Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Um protocolo foi desenvolvido para a preparação de mitocôndrias purificadas a partir de células microgliais, isolamento de proteínas mitocondriais para liberação de N-glicanos e detecção rápida de glicanos mitocondriais subcelulares usando ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha acoplada a espectrometria de massa de analisador de massa precisa de alta resolução.

Compreender os padrões de glicosilação das proteínas mitocondriais na microglia é fundamental para determinar seu papel em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos uma metodologia nova e de alto rendimento para análise glicômica de proteínas mitocondriais isoladas de microglia cultivada. Este método envolve o isolamento de mitocôndrias de culturas microgliais, avaliação da qualidade de amostras mitocondriais, seguida por uma extração de proteína otimizada para maximizar a detecção de glicanos e espectrometria de massa precisa de alta resolução (HRAM) de ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha (IR-MALDESI) para fornecer perfis detalhados de glicosilação mitocondrial.

Este protocolo enfatiza a importância de manter a integridade mitocondrial durante o isolamento e emprega um rigoroso controle de qualidade para garantir a reprodutibilidade, incluindo a medição da pureza mitocondrial após a extração. Essa abordagem permite o perfil abrangente das alterações de glicosilação nas mitocôndrias microgliais sob várias condições experimentais in vitro, o que oferece informações sobre as alterações mitocondriais associadas a doenças neurodegenerativas. Essa abordagem pode ser adaptada a outros tratamentos in vitro , outros tipos de células cultivadas ou células primárias. Por meio dessa abordagem padronizada, pretendemos avançar na compreensão dos glicanos mitocondriais microgliais, contribuindo para o campo mais amplo da pesquisa neurodegenerativa.

A microglia é a célula imune inata residente dominante no cérebro e representa 10-15% das células do cérebro adulto ^1,2. Eles usam seu repertório de receptores para monitorar dinamicamente o microambiente cerebral e regular a função cerebral normal para manter a homeostase cerebral³. As microglias são muito sensíveis às mudanças em seu microambiente e sofrem alterações na morfologia celular, imunofenótipo e função com condições patológicas ou vários estímulos. Os estados de ativação microglial são influenciados pelas demandas de energia celular necessárias para sua função, como fagocitose, produção de citocinas ou reparo tecidual. Portanto, o metabolismo energético celular desempenha um papel crucial na regulação das mudanças na função microglial⁴. A desregulação microglial leva à liberação excessiva de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-1β, TNF-α) e espécies reativas de oxigênio (ROS), predispondo o cérebro à neuroinflamação ^5,6. A desregulação microglial crônica e o ambiente neuroinflamatório resultante estabelecem uma base para a neurodegeneração⁷.

O cérebro é responsável por apenas 2% do peso corporal, mas 20% do consumo total de energia do corpo. As mitocôndrias são a principal fonte de energia nas células cerebrais e atuam como atores-chave na patogênese de distúrbios cerebrais agudos e crônicos⁸. Estudos anteriores estabeleceram uma forte correlação entre a ativação microglial e a disfunção metabólica no^{envelhecimento9} e distúrbios relacionados à idade, como a doença de ^{Alzheimer10,11}, destacando o papel fundamental das mitocôndrias na senescência celular e neurodegeneração. A função mitocondrial prejudicada leva à diminuição da produção de energia, estresse oxidativo elevado e aumento da neuroinflamação durante o envelhecimento e doenças relacionadas à idade.

Embora uma extensa pesquisa tenha elucidado o papel das mitocôndrias no metabolismo energético, envelhecimento e distúrbios cerebrais, o papel das modificações pós-traducionais comuns, como a glicosilação, na biologia e função mitocondrial permanece insuficientemente explorado. A glicosilação, a adição enzimática de porções de açúcar chamadas glicanos às proteínas por enzimas de glicosilação, é a modificação pós-traducional mais comum na maioria das células cerebrais, incluindo a microglia. A microglia ativada modula sua função imunológica sob estímulos inflamatórios, regulando a expressão intracelular ou de glicanos na superfície celular¹². As respostas pró e anti-inflamatórias exibidas pela microglia pós-estimulação também são reguladas pelos glicanos¹³. As proteínas mitocondriais também possuem essas modificações de glicano, que regulam sua função e localização. No entanto, falta uma análise detalhada dos padrões de glicosilação mitocondrial específicos da célula na microglia devido aos desafios técnicos na investigação da glicosilação subcelular. Apesar dos papéis bem caracterizados da glicosilação na modulação do fenótipo microglial, o papel dos glicanos na modulação da função mitocondrial e, subsequentemente, do imunofenótipo celular na microglia permanece pouco compreendido.

Estudos limitados que investigam a glicosilação de proteínas mitocondriais se concentraram principalmente na identificação baseada em lectina de padrões de glicosilação. As lectinas são proteínas de ligação ao glicano que se ligam a porções biomoleculares de glicanos^14,15, que carecem de especificidade e capacidade de fornecer informações detalhadas sobre a composição do glicano. As modalidades de espectrometria de massa oferecem uma identificação detalhada das composições de glicanos para superar os desafios analíticos apresentados pela análise de lectinas. Uma dessas modalidades, a ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha (IR-MALDESI), emprega uma estratégia de ionização híbrida, usando um laser de infravermelho médio para excitar ressonantemente a água encontrada em espécimes biológicos¹⁶ para dessorver as espécies neutras e submetê-las a uma pluma de eletrospray ortogonal, seguida de análise usando um espectrômetro de massa Orbitrap de massa preciso de alta resolução. O IR-MALDESI foi demonstrado anteriormente para a análise direta de metabólitos teciduais¹⁷, com vantagens distintas de análise rápida¹⁸, método de ionização suave e previsibilidade do conteúdo de ácido siálico de glicanos ligados a N com base nos padrões de distribuição isotópica de adutos de glicanos clorados¹⁹. No entanto, a adaptação desta plataforma para a análise direta de glicanos subcelulares não foi demonstrada.

Aqui, relatamos um protocolo de alto rendimento para isolamento mitocondrial de células microgliais, isolamento de N-glicanos mitocondriais e detecção e análise de N-glicanos mitocondriais usando espectrometria de massa IR-MALDESI. Este protocolo será fundamental para descobrir novos insights sobre o papel da glicosilação na função mitocondrial, potencialmente identificando novos alvos terapêuticos para distúrbios neuroinflamatórios e neurodegenerativos.

1. Cultura de linha celular microglial BV2

1. Manter as células BV-2 (células microgliais derivadas de camundongos C57BL/6) em meio DMEM com baixo teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de Penicillium-estreptomicina (PenStrep) e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA).
2. Cultive as células em frascos T-175 e permita que atinjam 70-80% de confluência.
3. Divida as células incubando com as enzimas de dissociação celular por 5 min a 37 ° C em 5% de CO₂, seguido de inativação das enzimas com um volume igual de meio celular e centrifugação das células por 5 min a 500 × g à temperatura ambiente (RT).
   NOTA: As enzimas de dissociação celular usadas aqui são mais suaves para as células BV2 do que a tripsina e podem ser usadas para proteger a expressão do antígeno da superfície celular.
4. Aspire o meio, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de crescimento e conte as células usando azul de tripano (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Usamos um contador de células automatizado para esta etapa para contar células.
5. Para realizar o isolamento mitocondrial, proceda se o pellet celular contiver 2 × 10⁷ (20 milhões de células/pellet).

2. Isolamento de mitocôndrias de células microgliais

NOTA: Trabalhe rapidamente, mantendo tudo no gelo durante todo o procedimento. O kit de isolamento mitocondrial usado para isolamento mitocondrial tem três componentes: Reagentes A (tampão de lise celular), Reagente B (tampão estabilizador) e Reagente C (tampão de lavagem mitocondrial). Adicione inibidores de protease ao reagente A e ao reagente C imediatamente antes de usar.

1. Pellet 2 × 10⁷ células centrifugando as células colhidas em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL a 500 × g por 5 min. Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
2. Adicione 800 μL de reagente de isolamento mitocondrial A (tampão de lise celular), vórtice em velocidade média por 5 s e incube o tubo no gelo por exatamente 2 min.
   NOTA: Não exceda a incubação de 2 min.
3. Adicione 10 μL de reagente de isolamento mitocondrial B (tampão estabilizador), vórtice na velocidade máxima por 5 s e incube o tubo no gelo por 5 min, vórtice na velocidade máxima a cada minuto.
4. Adicione 800 μL de reagente de isolamento de mitocôndrias C (tampão de lavagem mitocondrial), inverta o tubo várias vezes para misturar e centrifugue o tubo a 700 × g por 10 min a 4 ° C.
   NOTA: Não vórtice.
5. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 ml e centrifugue a 3.000 × g durante 15 min a 4 °C.
6. Transfira o sobrenadante (porções citosólicas) para um novo tubo. O pellet contém as mitocôndrias isoladas.
7. Adicione 500 μL de reagente de isolamento de mitocôndrias C ao pellet e centrifugue a 12.000 × g por 5 min.
8. Utilizar o pellet para quantificação e processamento de proteínas ou conservá-lo a -80 °C até nova utilização.

3. Estimação de proteínas usando o ensaio microBCA

NOTA: A estimativa de proteínas para este protocolo pode ser realizada usando diferentes reagentes e ensaios. A quantificação de proteínas citosólicas ou mitocondriais pode ser realizada normalizando em relação à concentração total de proteínas usada no ensaio.

1. Preparar padrões de albumina de soro bovino (BSA) entre 0 μg/mL e 200 μg/mL (0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) e brancos apenas com tampão de lise.
2. Adicione 150 μL de cada padrão na placa de fundo plano de 96 poços contendo as amostras.
3. Misture 25 partes de Micro BCA Reagent MA (solução de ácido bicinconínico (BCA)) e 24 partes de Reagente MB (solução de sulfato de cobre) com 1 parte de Reagente MC (tampão estabilizador) (25:24:1, Reagentes MA:MB:MC) para criar um reagente funcional. Adicione 150 μL do reagente BCA misto a cada amostra e padrão.
4. Incubar a 37 °C durante 2 h.
5. Utilizar um leitor de placas para medir a absorvância a 562 nm e quantificar a concentração de proteínas com a curva-padrão. Subtraia a absorbância padrão em branco da medição de absorbância de todos os outros padrões individuais e réplicas de amostras desconhecidas para obter as concentrações de proteínas da amostra.

4. Controle de qualidade da preparação mitocondrial (western blot)

1. Ressuspenda o pellet mitocondrial no tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) para realizar a quantificação de proteínas. Determine a concentração de proteína para cada amostra usando o ensaio micro BCA.
2. Desnaturar as amostras em tampão de amostra a 94 ^oC por 5 min.
3. Carregue quantidades iguais (20 μg) de proteína mitocondrial em géis pré-moldados (consulte a Tabela de Materiais), juntamente com o marcador de peso molecular.
4. Execute o gel por 50 min a 100 V.
   NOTA: O tempo de execução pode variar, portanto, certifique-se de parar o gel quando as proteínas atingirem o final do gel indicado pelo corante no tampão de amostra.
5. Transfira as proteínas do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando o protocolo de transferência a seco em um sistema de transferência de western blot por 7 min a 20 V.
6. Retirar a membrana e bloquear com a solução de bloqueio (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
7. Adicione diluições apropriadas de anticorpo primário à membrana no tampão de bloqueio durante a noite a 4 ^oC (COXIV = 1: 3.000, GAPDH = 1: 3.000).
   NOTA: A ausência de contaminação nuclear do retículo endoplasmático (ER) na preparação mitocondrial pode ser testada usando marcadores adicionais como lamina (marcador nuclear) e ERp57 (marcador ER) em western blots.
8. Lave a membrana por 3 x 15 min com o tampão de lavagem (Tabela 1).
9. Incubar a membrana com a diluição apropriada de anticorpo secundário conjugado com HRP em tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 1 h
10. Lave a membrana por 3 x 15 min com o tampão de lavagem.
11. Para o desenvolvimento, use um kit de substrato quimioluminescente.
12. Escaneie a membrana usando um gel e um gerador de imagens de membrana.

5. Isolamento de proteína mitocondrial para extração de N-glicano da microglia

1. Ressuspenda as mitocôndrias isoladas em 50 μL de tampão de isolamento de proteína (Tabela 1) e deixe no gelo por 20 min.
2. Aspirar e dispensar três vezes e deixar 20 min no gelo (vórtice antes de usar). Se o pellet mitocondrial não estiver totalmente solubilizado, adicione mais 50 μL do tampão de isolamento e agrupe no mesmo tubo.
3. Centrifugue a 13.000 × g por 10 min.
4. Recuperar o sobrenadante, congelar a -80 ^°C durante um mínimo de 1 h e secar o máximo possível num concentrador de vácuo.
5. Ressuspenda antes do isolamento do glicano usando o tampão de digestão PNGase (Tabela 1) para IR-MALDESI.

6. Preparação mitocondrial de N-glicano para IR-MALDESI

1. Carregue 25-250 μg de proteína (em volume máximo de 250 μL) de proteínas mitocondriais isoladas em um filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa.
2. Reduza as amostras de proteína para expor as porções de glicano adicionando 2 μL de ditiotreitol 1 M (DTT) a cada amostra no filtro.
3. Diluir a amostra com 200 μL de tampão de digestão PNGase e vórtice levemente para evitar perturbar o filtro.
4. Desnaturar as proteínas mitocondriais incubando a amostra a 56 °C durante 30 min.
5. Use 50 μL de iodoacetamida 1 M para alquilar as mitocôndrias para obter uma concentração final de ~ 200 mM e incube a 37 ° C por 60 min.
6. Para concentrar ainda mais os métodos mitocondriais desnaturados, centrifugue as amostras a 14.000 × g por 40 min. Descarte o fluxo.
7. Lave a amostra com 100 μL de tampão de digestão PNGase.
8. Concentrar a glicoproteína no filtro a 14.000 × g durante 20 min e rejeitar o fluxo. Repita a etapa de lavagem e concentração 2x, para um total de 3x, produzindo um concentrado no volume morto do filtro (~ 5 μL). Descarte todo o fluxo.
9. Descarte o frasco de coleta assim que as lavagens estiverem concluídas. Use um novo frasco de coleta para todos os eluentes e lavagens futuras.
10. Para clivar os glicanos de glicopadrões mitocondriais desnaturados, transfira para um frasco de coleta fresco e adicione 2 μL de PNGase livre de glicerol (75.000 unidades / mL) ao filtro. Adicione 98 μL de tampão de digestão PNGase, elevando o volume total para 100 μL e misture pipetando suavemente para cima e para baixo no filtro.
11. Incubar amostras a 37 °C durante 18 h para clivar enzimaticamente todos os N-glicanos das proteínas mitocondriais.
12. Eluir os N-glicanos mitocondriais libertados centrifugando a amostra a 14.000 × g durante 20 min a 20 °C.
13. Lave os glicanos mitocondriais adicionando 100 μL de tampão de digestão PNGase ao filtro e centrifugue a 14.000 × g por 20 min a 20 ° C. Recolher a lavagem que contém os N-glicanos restantes no mesmo frasco para injetáveis de recolha que o eluente. Repita 2x e remova o filtro do frasco de coleta.
14. Incubar as amostras de glicano mitocondrial no freezer a -80 ° C até congelar (30-60 min) e secar até a conclusão à temperatura ambiente em um concentrador a vácuo (4-6 h para 400 μL).
    NOTA: Os N-glicanos podem ser armazenados a -20 °C até 6 meses antes da análise.
15. Ressuspenda os glicanos ligados a N secos em 50 μL de água de grau LC/MS diretamente antes da análise IR-MALDESI.

7. Detecção de glicanos liberados por espectrometria de massa IR-MALDESI

1. Realize a calibração de massa a cada dia do experimento. Carregue a solução de calibração em uma bomba de seringa e empurre-a a uma taxa de 1.2 μL/min. Aplique uma tensão de 3,5 kV para obter uma pluma de eletrospray estável para calibração de massa nos modos positivo e negativo.
2. Pipete 5 μL de glicanos mitocondriais ressuspensos em um ponto de amostra em uma lâmina de micropoço de Teflon.
3. Use um laser de infravermelho médio operando em um comprimento de onda de 2,97 μm para ablação com uma energia de 1,8 mJ por rajada.
4. Ionize e detecte N-glicanos no modo de ionização negativa. Use solvente de eletrospray consistindo de 60% de acetonitrila e ácido acético 1 mM para criar uma pluma de eletrospray estável com uma taxa de fluxo de 2 μL / min a uma tensão de 3.2 kV.
5. Para realizar a análise, acople o IR-MALDESI a um espectrômetro de massa HRAM ajustado para um poder de resolução de massa de 240.000_FWHM a m / z 200, analisando entre 500 e 2.000 m / z no modo de ionização negativa.
6. Desligue o controle automático de ganho (AGC) e defina um tempo de injeção fixo de 90 ms. Use a fonte EasyIC para calibração interna em tempo real de cada espectro para obter alta precisão de medição de massa (MMA).

8. Análise de dados de N-glicano mitocondrial

1. Identifique manualmente os glicanos ligados a N pesquisando massas monoisotópicas e confirmando distribuições isotópicas usando o espaçamento m/z para determinar íons duplamente e triplamente carregados que têm um limite mínimo de fluxo de íons de 1.000 íons/s.
2. Converta os espectros de massa bruta de razões m / z em massas monoisotópicas neutras.
3. Carregue as massas monoisotópicas em uma ferramenta de previsão de estrutura de oligossacarídeos on-line para determinar possíveis composições de glicanos. Confirme as anotações usando um banco de dados glicômico com curadoria experimental²⁰; certifique-se de que cada identificação esteja dentro da margem de 2,5 ppm de MMA, contenha a estrutura central de glicanos ligados a N (Hex₃HexNAc₂) e exclua monossacarídeos de pentose, KDN ou HexA.
4. Desenhe as estruturas de glicano confirmadas usando a nomenclatura SNFG²¹.
5. Obtenha a abundância relativa de glicanos dos espectros de massa bruta e normalize contra a quantidade de proteína mitocondrial em μg para obter íons / s / μg.
6. Use a análise qui-quadrado para testar a qualidade do ajuste entre as distribuições teóricas e experimentais dos glicanos ligados a N para determinar o número de adutos de cloro. Isso permite a determinação direta do número de ácidos siálicos¹⁹.

A Figura 1 representa um esboço esquemático das etapas envolvidas no isolamento das mitocôndrias da linha celular microglial BV2 para análise de glicano por espectrometria de massa. A reprodutibilidade do isolamento da proteína mitocondrial entre diferentes preparações mitocondriais a partir da mesma densidade inicial das células microgliais está representada na Figura 2, que não mostra diferença significativa entre a concentração de proteína mitocondrial estimada usando o ensaio de micro BCA.

A Figura 3 representa a pureza dos isolamentos mitocondriais usando a análise de western blot de COX IV e GAPDH. Aqui, vemos a expressão da proteína mitocondrial COX IV na fração mitocondrial isolada na etapa final do isolamento baseado em reagente usado no protocolo. Os immunoblots mostram uma banda COX IV proeminente na fração mitocondrial isolada, enquanto o GAPDH só é detectado na fração citoplasmática na mesma exposição. Tempos de exposição mais longos podem resultar na detecção de uma banda GAPDH fraca. A expressão do marcador não-mitocondrial GAPDH é evidente no lisado celular inteiro após o isolamento das mitocôndrias, sem as bandas CoxIV, indicando um isolamento completo da fração mitocondrial e contaminação não-mitocondrial mínima. A expressão de COX IV nas frações mitocondriais é consistente entre diferentes preparações com densidade celular inicial semelhante de 2 × 10⁷ células.

Espectros de massa representativos dos N-glicanos liberados detectados usando IR-MALDESI na Figura 4 mostram a presença de vários N-glicanos carregados fosforilados, sulfatados e sialilados liberados do extrato de proteína mitocondrial usando o tratamento com PNGase. A Tabela 2 relata todas as composições de glicanos que foram identificadas em todos os espectros, mas não foram relatadas no GlyConnect. Os valores qui-quadrado testando uma qualidade de ajuste confirmam a detecção de glicanos ligados a N com um e dois adutos de cloro, confirmando a detecção dessas composições de glicanos usando IR-MALDESI na Figura 5.

Figura 1: Esboço do protocolo. Esboço esquemático do isolamento mitocondrial, controle de qualidade, extração de proteínas, liberação de N-glicanos e estimativa usando espectrometria de massa IR-MALDESI HRAM da linha celular microglial BV2 para detecção de alto rendimento de N-glicanos mitocondriais. Abreviatura: IR-MALDESI HRAM = Analisador de Massa Preciso de Alta Resolução de Ionização por Eletrospray Assistido por Matriz Infravermelha por Matriz Laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Isolamento de proteína mitocondrial de células BV2. (A) Curva padrão para ensaio de micro BCA usando diferentes concentrações de BSA. (B) Reprodutibilidade do isolamento de proteína mitocondrial representado por conteúdo proteico consistente de 2 × 10⁷ células em seis preparações mitocondriais independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Pureza da preparação mitocondrial. Western blot representativo para fração citoplasmática, bem como mitocôndrias isoladas de células microgliais BV2. A figura representa o immunoblotting da fração citoplasmática e das mitocôndrias isoladas com o anticorpo COX IV (marcador mitocondrial) e o anticorpo GAPDH (controle citoplasmático). A ausência de bandas GAPDH nas mitocôndrias isoladas indica contaminação cruzada mínima e a pureza da preparação mitocondrial para análise subsequente de N-glicanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Determinação da composição da identificação mitocondrial de N-glicanos usando espectrometria de massa IR-MALDESI HRAM. Espectros de massa de glicanos na faixa de 1.700-2.000 m/z mostrando um número significativo de picos de carga múltipla com as estruturas anotadas determinadas usando Glycomod. Abreviatura: IR-MALDESI HRAM = Analisador de Massa Preciso de Alta Resolução de Ionização por Eletrospray Assistido por Matriz Infravermelha por Matriz Laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Verificação dos N-glicanos mitocondriais detectados. Distribuições isotópicas representativas para quatro glicanos mitocondriais ligados a N (AD) mostrando uma sobreposição da distribuição observada com distribuições teóricas de cloro e adutos desprotonados. Os valores qui-quadrado nos espectros sobrepostos representam a qualidade do ajuste e confirmam a detecção de glicanos ligados a N com um e dois adutos de cloro. Esta é mais uma confirmação da detecção dessas composições de glicanos usando IR-MALDESI. Abreviatura: IR-MALDESI = ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Receitas de solução e tampão usadas no protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Glicanos ligados a N desprotonados carregados de forma múltipla detectados nas mitocôndrias com alta precisão de medição de massa em Glycomod. Notação abreviada de glicano: H = hexose; N = N-acetilglucosamina; F = fucose; S = ácido N-acetilneuramínico; Phos = fosfato; Sulph = modificação do sulfato. Clique aqui para baixar esta tabela.

A microglia são as células imunes residentes do cérebro, e as modificações do glicano modulam o imunofenótipo e a função da microglia. Essas funções imunológicas demandam energia celular substancial, que é predominantemente fornecida pelas mitocôndrias. Notavelmente, as proteínas mitocondriais também apresentam modificações de glicanos, que permaneceram significativamente pouco estudadas devido aos desafios tecnológicos na investigação da glicosilação subcelular. A maioria dos estudos que investigam a glicosilação mitocondrial depende da identificação baseada em lectinas de padrões de glicanos²², embora essas abordagens sejam limitadas pela baixa especificidade de ligação das lectinas. Os avanços essenciais da abordagem técnica apresentada neste estudo são i) isolamento reprodutível de N-glicanos mitocondriais a partir de células microgliais e ii) detecção e identificação de N-glicanos mitocondriais usando espectrometria de massa IR-MALDESI HRAM. O fluxo de trabalho descrito aqui é o primeiro relatório da detecção de N-glicanos liberados de glicoproteínas mitocondriais expressas em níveis fisiológicos em células microgliais.

No presente protocolo, o isolamento mitocondrial é maximizado usando o método de isolamento baseado em reagente. Isso pode ser combinado com o método de homogeneização Dounce para melhorar o rendimento mitocondrial. Uma desvantagem do uso do homogeneizador em comparação com o isolamento baseado em reagente é a variação na força e velocidade do pilão entre os operadores, o que resulta em maior variação experimental e reprodutibilidade reduzida. Estudos anteriores^23,24 indicaram o uso desse método e a ausência de marcadores nucleares (lamina, histona H3) e ER (calnexina, Erp57) na fração mitocondrial, indicando a pureza da fração mitocondrial. Uma limitação potencial do protocolo é a necessidade de 20 milhões de células como material de partida para o isolamento das mitocôndrias. No entanto, a alta concentração de proteína mitocondrial observada em nosso estudo permite uma redução de dez vezes do número inicial de células microgliais para isolamento mitocondrial com base na otimização realizada em estudos anteriores ^25,26 (25-250 μg de proteínas) sem perder nenhum sinal de N-glicano. Além disso, o agrupamento de amostras biológicas para obter números de células mais altos para isolamento mitocondrial pode ser realizado em caso de escalabilidade limitada do protocolo para reduzir o número de células de fontes primárias, como tecidos, para detecção eficiente de glicanos. Além disso, a etapa de liberação de glicanos é crítica neste protocolo. A N-glicosidase F (PNGase F) é usada para liberar glicanos ligados a N completos e intactos, hidrolisando a ligação amida entre a N-acetilglucosamina mais interna (GlcNAc) e o resíduo de asparagina²⁷. Para a análise de N-glicanos, é fundamental otimizar a atividade da PNGase F para alcançar a desglicosilação completa das proteínas mitocondriais. A desnaturação de proteínas usando exposição a solventes e excesso de enzima ajuda a garantir a clivagem e liberação eficientes e completas dos N-glicanos das proteínas mitocondriais. Um tempo de digestão de 18-20 h é ideal para a liberação de N-glicanos, completando a reação PNGase F²⁶.

Uma limitação potencial deste protocolo é a falta de enriquecimento do extrato mitocondrial para glicoproteínas neste método. Embora as glicoproteínas de baixa abundância possam não ser detectadas na análise, este método minimiza o erro e o viés introduzidos pela purificação por afinidade de lectina ou enriquecimento químico. Embora o IR-MALDESI forneça uma identificação de alta confiança da composição dos glicanos identificados, informações precisas sobre as ligações entre os resíduos de glicanos requerem uma investigação mais aprofundada usando espectrometria de massa em tandem de glicanos aduzidos por lítio para aumentar as clivagens de anel cruzado²⁸ ou digestão de exoglicosidase. Alternativamente, LC-MS/MS pode ser usado em adição ou como uma alternativa à abordagem IR-MALDESI, que pode fornecer uma cobertura glicana mais profunda com mais detalhes estruturais. No entanto, estudos anteriores mostraram a correlação entre a abundância média de íons do IR-MALDESI para metabólitos com as quantidades absolutas determinadas por LC-MS/MS²⁹, estabelecendo uma base para a quantificação direta de metabólitos usando IR-MALDESI. A natureza de alto rendimento do IR-MALDESI com a capacidade de realizar análises de MS² para fornecer uma confirmação estrutural de alta confiança é fundamental para a triagem rápida de amostras pré-clínicas e clínicas para potenciais biomarcadores de glicano e diagnóstico de doenças. Além disso, deve-se notar que, embora a centrifugação do sobrenadante pós-nuclear a 3000 × g em vez de 12.000 × g minimize os contaminantes peroxissomais e lisossômicos, ainda pode haver vestígios dessas proteínas presentes na preparação mitocondrial.

Em conclusão, este estudo apresenta um método simples, de alto rendimento, com preparo mínimo de amostras para a análise do glicoma mitocondrial em células microgliais e grande potencial para aplicação na identificação de novos alvos terapêuticos baseados em glicanos para doenças neurodegenerativas. Este protocolo apresenta uma avaliação abrangente e padronização dos métodos analíticos para isolamento mitocondrial da microglia e subsequente análise do glicoma mitocondrial para permitir o aumento de escala para estudos pré-clínicos e clínicos em larga escala. Este protocolo apresenta várias vantagens para o isolamento e detecção de N-glicanos: i) o tempo de isolamento mitocondrial para o protocolo baseado em reagentes é baixo (≤40 min); ii) o rendimento de proteínas para liberação de glicanos é alto; iii) as mesmas amostras mitocondriais preparadas para análise de N-glicanos podem ser usadas para outras investigações biológicas moleculares, como análise proteômica, análise de lectina e análise de fluxo mitocondrial; e iv) a espectrometria de massa IR-MALDESI HRAM permite a detecção rápida e aprimorada de N-glicanos devido à estratégia de ionização híbrida e suave²⁸ sem a necessidade de derivatização química dos glicanos carregados como sialoglicanos e sulfoglicanos³⁰.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Os autores gostariam de agradecer a Seth Eisenberg, estudante de pós-graduação no Muddiman Lab da NCSU, por sua ajuda na gravação em vídeo do protocolo de espectrometria de massa. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Bolsas de Inovação da Escola de Engenharia da Universidade do Alabama em Birmingham, AG068309 para DJT e R01GM087964-12 para DCM. Os esquemas deste manuscrito foram desenhados usando BioRender.