Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2012 1 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig4.jpg" /> Figura 4. latenze ritiro CPA sono coerenti 20. (A) di latenza media di ritiro per i topi a partire da 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C. (B) Configurazione per misurare CPA stimolo freddo. La zampa di un mouse anestetizzato è fissato sulla lastra di vetro con il nastro di laboratorio in cimadi un tipo T filamenti termocoppia. Lo stimolo CPA è posto sul lato inferiore del vetro sottostante sia zampa e termocoppia. (C) Temperature generati nella CPA a partire dal 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, o 12 ° C. Le frecce nere rappresentano le latenze medie di ritiro per topi svegli in ogni condizione. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig5.jpg" /> Figura 5. temperature lastra di vetro sono coerenti nella CPA 2. (A) termocoppia t1 (nero) è stato posto al centro della piastra. Termocoppia t2 (rosso) è stata posta nel contenitore comportamentale più vicino al bordo destro della piastra. TRA temperaturacings e il grafico all&#39;estrema destra (t1-t2) mostrano temperature quasi identici a t1 e t2 durante tutto il corso dell&#39;esperimento. (B) t1 termocoppia (nero) è stato posto al centro della piastra. Termocoppia t2 (rosso) è stata posta nel contenitore comportamentale centrale, in corrispondenza della parete più vicino alle scatole di alluminio ghiaccio secco-riempita. I tracciati di temperatura e il grafico all&#39;estrema destra (t1-t2) mostrano che vi è una differenza di circa 3 ° C tra t1 e t2 quando la piastra ha raggiunto una temperatura stabile. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig6.jpg" /> Figura 6. Il CPA può misurare analgesia e ipersensibilità 1. (A) Subcutaneous iniezione di 1,5 mg / kg di morfina aumenta la latenza ritiro di topi 30 min dopo l&#39;iniezione (2 ANOVA con test di Bonferroni post-hoc; 30 min dopo l&#39;iniezione ** p &lt;0.01). 60 minuti dopo l&#39;iniezione, non vi è alcuna differenza significativa tra la morfina-iniettato e topi saline-iniettato. (B) Intraplantar iniezione di 10 ul adiuvante completo di Freund (CFA) riduce la latenza ritiro di topi 2 e 3 ore dopo l&#39;iniezione (2 ANOVA con Bonferroni post-hoc test; * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01). Tutti i topi hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di morfina a 4 ore, e tutte le latenze di ritiro a 4,5 ore erano significativamente più alti rispetto a 3 ore (1 ANOVA con test post-hoc di Dunnet; $$$ p &lt;0.001). 5.5 ore dopo l&#39;iniezione di CFA (1,5 ore dopo l&#39;iniezione di morfina), topi CFA-iniettati aveva ancora latenze ritiro inferiori rispetto topi soluzione salina iniettata (2-way ANOVA con Bonferroni post-hoc test; ** p &lt;0.01). Riutilizzati con il permesso diBrenner et al. 2012 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig7.jpg" /> Figura 7. Misurazione adattamento freddo come la lastra di vetro si raffredda dinamicamente 20. (A) Schema per eseguire il CPA come la lastra di vetro si raffredda. Temperature basali sono misurati a temperatura ambiente, i contenitori di ghiaccio secco vengono aggiunti alla piastra, e la latenza recesso viene misurata come la lastra di vetro si raffredda. (B) topi wild-type hanno la stessa latenza ritiro come la lastra di vetro si raffredda, suggerendo che si adattano a temperature di raffreddamento più velocemente di quanto può essere misurato con il CPA (Baseline = 12.8 ± 0.3 sec, 30 min = 13.67 ± 0,9 sec, 60 min = 11.03 ± 1.0 sec, 90 min = 11,31 ± 0,6 sec, n = 3 topi; 1 ANOVA con test post-hoc di Bonferroni, nessuna differenza significativa tra tutti i gruppi). (C) Schema per eseguire la CPA come lastra di vetro si raffredda, dopo intraplantar iniezioni del U73122 inibitore PLC o l&#39;U73343 compound di controllo. (D) I topi hanno latenze astinenza significativamente inferiori mentre la piastra si raffredda dopo l&#39;iniezione U73122, U73122 suggerendo che interferisce con la capacità di adattarsi al raffreddamento temperatura ambiente. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 20. Questa figura è stato riprodotto con il permesso della Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (IASP). Il dato non può essere riprodotto per qualsiasi altro scopo senza autorizzazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt= &quot;Figure 8&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52640 / 52640fig8.jpg&quot; /&gt; Topi Figura 8. TRPM8-KO non adattarsi al raffreddamento ambientale 20 topi TRPM8-KO hanno latenze ritiro più elevati rispetto wild-type fratellini a tutte le temperature misurate a partire (2-way ANOVA con Bonferroni post-hoc test;. *** P &lt; 0,001). La latenza ritiro di topi TRPM8-KO diminuisce anche al diminuire della temperatura di partenza (1-way ANOVA con Bonferroni post-hoc test; ## p &lt;0.01, ### p &lt;0.001), mentre non vi è alcun cambiamento significativo nel ritiro la latenza di wild-type fratellini come cominciando diminuire della temperatura. Riutilizzati con il permesso di Brenner et al. 2014 20. Questa figura è stato riprodotto con il permesso della Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (IASP). Il dato non può essere riprodotto per qualsiasi altro scopo, senza il permesso. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52640/52640fig8large.jpg" target="_blank">Si prega CLIC</a>k qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  Washington University in St. Louis. The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

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Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected with aging and is a strong predictor of neurodegenerative diseases. Thus, olfaction testing is used as a non-invasive diagnostic method to detect neurological deficits early on. In order to understand the mechanisms underlying olfactory network susceptibility, olfactory research in rodents has gained momentum in the past decade.
Here, we present a very simple, time efficient and reproducible olfactory testing method of innate odor perception and sensitivity in mice without the need of any prior food or water restriction. The tests are performed in a familiar environment to the mice, require only the scents and a 2 min session of odorant exposure. The analysis is performed, post-hoc, using computer-assisted commands on ImageJ and can be, therefore, carried out from start to end by one researcher.
This protocol does not require any special hardware or setup and is indicated for any laboratory interested in testing olfactory perception and sensitivity.

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Semplice e assistita da computer Olfattivo Test per Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

Ricerca

Comportamento

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Immunologia e infezioni

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Neuroscienze

Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as photophobia. Whilst it is impossible to confirm that a mouse is experiencing migraine, light aversion can be used as a behavioral surrogate for the migraine symptom of photophobia. To test for light aversion, we utilize the light/dark assay to measure the time mice freely choose to spend in either a light or dark environment. The assay has been refined by introducing two critical modifications: pre-exposures to the chamber prior to running the test procedure and adjustable chamber lighting, permitting the use of a range of light intensities from 55 lux to 27,000 lux. Because the choice to spend more time in the dark is also indicative of anxiety, we also utilize a light-independent anxiety test, the open field assay, to distinguish anxiety from light-aversive behavior. Here, we describe a modified test paradigm for the light/dark and open field assays. The application of these assays is described for intraperitoneal injection of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in two mouse strains and for optogenetic brain stimulation studies.

Rodents are not able to report migraine symptoms. Here, we describe a manageable test paradigm (light/dark and open field assays) to measure light aversion, one of the most common and bothersome symptoms in patients with migraines.

Studiare il comportamento simile all'emicrania usando l'avversione alla luce nei topi

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as ...

Measuring Skeletal Muscle Thermogenesis in Mice and Rats

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. Surprisingly little evidence is available to link the neural, myocellular, and molecular mechanisms of thermogenesis directly to measurable changes in muscle temperature. This paper describes a method in which temperature transponders are utilized to retrieve direct measurements of mouse and rat skeletal muscle temperature.
Remote transponders are surgically implanted within the muscle of mice and rats, and the animals are given time to recover. Mice and rats must then be repeatedly habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage. Muscle temperature can also be measured during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed) to factor out changes in activity as contributors to the changes in muscle temperature induced by these stimuli.
This method has been successfully used to elucidate mechanisms underlying muscle thermogenic control at the level of the brain, sympathetic nervous system, and skeletal muscle. Provided are demonstrations of this success using predator odor (PO; ferret odor) as a contextual stimulus and injections of oxytocin (Oxt) as a pharmacological stimulus, where predator odor induces muscle thermogenesis, and Oxt suppresses muscle temperature. Thus, these datasets display the efficacy of this method in detecting rapid changes in muscle temperature.

Mice and rats are surgically implanted with remote temperature transponders and then habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage or during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed).

Misurazione della termogenesi del muscolo scheletrico in topi e ratti

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. ...

Urokinase-type Plasminogen Activator-induced Mouse Back Pain Model

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid induction of a persisting back pain model in mice are provided here using an injection of urokinase-type plasminogen activator (urokinase), a serine protease present in humans and other animals. The methodology for induction of persisting lower back pain in mice involves a simple injection of urokinase along the ligamentous insertion region of the lumbar spine. The urokinase inflammatory agent activates plasminogen to plasmin. Typically, the model can be induced within 10 min and hypersensitivity persists for at least 8 weeks.
Hypersensitivity, gait disturbance, and other standard anxiety- and depression-like measures can be tested in the persisting model.&#160;Back pain is the most prevalent type of pain. To improve awareness of back pain, the International Association for the Study of Pain (IASP) named 2021 the &#34;Global Year about Back Pain&#34; and 2022 the &#34;Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice.&#34; One limitation of the therapeutic advancement of pain therapeutics is the lack of suitable models for testing persistent and chronic pain. The&#160;features of this model&#160;are suitable for testing potential therapeutics aimed at the reduction of back pain and its ancillary characteristics, contributing to IASP&#39;s naming 2022 as the Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice.

Methods for simple, rapid induction of a back pain model in mice are provided here using an intraligament injection of urinary plasminogen activator.

Modello di mal di schiena di topo indotto dall'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid ...

Esplorare lo scambio di metaboliti nel tessuto adiposo bruno

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

Autore in primo piano: Illuminare nuove strade per il metabolismo del tessuto adiposo e la prevenzione delle malattie 

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Biochimica

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Semplice e assistita da computer Olfattivo Test per Mice

Misurare Anafilassi locali nei topi

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Studiare il comportamento simile all'emicrania usando l'avversione alla luce nei topi

Misurazione della termogenesi del muscolo scheletrico in topi e ratti

Modello di mal di schiena di topo indotto dall'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi

Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in