Imageamento de fluorescência de infravermelho próximo de aneurismas da aorta abdominal

Fonte: Arvin H. Soepriatna¹, Kelsey A. Bullens², e Craig J. Goergen¹

¹ Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana

² Departamento de Bioquímica, Universidade Purdue, West Lafayette, Indiana

A imagem de fluorescência quase infravermelha (NIRF) é uma técnica óptica excitante que utiliza sondas fluorescentes para visualizar conjuntos biomoleculares complexos em tecidos. A imagem NIRF tem muitas vantagens sobre os métodos convencionais de imagem para imagens não invasivas de doenças. Ao contrário da tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e tomografia de emissão de pósitrons (PET), a imagem NIRF é rápida, de alto rendimento e não envolve radiação ionizante. Além disso, desenvolvimentos recentes em sondas fluorescentes específicas e ativadas da engenharia fornecem ao NIRF alta especificidade e sensibilidade, tornando-se uma modalidade atraente no estudo de câncer e doenças cardiovasculares. O procedimento apresentado visa demonstrar os princípios por trás da imagem NIRF e como realizar experimentos in vivo e ex vivo em pequenos animais para estudar uma variedade de doenças. O exemplo específico mostrado aqui emprega uma sonda fluorescente ativante para a matriz metaloproteinase-2 (MMP2) para estudar sua absorção em dois modelos diferentes de roedores de aneurismas de aoórtico abdominal (AAAs).

Como o nome sugere, a imagem NIRF utiliza a luz dentro da primeira janela quase infravermelha, variando de 650 nm a 900 nm, para entregar fótons no tecido. A energia, E, de um fóton é caracterizada pela Equação 1, onde h é a constante do Planck, c é a velocidade da luz em um vácuo, e λ é o comprimento de onda da luz.

= (Equação 1)

Moléculas fluorescentes específicas do alvo chamadas fluoroforos são tipicamente introduzidas no animal através de engenharia genética ou através de injeção de veias da cauda antes da imagem. Esses fluoroforos absorvem energia de fótons, o que eleva a energia das moléculas do estado terrestre, S_0,para o estado instável e animado S₁'. Devido à instabilidade do estado S_1,as moléculas relaxam para o menor nível de energia vibracional dentro desse estado e liberam energia na forma de calor. Os fluoroforos, agora no estado relaxado e animado S_1,retornam ao estado terrestre S_0,emitindo luz em um comprimento de onda específico. A luz emitida, que tem um comprimento de onda mais longo devido à dissipação de energia na forma de calor, é então capturada e registrada usando um sistema de imagem de fluorescência. A mudança fundamental entre os espectros de absorção e emissão é chamada de mudança de Stokes e é importante, pois torna possível diferenciar entre a excitação e a luz de emissão.

O procedimento a seguir fornece etapas detalhadas necessárias para coletar imagens in vivo e ex vivo NIRF de pequenos animais:

1. Configuração experimental

1. Conecte uma fonte de luz de fibra óptica ao sistema de imagem de fluorescência usando um guia de luz de fibra óptica.
2. Selecione o filtro de excitação apropriado para o experimento. O filtro de excitação determina o comprimento de onda da luz a ser entregue à amostra e deve ser escolhido para corresponder ao espectro de excitação do fluoróforo introduzido na amostra.
3. Selecione o filtro de emissão apropriado. O filtro de emissão bloqueia componentes espectrais indesejados, que podem ser atribuídos à autofluorescência, e devem ser escolhidos para corresponder ao espectro de emissões do fluoróforo.

2. Preparação da amostra

1. In vivo
   1. Anestesiar o animal em uma câmara de indução usando isoflurano a uma concentração de 3-4% no mostrador do esvoaçante.
   2. Transfira o animal para um cone de nariz fixado no estágio de imagem, e mantenha o isoflurane em uma concentração de 1-2%. Uma fonte de calor não é necessária porque os animais são tipicamente apenas imagens por um curto período de tempo (> 5 min), e sua temperatura corporal não diminui substancialmente.
   3. Proteja as patas do animal para minimizar os artefatos de movimento. Remova o cabelo da região de interesse aplicando um creme depilatório.
   4. Aplique creme depilatório na menor área necessária. Depois dos 30, limpe-o com uma gaze. Limpe a área uma segunda vez com uma almofada de gaze umedeçada com álcool etílico para remover completamente o creme depilatório.
   5. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar a secagem das córneas.
   6. Injete a sonda molecular fluorescente ativada no animal. Para esta aplicação específica, as sondas ativaveis MMP2 foram injetadas por via intravenosa na veia traseira. Neste ponto, o mouse pode ser imageado. Proceda ao "Acquistion de Imagem" deste protocolo para continuar. Monitore o animal para respirar regularmente durante todo o breve procedimento.
2. Ex Vivo
   1. Após a injeção da sonda fluorescente, eutanásia o animal de forma humana de acordo com as Diretrizes avma 2013 para a eutanásia dos animais. A overdose de dióxido de carbono (CO₂₎é uma prática padrão para eutanásia de pequenos animais.
   2. Extrair cirurgicamente o tecido ou órgão de interesse e remover cuidadosamente o excesso de tecido adiposo com fórceps.
   3. Enxágüe o tecido em soro fisiológico tamponado para remover o sangue residual e coloque a amostra diretamente no estágio de imagem.

3. Aquisição de Imagens

1. Abra o software de imagem molecular e ligue tanto a fonte de luz de fibra óptica quanto o sistema de imagem de fluorescência.
2. Abra a janela de aquisição e especifique o tipo de exposição apropriada para o estudo. As exposições disponíveis incluem: Exposição padrão para capturar uma única imagem, Exposição de Lapso de Tempo para capturar uma série de imagens durante um intervalo de tempo fixo e Exposição Progressiva para capturar uma sequência contínua de exposições em diferentes momentos de exposição.
3. Selecione UV-Transillumination como a fonte de iluminação.
4. Usando a imagem visualizada como referência, ajuste o foco da lente, o campo de visão e a abertura f-stop/aperture na câmara do sistema de captura para otimizar a qualidade da imagem amostrada. Ajuste o tempo de exposição e a posição da amostra.
5. Feche a janela de visualização e certifique-se de que todos os parâmetros na janela de aquisição correspondam às configurações da câmera e do filtro.
6. Clique em 'Expor' para adquirir e salvar a imagem.
7. O software de imagem molecular padrão normalmente fornece uma variedade de ferramentas analíticas, de medição e de correção de imagem para quantificar sinais de fluorescência para análise de imagens.
8. No final da sessão de imagem, remova a amostra/animal, desligue o sistema e limpe o estágio de imagem para minimizar os danos ao sistema.

As imagens representativas in vivo e ex vivo NIRF tiradas de roedores com aneurismas de aoórtico abdominal (AAAs) são mostradas nas Figuras 1-2. Uma sonda fluorescente ativada foi injetada sistematicamente através da veia traseira para visualizar a atividade da matriz metaloproteinase-2 (MMP2). MMP2 é uma enzima elastolítica envolvida na degradação da matriz extracelular que desempenha um papel importante na iniciação e progressão do AAA. Todas as imagens foram adquiridas utilizando um filtro de excitação de 625 nm, um filtro de emissão de 700 nm e um tempo de exposição de 60 segundos.

Figura 1: Um representante in vivo NIRF imagem de um rato deficiente e apolipoproteína que desenvolveu um AAA após infusão de angiotensina-II. A maioria das pequenas manchas que mostram sinal alto são de autofluorescência de pele (setas amarelas). A vasculatura pode ser visualizada como estruturas tubulares com sinais de alta fluorescência (seta vermelha). Barra de escala: 1 cm.

A Figura 2 mostra um aumento da atividade MMP2 na região aneurismal da aorta abdominal, como visto pelo aumento observado na intensidade do sinal em relação às regiões saudáveis da aorta abdominal. Este resultado é consistente com os resultados na literatura que mostram níveis elevados de MMP2 dentro dos AAAs. O excesso de sondas fluorescentes foi filtrado e acumulado nos rins, levando a sinais fluorescentes brilhantes.

Figura 2: Imagens nirf de AAAs de dois modelos animais diferentes: (A) um AAA suprarenal em apolipoprotein-E deficiente angiotensin II e (B) um AAA infra-alo em rato infundido com elastase pancreática porcina. Setas amarelas apontam para os AAAs. Barras de escala: 3 mm.

A imagem NIRF conta com sondas fluorescentes para quantificar e visualizar conjuntos biomoleculares em tecidos. A energia de fóton absorvida da luz infravermelha excita moléculas fluorescentes a um estado de energia mais alta, e a luz emitida com um comprimento de onda característico mais longo é capturada por um sistema de imagem de fluorescência. Aqui, foi demonstrada a aplicação de imagens NIRF para estudar atividade MMP2 em aneurismas abdominais de ao sótão in vivo. Ao contrário do SPECT ou PET, que são considerados os padrões de ouro no estudo de processos metabólicos no corpo de forma não invasiva, a imagem NIRF é uma técnica de imagem rápida e de alto rendimento que não envolve radiação ionizante. Uma das limitações dessa modalidade é sua profundidade de penetração relativamente pequena. Embora essa limitação torne a imagem clínica de tecidos profundos desafiadora, a imagem do NIRF desempenha um papel importante no estudo de tumores e doenças cardiovasculares em animais de pequeno porte.

Dada a sonda fluorescente apropriada, muitas estruturas moleculares podem ser visualizadas usando os procedimentos de imagem NIRF apresentados para estudar tanto a iniciação da doença quanto a progressão em pequenos modelos animais. Aplicações específicas ex vivo e in vivo incluem 1) avaliação da atividade de MMP na vasculatura de roedores, 2) detecção precoce de tumores em diferentes tipos de cânceres, e 3) avaliação de farmacocinética nanopartícula e biodistribuição para aplicações terapêuticas. Além do aumento da atividade de MMP2 dentro dos AAAs, outras sondas fluorescentes MMP foram utilizadas para estudar a progressão da aterosclerose e para caracterizar a composição da matriz extracelular cardíaca após um infarto do miocárdio. Além disso, o fluorofora verde indocyanine tem sido usado para estudar a perfusão de tecido em modelos murinos de isquemia hindlimb. Para elaborar mais sobre a aplicação de imagens DE NIRF na detecção precoce do câncer, os corantes NIRF direcionados ao tumor podem ser usados para avaliar as margens tumorais e auxiliar nos procedimentos de ressecção. A integração de fluoroforos quase infravermelhos em nanopartículas desenvolvidas para a entrega de medicamentos permite que os cientistas desenvolvam terapêuticas mais eficazes baseadas em nanopartículas para uma variedade de doenças. Por fim, a capacidade de localizar espacialmente o sinal fluorescente em animais inteiros ou tecido intacto é uma clara vantagem sobre outros ensaios enzimáticos convencionais (zymografia de gel) e análise de proteínas (mancha ocidental) que exige que os animais sejam sacrificados e tecidos sejam homogeneizados.