Gostaríamos de agradecer a Sociedade Max-Planck para financiar nossa pesquisa.

1. Preparação de respirômetros <ol><li> Corte a ponteira 1000 mL com uma lâmina de barbear para permitir a inserção da micropipeta capilar 50 ul, para tentar obter a ponteira o mais reto possível. </li><li> Coloque um pedaço de espuma para a pipeta e empurrá-lo para baixo na ponta da pipeta. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de CO 2 absorvente e conter por um segundo pedaço de espuma. </li><li> Aplicar cola no local onde a micropipeta é inserida a ponta da pipeta. </li><li> Deixar o respirómetro durante a noite para permitir que a cola seque. Um diagrama esquemático de um respirómetro é mostrado na Figura 1A. </li></ol> 2. Preparação da câmara de medição <ol><li> Preparar a solução de câmara através da mistura de água com eosina numa proporção que vai resultar numa coloração visível. </li><li> Verter a solução eosina / água para dentro da câmara. </li><li> Rotular um dos lados da câmara com uma escala de centímetros. </li></ol><ol><li> Identifique os respirômetros individuais com um marcador. </li><li> Anestesiar moscas usando um método alternativo ao CO 2 e colocar 3-5 moscas do genótipo desejado dentro de cada respirômetro. </li><li> Vedar as respirômetros firmemente no topo usando plasticina massa de vidraceiro. </li><li> Permitir que as moscas se recuperar da anestesia para cerca de 15 min. </li><li> Preparar um respirómetro sem moscas, que vai ser utilizado como o controlo atmosférico. </li></ol> 4. Realização do experimento <ol><li> Pendure as respirômetros na câmara, anexando um porta-tubos de 1,5 ml Eppendorf que está aberto na parte superior e na parte inferior, na parte superior da câmara. </li><li> Insira respirômetros com a ponta micropipeta para dentro da câmara permitindo a ponta para submergir na solução colorida. </li><li> Adicionar vaselina entre a tampa da tampa e da câmara para fornecer isolamento mais forte de temperatura e pressão flucttuações. </li><li> Fechar a tampa e permite que o sistema atinja o equilíbrio durante 15 minutos. </li><li> Tire uma foto da câmara certificando-se que o nível de líquido dentro de cada micropipeta é visível e por isso é a escala (veja o exemplo mostrado na Figura 1B). </li><li> Depois de 1-2 horas, tirar outra foto. </li><li> Quando experimento estiver concluído, remova as moscas de respirômetros e pesar se desejado ou transferi-los de volta para o frasco, se necessário ainda mais. </li></ol> 5. Análise dos Resultados <ol><li> Abrir adquiriu imagens usando software ImageJ 11. </li><li> Usando a escala em cada imagem, definir a escala de pixels no software. </li><li> Meça a distância (Δd) que o líquido viajaram de um ponto de referência determinado em imagens tiradas no início (d1) e no final do experimento (d2). Um exemplo esquemático é mostrado na Figura 1C. </li><li> Calcular a quantidade de CO 2 produzido (il / hr / mosca) com a fórmula: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" /> R = raio do tubo em centímetros de micropipeta Δd = distância do líquido subiu na micropipeta de amostras medidas em centímetros Ac = distância do líquido subiu na micropipeta da amostra de controlo negativo (sem moscas) n = número de moscas utilizadas h = horas

<ol>
	<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+&amp;#34;rate+of+living&amp;#34;+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the &amp;#34;rate of living&amp;#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li><li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster.">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).</li><li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+contribution:+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates.">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li><li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li><li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+modulates+metabolic+rate+and+temperature+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temperature+preferences+and+energy+homeostasis+in+dystroglycan+mutants.">Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants.</a> Science. 323, 1740-1743 (2009).</li><li>Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+muscular+dystrophy:+a+genetic+screen+for+dystroglycan+and+dystrophin+interactors+in+Drosophila.+identifies+cellular+stress+response+components.">Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components.</a> Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).</li><li>Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermic+seizures+and+aberrant+cellular+homeostasis+in+Drosophila+dystrophic.+muscles.">Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles.</a> Scientific Reports. 1, 47 (2011).</li><li>Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+metabolism+in+Drosophila+melanogaster:+genetic+correlations+between+life+span+and+age-specific+metabolic+rate+in+populations+artificially+selected+for+long+life.">Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life.</a> Genetics. 169, 231-242 (2005).</li><li>Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+equivalents+of+CO2+and+their+importance+in+assessing+energy+expenditure+when+using+tracer+techniques.">Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques.</a> The American Journal of Physiology. 260, (1991).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Bharucha, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicurean+fly:+using+Drosophila+melanogaster.+to+study+metabolism.">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism.</a> Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Neste protocolo, descrevemos um método barato e confiável para medir a produção de CO 2 em moscas. Descobrimos que esta experiência é fácil, rápido para conduzir e gera dados reprodutível que está de acordo com outros estudos 1, 6, 9. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente modificado para se adequar orçamento e materiais disponíveis de qualquer laboratório. A construção de cada um respirómetro indivíduo pode ser adaptado, enquanto mantém a câmara hermética. No entanto, o mais longo, micropipetas mais finas oferecem mais precisão sobre os mais curtos. A utilização da câmara exterior pode ser opcional, desde que não existam alterações de temperatura e pressão ambientes significativos para comprometer o experimento. Isto pode ser determinado por meio de análise do controlo negativo e uma grande variabilidade dentro de medições de amostras biológicas. Além disso, o CO2 absorvente pode ser de qualquer variedade contanto que não é tóxico para o fmentiras (por exemplo, hidróxido de potássio). É de extrema importância ter um controle negativo para assegurar que a técnica está funcionando corretamente. O problema mais comum é para o respirômetro de não ser completamente selado. Se for este o caso, então a medição será comparável à do controlo negativo. Problemas adicionais podem surgir devido a moscas que não tiveram tempo para se recuperar da anestesia ou pereceram. O passo mais importante neste protocolo é a construção do respirômetro. Como observado acima, o respirómetro devem ser estanques. A fixação da micropipeta para a câmara de pipeta maior deve ser feito com a cola correcta. Um adesivo mais borracha, como tem funcionado melhor. Recomenda-se para inspecionar os respirômetros sob um microscópio para observar quaisquer compromissos na estrutura colada após a conclusão. Além disso, a vedação da respirómetro após moscas foram colocadas no interior é muito importante. O uso de massa de vidraceiro hcomo foi encontrado para trabalhar melhor e não com pouca freqüência. A parafina foi considerado por funcionar muito mal e deve ser evitado. O líquido que é utilizado para medir o volume de gás, também é muito importante e deve ser manométrico. A água é, portanto, a melhor escolha. O uso de tinta não é recomendado, pois pode endurecer no capilar tornando o respirômetro inútil. Também é fundamental para não usar reproduzir fêmeas, como percebemos que a sua produção de CO 2 pode ser altamente variável. Além disso, a idade de moscas é importante, por conseguinte, as moscas que são comparados devem ser da mesma idade. Em nosso teste usamos machos 5 dias de idade. A base genética para as moscas também é importante. As moscas de controlo devem ser do mesmo fundo genético quando comparada com os mutantes. Os dados também pode ser apresentado como (mL / hr / mg) através da medição da massa das moscas, após a realização do teste, se há diferenças significativas no tamanho das moscas. Em nossas mãos, um tipo selvagem mosca pesa 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Deve também salientar-se que, durante a distribuição do experimento, obtêm-se os valores da taxa metabólica média. Também descobrimos que é possível medir uma mosca individual, mas conseguimos a mais alta precisão usando 3-5 moscas. O espaço disponível no respirômetro para moscas é o suficiente para que eles não se sentem superlotado, mas ao mesmo tempo eles não têm espaço para andar de forma intensiva por isso geotaxis defeituosos não devem ter qualquer efeito sobre o nível de produção de CO 2. As moscas têm sido estabelecido como um dos principais organismos modelo para estudar doenças humanas que estão relacionados com a biologia do desenvolvimento, biologia celular, e neurobiologia. Uma série de estudos recentes têm demonstrado que as moscas possam ser facilmente usadas para estudar a homeostase de energia, bem como (revisão em 12 e 13). O método aqui apresentado pode ser facilmente utilizado em telas genéticos para identificar novos componentes moleculares possivelmente envolvidas no controlo do meestado metabólica antes de comprar um equipamento mais preciso e caro. Até agora, a maioria de tais telas foram feitas somente em cultura de células, indicando que estudos mais avançados são necessários.

O ciclo de Krebs bioquímica gera ATP por meio da oxidação do derivado de acetato de hidratos de carbono, gorduras e proteínas produtoras de CO 2. Em Drosophila, O 2 entrada é diretamente correlacionado com CO 2 de saída e reflete o nível de metabolismo 1. Assim, a medição de CO 2 saída de sucesso tem sido utilizado em estudos relacionados ao envelhecimento e metabolismo 2-5. Aqui nosso laboratório tem modificado montagens experimentais previamente elaborados, permitindo a medição da produção de CO 2 em até dezoito amostras sem necessidade de qualquer equipamento especializado. Outros e nós já usou esse método para mostrar as diferenças nas taxas metabólicas em moscas que são deficientes na proteína associada muscular distrofia, Dystroglycan (GD) 6-8. O 2 usado para o metabolismo oxidativo é convertido em CO2, o qual é expelido como resíduos respiratória. A construçãoção de respirômetros feito à mão é descrito que permite a determinação da taxa de O 2 consumido. As moscas são colocadas em um recipiente vedado com uma substância que absorve o CO2 expelido, eliminando-o de forma eficiente a partir da fase gasosa. A variação do volume do gás (diminuição da pressão) é medido por deslocamento de fluido num capilar de vidro ligado ao respirómetro fechada. A principal vantagem desta técnica sobre os outros é o custo. Estudos anteriores já haviam medido produção de CO 2 por Drosophila usando analisadores de gás e sistemas de respirometria tecnicamente avançados 1,9. Apesar do equipamento mais complexo, a sensibilidade do método aqui descrito é semelhante aos valores relatados (Tabela 1). Além disso, vários outros grupos usaram variações desta técnica para determinar as taxas metabólicas relativas em Drosophila 4-6. Por isso, este ensaio pode ser usado para gerar reliable, dados reprodutíveis relevantes ao metabolismo Drosophila sem a aquisição de equipamento especializado, que pode ser configurado em qualquer laboratório e pode ser usado para fins educacionais. Em geral, as técnicas aceites para determinar o metabolismo de um organismo é medir a produção de CO 2, O 2 consumido, ou ambos 3,4,9. Porém, pode ser assumido que um equivalente de O 2 gera um equivalente de CO 2, a relação precisa de CO 2 gerado é dependente do substrato metabólico utilizado 10. Assim, para determinar com precisão a taxa de metabolismo em unidades de energia, é necessário medir ambos O 2 consumido e do CO 2 produzido. Devido a isto, o método descrito aqui é especificamente relevante para comparar diferenças na produção de CO 2 entre os animais e não os valores absolutos. Nossa técnica integra vários animais CO 2 da produção durante um período de time (1-2 horas) e, portanto, retorna uma média da actividade dos animais. Se não há razão para acreditar que os animais experimentais são menos ativas do que os animais de controle a medida pode refletir diferentes níveis de atividade e metabolismo não necessariamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1126">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">BlauBrand IntraMark 50&#181;l micropipettes</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">612-1413</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Soda Lime</td>
			<td style="width:101px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CDN6847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Eosine&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">031M4359</td>
			<td>Any dye that can create visible colorization of liquid can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:401px;">Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td>21432-761</td>
			<td>Any transparent glass chamber that can be closed with the lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit</td>
			<td style="width:101px;">Flinn</td>
			<td>FB1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Power Gel Glue</td>
			<td style="width:101px;">Pritt</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">1 ml pipett tips</td>
			<td style="width:101px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Foam&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plaesticine Putty</td>
			<td style="width:101px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Scalpel</td>
			<td style="width:101px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Twezzers&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of metabolic rate in drosophila using respirometry

Distúrbios metabólicos são um problema freqüente que afeta a saúde humana. Portanto, a compreensão dos mecanismos que regulam o metabolismo é uma tarefa científica crucial. Muitos genes que causam doenças nos seres humanos têm um homólogo mosca, tornando Drosophila um bom modelo para estudar vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento de doenças diferentes. Além disso, a rastreabilidade de Drosophila simplifica telas genéticos para ajudar a identificar novos alvos terapêuticos que podem regular o metabolismo. A fim de realizar tal tela um método simples e rápido para identificar alterações no estado metabólico de moscas é necessário. Em geral, a produção de dióxido de carbono é um bom indicador de oxidação de substrato e gasto de energia fornecendo informações sobre o estado metabólico. Neste protocolo, apresentamos um método simples de medir CO 2 saída de moscas. Esta técnica pode potencialmente auxiliar na identificação de perturbações genéticas que afectam a taxa metabólica.

A fim de mostrar que o método é sensível à medida que a produção de CO 2 a partir do tipo selvagem (Oregon R) moscas macho de 18, 25, e 29 ° C e opera mutante para Dg. As moscas foram colocadas a 25 ° C e, em seguida, deslocado para a temperatura experimental, durante 5 dias antes da medição. Tal como esperado para esta espécie ectotérmicos, a quantidade de CO 2 produzido aumentou com a temperatura (figura 2). Temos no passado mostraram que uma dieta livre de açúcar reduz a taxa metabólica de ambos tipo selvagem e mutante Dg voa 7. A perda da DG leva ao aumento dos níveis metabólicos (Figura 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Configuração para medição de produção de CO 2 em moscas. A. esquemática mostrando tele construção do respirômetro individual. B. Fotografia da câmara durante a medição de CO 2. Cartas marcar a posição do respirômetros. Números verticais indicam escala em centímetros. C. Esquema mostrando as alterações durante o experimento. A linha verde indica ponto de referência (d1), azul indica a posição final do líquido após 2 horas (d2). Δd é a distância que o líquido tenha viajado na micropipeta. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Produção de CO 2 nas moscas em diferentes temperaturas e em mutantes Dg. Temperatura da caixa se correlaciona positivamente com a produção de CO 2 em Drosophila e está significativamente aumentada em mutantes Dg. As barras de erro indicam EPM de quatro experiências individuais, *** p 0 ≤.01. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> (ML / voar x hora) </td><td> Os equipamentos utilizados </td><td> Referência </td></tr><tr><td> 2-3 CO 2 </td><td> CO 2 analisador de gás </td><td> (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2,004) </td></tr><tr><td> 4,68 ± 1,04 CO 2 </td><td> CO 2 sistema de respirometria </td><td> (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2,005) </td></tr><tr><td> 2,9-6,2 O2 </td><td> Respirômetros mesma forma projetados </td><td> (Hulbert, Clancy et al. 2,004) </td></tr><tr><td> 2,20 ± 0,15 O 2 </td><td> Descrito respirômetros aqui artesanais </td><td> (Kucherenko, Marrone et al. 2,011) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> * Valores da tabela são de estudos que relatam os valores numéricos de moscas medidos a 25 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparaçãode diferentes técnicas utilizadas para medir a produção de CO 2 por Drosophila.

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Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Distúrbios metabólicos estão entre uma das doenças mais comuns em humanos. O modelo de organismo geneticamente tratável D. melanogaster pode ser utilizado para identificar novos genes que regulam o metabolismo. Este artigo descreve um método relativamente simples, que permite estudar a taxa metabólica em moscas, medindo a sua produção de CO2.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

measurement-of-metabolic-rate-in-drosophila-using-respirometry

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

19.5K visualizações.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry.  Distúrbios metabólicos estão entre uma das doenças mais comuns em humanos. O modelo de organismo geneticamente tratável D. melanogaster pode ser utilizado para identificar novos genes que regulam o metabolismo. Este artigo descreve um método relativamente simples, que permite estudar a taxa metabólica em moscas, medindo a sua produção de CO2. 

Vídeo: Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologia

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...