Visualização da degeneração da articulação do joelho após lesão não invasiva do LCA em ratos

Fonte: Lindsey K. Lepley^1,2, Steven M. Davi¹, Timothy A. Butterfield^3,4 e Sina Shahbazmohamadi⁵,

¹ Departamento de Cinesiologia, Universidade de Connecticut, Storrs, CT; ² Departamento de Cirurgia Ortopédica, Centro de Saúde da Universidade de Connecticut, Farmington, TC; ³ Departamento de Ciências da Reabilitação, Universidade de Kentucky, Lexington, KY; ⁴ Centro de Biologia Muscular, Departamento de Fisiologia, Universidade de Kentucky, Lexington, KY; ⁵ Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Connecticut, Storrs, CT

A lesão do ligamento cruzado anterior (LCA) no joelho aumenta drasticamente o risco de osteoartrite pós-traumática (PTOA), pois aproximadamente um terço dos indivíduos demonstrará PTOA radiográfica na primeira década após a lesão da LCA. Embora a reconstrução da ACL (ACLR) restaure com sucesso a estabilidade das articulações do joelho, o ACLR e as técnicas atuais de reabilitação não impedem o aparecimento de PTOA. Portanto, a lesão da LCA representa o modelo ideal para estudar o desenvolvimento do ATOA após lesão articular traumática.

Modelos de ratos têm sido usados extensivamente para estudar o início e o efeito da lesão da LCA no PTOA. O modelo mais utilizado da lesão da LCA é a transeção ACL, que é um modelo agudo que desestabiliza cirurgicamente a articulação. Embora prático, este modelo não imita fielmente a lesão da ACL humana devido aos procedimentos invasivos e não fisiológicos de lesão que mascaram a resposta biológica nativa à lesão. Para melhorar a tradução clínica de nossos resultados, desenvolvemos recentemente um novo modelo não invasivo de lesão de LCA onde a LCA é rompida através de uma única carga de compressão tibial. Esta lesão replica de perto as condições de lesão relevantes para os seres humanos e é altamente reprodutível.

A visualização da degeneração articular através da tomografia microcomputada (μCT) proporciona vários avanços importantes sobre as técnicas tradicionais de coloração de OA, incluindo imagens 3D rápidas, de alta resolução e não destrutivas de toda a degeneração articular. O objetivo desta demonstração é introduzir a lesão de ACL não invasiva de última geração em um modelo de roedor e usar μCT para quantificar a degeneração das articulações do joelho.

A ACL é uma estrutura semelhante a uma banda de tecido contivo denso que surge do espaço intercondílar anterior da tíbia e se estende superior e lateralmente ao aspecto posterior do condíle lateral do fêmur. Estruturalmente, a LCA serve tanto como estabilizador passivo do joelho, trabalhando em conjunto com outros ligamentos, bem como musculatura da coxa para ajudar a controlar a articulação durante o movimento dinâmico. A LCA é a principal contenção ao deslocamento tibial anterior e desempenha um papel essencial na manutenção da estabilidade das articulações do joelho. Além do suporte estrutural, a LCA também atua como um caminho para informações neurais entre a articulação do joelho e o sistema nervoso central. O maior estresse na LCA ocorre quando o joelho está próximo da extensão, e é durante esse tempo que a LCA está com maior risco de lesão.

A LCA é o ligamento do joelho mais comumente ferido durante atividades relacionadas ao esporte e ao trabalho. As lesões de LCA não-contato representam quase 70% de todas as lesões da LCA, e ocorrem quando uma pessoa gera forças e/ou momentos suficientes no joelho que leva ao carregamento excessivo da LCA. Embora o mecanismo de lesão da LCA não-contato tenha sido investigado utilizando uma variedade de modelos de pesquisa (prospectivos, retrospectivos, observacionais, in vivo e in vitro),uma determinação direta de como a lesão ocorre permanece evasiva. A reconstrução da LCA é frequentemente realizada inserindo cirurgicamente uma porção dos indivíduos tendão ou tendão patelar na área da LCA. O objetivo da reconstrução cirúrgica é maximizar a estabilidade do joelho e a capacidade funcional que foram perdidas após a lesão. A reconstrução cirúrgica facilita um retorno seguro ao esporte e promove a saúde das articulações do joelho a longo prazo. No entanto, apesar dos melhores esforços de médicos e pesquisadores, quase dois terços dos pacientes com ACL reconstruídos não voltam à atividade aos 12 meses após a reconstrução e mais de 50% dos joelhos reconstruídos da ACL têm sinais radiográficos de 5-14 anos após a lesão.

Os modelos animais fornecem uma forma prática e clinicamente relevante de estudar a história natural e a resposta do tratamento à saúde articular. É importante ressaltar que o joelho de um rato tem anatomia semelhante e função aos joelhos em humanos, o que torna o joelho do rato um modelo útil para estudar PTOA após lesão da LCA. Para melhorar a tradução clínica de nossos resultados, desenvolvemos recentemente um novo modelo não invasivo de lesão da LCA, onde a LCA é rompida através de uma única carga de compressão tibial. Esta lesão replica de perto as condições de lesão relevantes para os seres humanos e é altamente reprodutível.

O dispositivo de carga consiste em duas plataformas de carregamento personalizadas (Figura 1); o estágio superior do joelho é rigidamente montado a um atuador linear (atuador linear DC L16-63-12-P, Phidgets, Alberta, CA) que posiciona o nível traseiro direito em 30°^1-3 de dorsiflexão e 100° 1 de^flexão do joelho enquanto fornece espaço para subluxação anterior da tíbia em relação ao fêmur; o estágio inferior contém o joelho flexionado e é montado diretamente acima de uma célula de carga (HDM Inc., PW6D, Southfield, MI). Durante a lesão, os ratos são anestesiados e, em seguida, o retrolimb direito é submetido a uma única carga de compressão tibial a uma velocidade de 8 mm/s.¹ Lesão de LCA é notada por uma liberação de força compressiva durante a lesão que é monitorada através de um programa personalizado (LabVIEW, National Instruments, Austin, TX). Após a lesão, a ruptura da LCA é clinicamente confirmada pelo teste de Lachman, onde o fêmur é fixado enquanto uma força anterior é aplicada na tíbia. A tradução tibial anterior excessiva indica deficiência de LCA. O hindlimb lesionado da ACL pode então ser estendido e protegido em um dispositivo impresso 3D personalizado para visualizar a degeneração da articulação do joelho. As imagens são adquiridas para caracterizar mudanças na estrutura trabecular relacionadas ao desenvolvimento do PTOA. ⁴

Figura 1: Carga compressiva tibial causando lesão isolada não invasiva da LCA.

Lesão ACL não invasiva

1. Use equipamentos de proteção pessoal adequados. Você pode usar uma máscara respiratória, mas não é obrigatório para este protocolo.
2. Anestesiar os ratos usando uma câmara de indução com 5% de isoflurano e 1 L/min de oxigênio. Mantenha o fluxo de anestesia usando através de um cone de nariz com 1 - 3% isoflurane e 500 mL/min de oxigênio. Se o aparelho não estiver configurado em uma tabela de recuo ou de rascunho, certifique-se de que o gás residuado seja retirado usando um sistema de mesa e filtros de carvão.
3. Realize uma beliscão dos dedos dos dedos para garantir que uma profundidade adequada de anestésico tenha sido atingida. Note que não é necessário aplicar lubrificante ocular o protocolo é realizado rapidamente (< 3 min) e há risco mínimo de secura da córnea.
4. Posicione o recuo direito em 30° de dorsiflexão e 100° de flexão do joelho, proporcionando espaço para subluxação anterior da tíbia em relação ao fêmur.
5. Montar rigidamente o estágio superior do joelho para um atuador linear.
6. Posicione o joelho flexionado no estágio inferior, que é montado diretamente acima de uma célula de carga.
7. Induzir lesão de LCA usando uma única carga de compressão tibial a uma velocidade de 8 mm/s.
8. A lesão da LCA é notada por uma liberação de força compressiva. Isso é monitorado através de um programa personalizado.
9. Após a lesão, enquanto o animal ainda está sob o plano de anestesia, faça um teste de Lachman para confirmar clinicamente que ocorreu uma ruptura da LCA. Um teste de Lachman é um teste clínico usado para avaliar a integridade da LCA avaliando a estabilidade do plano sagital. Ao estabilizar o fêmur, puxe a tíbia para a frente (em uma direção anterior) para avaliar a quantidade de movimento. Uma ACL intacta produzirá uma "sensação final firme" onde o pesquisador não será capaz de traduzir a tíbia para a frente. Uma ACL lesionada produzirá uma "sensação final macia ou mole", indicativo de uma LCA rasgada.
10. Palpar o fêmur e a tíbia para detectar qualquer dano ósseo grosseiro. Se não forem identificadas contraindicações, transfira o animal para sua gaiola e permita que ele se recupere. Durante esse tempo, monitore o animal para garantir que ele não exiba sinais de dor, como relutância em se mover, vocalização ou postura anormal.

μCT imagem de degeneração articular

As imagens 2D são obtidas utilizando-se configurações de scanner de 70 kV, corrente de 85,5 μA(Figura 2B). Os dados são coletados a cada etapa de rotação de 0,6° em uma resolução de 11,5 μm através de um total de 180°. As imagens transversais são reconstruídas usando um algoritmo de projeção traseira suavizada e na pilha de imagens reconstruídas(Figura 2C). A estrutura trabecular é então analisada por segmentação em software, pelo qual uma esfera de 1,53 mm está centrada na placa epífise dos platôs tibiais medial e lateral e fêmur para determinar a espessura trabecular (μm), separação trabecular (μm) e número trabecular (1/mm). ^5,6

1. Com 4 semanas de lesão pós-ACL, eutanize o rato com exposição prolongada ao CO₂ na câmara de indução.
2. Estender e proteger a cetro lesionado da ACL em um dispositivo impresso em 3D personalizado(Figura 2A).
3. Adquira imagens usando μCT.
4. Obtenha radiografias do plano frontal para determinar o espaço articular. estreitamento (entre o condíle femoral e o planalto tibial [medido em mm]) em comparação com o membro não ferido.
5. Obtenha imagens 2D usando as seguintes configurações do scanner: 70 kV e corrente de 85,5 μA.
6. Colete os dados a cada passo de rotação de 0,6° em um tamanho de pixel de 11,5 μm através de um total de 180°.
7. Reconstrua imagens transversais usando um algoritmo de projeção traseira suavizada na pilha de imagens reconstruídas.
8. Para garantir que uma região de interesse consistente seja medida, coloque uma esfera de 1,53 mm na placa epífise dos platôs tibiais medial e lateral e fêmur para determinar a espessura trabecular (μm), separação trabecular (μm) e número trabecular (1/mm).

Figura 2: A) Dispositivo impresso personalizado para segurar o cetão traseiro durante as imagens μCT, B) 2D e C) 3-D μCT.

Número trabecular menor, espessura trabecular reduzida e maior espaçamento trabecular, todas as características marcantes do início do PTOA, foram evidentes 4 semanas após o rasgo de LCA não invasivo(Tabela 1 e Figura 3). Uma imagem de uma LCA dissecada de membro saudável versus um membro ferido agudo é mostrada na Figura 5. O novo modelo não invasivo da lesão da LCA, onde a LCA é rompida através de uma única carga de compressão tibial, foi capaz de produzir uma ruptura proximal isolada da ACL.

Figura 3: Imagem μCT reconstruída em 3D de uma lesão aguda de LCA (esquerda) e 4 semanas após lesão de LCA (direita) em um rato.

Tabela 1: Medições características do início do PTOA.

Figura 4: Imagem de um membro ACL ferido agudo (esquerda) e imagem de LCA intacta e saudável (direita).

Este vídeo demonstra como um atuador linear pode ser usado para produzir uma ruptura isolada não invasiva da LCA em ratos. Esta lesão replica de perto as condições de lesão relevantes para os seres humanos e é altamente reprodutível. Para superar várias das principais limitações das técnicas tradicionais de coloração OA, este método utiliza μCT para quantificar toda a degeneração articular e estrutura trabecular.

Intervenções baseadas em evidências para melhorar os resultados de reabilitação musculoesqueléticos são uma área altamente significativa que pouco mudou nas últimas duas décadas, embora avanços significativos na biologia básica tenham sugerido que as alterações nos protocolos de reabilitação estão muito atrasadas. A questão é que especialistas em reabilitação clássica têm usado relatórios anedóticos para moldar a prática clínica em vez de ciência básica para fornecer hipóteses informadas que são testadas em organismos modelo antes da tradução para a clínica. Os procedimentos descritos aqui fornecem aos cientistas um método para replicar de perto uma lesão articular traumática que é relevante para os seres humanos e usar μCT para acompanhar a progressão da saúde articular.

Lista de materiais:

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2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
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