Préparation mitochondriale à partir de microglie pour l’analyse des glycanes

Un protocole a été mis au point pour la préparation de mitochondries purifiées à partir de cellules microgliales, l’isolement de protéines mitochondriales pour la libération de N-glycanes et la détection rapide de glycanes mitochondriaux subcellulaires à l’aide d’une désorption laser assistée par une matrice infrarouge couplée à une spectrométrie de masse précise à haute résolution.

Comprendre les modèles de glycosylation des protéines mitochondriales dans la microglie est essentiel pour déterminer leur rôle dans les maladies neurodégénératives. Ici, nous présentons une méthodologie nouvelle et à haut débit pour l’analyse glycomique de protéines mitochondriales isolées de microglies en culture. Cette méthode implique l’isolement des mitochondries à partir de cultures microgliales, l’évaluation de la qualité des échantillons mitochondriaux, suivie d’une extraction optimisée des protéines pour maximiser la détection des glycanes, et la spectrométrie de masse de masse précise à haute résolution (HRAM) par désorption par désorption par électronébulisation assistée par matrice infrarouge (IR-MALDESI) pour fournir des profils détaillés de la glycosylation mitochondriale.

Ce protocole met l’accent sur l’importance de maintenir l’intégrité mitochondriale pendant l’isolement et utilise un contrôle de qualité rigoureux pour assurer la reproductibilité, y compris la mesure de la pureté mitochondriale après l’extraction. Cette approche permet d’établir un profil complet des changements de glycosylation dans les mitochondries microgliales dans diverses conditions expérimentales in vitro, ce qui donne un aperçu des changements mitochondriaux associés aux maladies neurodégénératives. Cette approche pourrait être adaptée à d’autres traitements in vitro , à d’autres types de cellules cultivées ou à des cellules primaires. Grâce à cette approche standardisée, nous visons à faire progresser la compréhension des glycanes mitochondriaux microgliaux, contribuant ainsi au domaine plus large de la recherche neurodégénérative.

Les microglies sont les cellules immunitaires innées résidentes dominantes dans le cerveau et représentent 10 à 15 % des cellules du cerveau adulte ^1,2. Ils utilisent leur répertoire de récepteurs pour surveiller dynamiquement le microenvironnement cérébral et réguler la fonction cérébrale normale afin de maintenir l’homéostasie cérébrale³. Les microglies sont très sensibles aux changements de leur microenvironnement et subissent des changements dans la morphologie cellulaire, l’immunophénotype et la fonction avec des conditions pathologiques ou diverses stimulations. Les états d’activation microgliale sont influencés par les demandes d’énergie cellulaire nécessaires à leur fonction, telles que la phagocytose, la production de cytokines ou la réparation des tissus. Par conséquent, le métabolisme énergétique cellulaire joue un rôle crucial dans la régulation des modifications de la fonction microgliale⁴. La dérégulation microgliale entraîne une libération excessive de cytokines pro-inflammatoires (par exemple, IL-1β, TNF-α) et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), prédisposant le cerveau à la neuroinflammation ^5,6. La dysrégulation microgliale chronique et l’environnement neuro-inflammatoire qui en résulte constituent la base de la neurodégénérescence⁷.

Le cerveau ne représente que 2 % du poids corporel, mais 20 % de la consommation totale d’énergie du corps. Les mitochondries sont la principale source d’énergie dans les cellules cérébrales et jouent un rôle clé dans la pathogenèse des troubles cérébraux aigus et^chroniques8. Des études antérieures ont établi une forte corrélation entre l’activation microgliale et le dysfonctionnement métabolique dans le vieillissement⁹ et les troubles liés à l’âge tels que la maladie d’Alzheimer^10,11, soulignant le rôle central des mitochondries dans la sénescence cellulaire et la neurodégénérescence. L’altération de la fonction mitochondriale entraîne une diminution de la production d’énergie, un stress oxydatif élevé et une augmentation de la neuroinflammation pendant le vieillissement et les maladies liées à l’âge.

Bien que des recherches approfondies aient élucidé le rôle des mitochondries dans le métabolisme énergétique, le vieillissement et les troubles cérébraux, le rôle des modifications post-traductionnelles courantes, telles que la glycosylation, dans la biologie et la fonction mitochondriales reste insuffisamment exploré. La glycosylation, l’ajout enzymatique de fractions de sucre appelées glycanes aux protéines par des enzymes de glycosylation, est la modification post-traductionnelle la plus courante dans la plupart des cellules cérébrales, y compris la microglie. Les microglies activées modulent leur fonction immunitaire sous l’effet de stimuli inflammatoires en régulant l’expression intracellulaire ou de surface cellulaire des glycanes¹². Les réponses pro- et anti-inflammatoires présentées par la microglie après la stimulation sont également régulées par les glycanes¹³. Les protéines mitochondriales ont également ces modifications de glycanes, qui régulent leur fonction et leur localisation. Cependant, l’analyse détaillée des modèles de glycosylation mitochondriale spécifiques à la cellule dans la microglie fait défaut en raison des défis techniques liés à l’étude de la glycosylation subcellulaire. Malgré les rôles bien caractérisés de la glycosylation dans la modulation du phénotype microglial, le rôle des glycanes dans la modulation de la fonction mitochondriale et, par conséquent, de l’immunophénotype cellulaire dans la microglie reste mal compris.

Des études limitées portant sur la glycosylation des protéines mitochondriales se sont principalement concentrées sur l’identification des modèles de glycosylation à l’aide de lectines. Les lectines sont des protéines de liaison aux glycanes qui se lient à des fractions biomoléculaires de glycanes^14,15, qui n’ont pas la spécificité et la capacité de fournir des informations détaillées sur la composition des glycanes. Les modalités de spectrométrie de masse offrent une identification détaillée de la composition des glycanes pour surmonter les défis analytiques présentés par l’analyse des lectines. L’une de ces modalités, l’ionisation par électronébulisation par désorption par désorption assistée par matrice infrarouge (IR-MALDESI), utilise une stratégie d’ionisation hybride, utilisant un laser infrarouge moyen pour exciter de manière résonnante l’eau trouvée dans les échantillons biologiques¹⁶ afin de désorber les espèces neutres et de les soumettre à un panache d’électrospray orthogonal, suivi d’une analyse à l’aide d’un spectromètre de masse Orbitrap précis à haute résolution. L’IR-MALDESI a déjà été démontré pour l’analyse directe des métabolites tissulaires¹⁷, avec des avantages distincts de l’analyse rapide¹⁸, de la méthode d’ionisation douce et de la prévisibilité de la teneur en acide sialique des glycanes liés à l’azote sur la base des modèles de distribution isotopique des adduits de glycanes chlorés¹⁹. Cependant, l’adaptation de cette plateforme pour l’analyse directe des glycanes subcellulaires n’a pas été démontrée.

Ici, nous rapportons un protocole à haut débit pour l’isolement mitochondrial des cellules microgliales, l’isolement des N-glycanes mitochondriaux et la détection et l’analyse des N-glycanes mitochondriaux à l’aide de la spectrométrie de masse IR-MALDESI. Ce protocole sera fondamental pour découvrir de nouvelles connaissances sur le rôle de la glycosylation dans la fonction mitochondriale, ce qui pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles neuroinflammatoires et neurodégénératifs.

1. Culture de lignées cellulaires microgliales BV2

1. Maintenir les cellules BV-2 (cellules microgliales dérivées de souris C57BL/6) dans un milieu à faible teneur en glucose DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de pénicillium-streptomycine (PenStrep) et 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA).
2. Cultivez les cellules dans des flacons T-175 et laissez-les atteindre 70-80 % de confluence.
3. Diviser les cellules en les incubant avec les enzymes de dissociation cellulaire pendant 5 min à 37 °C dans 5 % de CO₂, suivi d’une inactivation des enzymes avec un volume égal de milieu cellulaire et d’une centrifugation des cellules pendant 5 min à 500 × g à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Les enzymes de dissociation cellulaire utilisées ici sont plus douces pour les cellules BV2 que la trypsine et peuvent être utilisées pour protéger l’expression de l’antigène de surface cellulaire.
4. Aspirez le milieu, remettez la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu de croissance et comptez les cellules à l’aide de bleu de trypan (voir le tableau des matières).
   REMARQUE : Nous avons utilisé un compteur de cellules automatisé pour cette étape afin de compter les cellules.
5. Pour réaliser l’isolement mitochondrial, procédez si la pastille cellulaire contient 2 × 10⁷ (20 millions de cellules/pastille).

2. Isolement des mitochondries à partir de cellules microgliales

REMARQUE : Travaillez rapidement, en gardant tout sur la glace tout au long de la procédure. Le kit d’isolement mitochondrial utilisé pour l’isolement mitochondrial comporte trois composants : les réactifs A (tampon de lyse cellulaire), le réactif B (tampon stabilisateur) et le réactif C (tampon de lavage mitochondrial). Ajouter des inhibiteurs de protéase au réactif A et au réactif C immédiatement avant l’utilisation.

1. Granuler 2 × 10⁷ cellules par centrifugation des cellules récoltées dans un tube de microcentrifugation de 2,0 mL à 500 × g pendant 5 min. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant.
2. Ajouter 800 μL de réactif d’isolement mitochondrial A (tampon de lyse cellulaire), agiter à vitesse moyenne pendant 5 s et incuber le tube sur de la glace pendant exactement 2 min.
   REMARQUE : Ne pas dépasser les 2 min d’incubation.
3. Ajouter 10 μL de réactif d’isolement mitochondrial B (tampon stabilisateur), agiter le tube à vitesse maximale pendant 5 s et incuber le tube sur de la glace pendant 5 min, en tourbillonnant à vitesse maximale toutes les minutes.
4. Ajouter 800 μL de réactif d’isolement des mitochondries C (tampon de lavage mitochondrial), retourner le tube plusieurs fois pour mélanger et centrifuger le tube à 700 × g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE : Ne pas vortex.
5. Transvasez le surnageant dans un tube neuf de 2,0 mL et essorez-le à 3 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
6. Transférez le surnageant (parties cytosoliques) dans un nouveau tube. La pastille contient les mitochondries isolées.
7. Ajouter 500 μL de réactif d’isolement C des mitochondries à la pastille et centrifuger à 12 000 × g pendant 5 min.
8. Utilisez le granulé pour la quantification et le traitement des protéines ou stockez-le à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Estimation des protéines à l’aide du dosage des microBCA

REMARQUE : L’estimation des protéines pour ce protocole peut être effectuée à l’aide de différents réactifs et dosages. La quantification des protéines cytosoliques ou mitochondriales peut être effectuée en normalisant par rapport à la concentration totale en protéines utilisée dans le dosage.

1. Préparer des étalons d’albumine sérique bovine (BSA) entre 0 μg/mL et 200 μg/mL (0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) et des blancs avec tampon de lyse seulement.
2. Ajouter 150 μL de chaque étalon dans la plaque à fond plat de 96 puits contenant les échantillons.
3. Mélangez 25 parties de Micro BCA Reagent MA (solution d’acide bicinchoninique (BCA)) et 24 parties de Reagent MB (solution de sulfate de cuivre) avec 1 partie de Reagent MC (tampon stabilisant) (25:24:1, Réactifs MA :MB :MC) pour créer un réactif fonctionnel. Ajouter 150 μL de réactif BCA mélangé à chaque échantillon et à chaque étalon.
4. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
5. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurer l’absorbance à 562 nm et quantifier la concentration en protéines à l’aide de la courbe standard. Soustrayez l’absorbance de l’étalon à blanc de la mesure de l’absorbance de tous les autres étalons individuels et des répétitions d’échantillons inconnues pour obtenir les concentrations de protéines de l’échantillon.

4. Contrôle de la qualité de la préparation mitochondriale (western blot)

1. Remettre en suspension le culot mitochondrial dans le tampon RIPA (radio-immunoprécipitation assay buffer) pour effectuer la quantification des protéines. Déterminez la concentration en protéines de chaque échantillon à l’aide du test micro BCA.
2. Dénaturer les échantillons dans le tampon d’échantillonnage à 94 ^°C pendant 5 min.
3. Chargez des quantités égales (20 μg) de protéines mitochondriales dans des gels préfabriqués (voir le tableau des matériaux), ainsi que le marqueur de poids moléculaire.
4. Faites fonctionner le gel pendant 50 min à 100 V.
   REMARQUE : Le temps de fonctionnement peut varier, alors assurez-vous d’arrêter le gel lorsque les protéines ont atteint la fin du gel indiquée par le colorant dans le tampon d’échantillon.
5. Transférez les protéines du gel vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide du protocole de transfert sec dans un système de transfert par transfert Western pendant 7 min à 20 V.
6. Retirer la membrane et bloquer à l’aide de la solution bloquante (tableau 1) pendant 1 h à température ambiante.
7. Ajouter des dilutions appropriées d’anticorps primaires à la membrane dans un tampon de blocage pendant la nuit à 4 ^°C (COXIV = 1:3 000, GAPDH = 1:3 000).
   REMARQUE : L’absence de contamination par le réticulum endoplasmique (RE) nucléaire dans la préparation mitochondriale peut être testée en utilisant des marqueurs supplémentaires tels que lamin (marqueur nucléaire) et ERp57 (marqueur RE) dans les transferts Western.
8. Laver la membrane pendant 3 x 15 min avec le tampon de lavage (Tableau 1).
9. Incuber la membrane avec la dilution appropriée de l’anticorps secondaire conjugué à la HRP dans un tampon de blocage à température ambiante pendant 1 h
10. Laver la membrane pendant 3 x 15 min avec le tampon de lavage.
11. Pour le développement, utilisez un kit de substrat chimiluminescent.
12. Numérisez la membrane à l’aide d’un imageur de gel et de membrane.

5. Isolement des protéines mitochondriales pour l’extraction des N-glycanes à partir de la microglie

1. Remettre en suspension les mitochondries isolées dans 50 μL de tampon d’isolement protéique (tableau 1) et laisser reposer sur de la glace pendant 20 min.
2. Aspirez et distribuez trois fois et laissez reposer 20 min sur de la glace (vortex avant utilisation). Si la pastille mitochondriale n’est pas complètement solubilisée, ajoutez 50 μL supplémentaires du tampon d’isolement et accumulez-le dans le même tube.
3. Centrifugeuse à 13 000 × g pendant 10 min.
4. Récupérer le surnageant, le congeler à -80 ^°C pendant au moins 1 h et le faire sécher autant que possible dans un concentrateur sous vide.
5. Remettre en suspension avant l’isolement des glycanes à l’aide du tampon de digestion PNGase (Tableau 1) pour IR-MALDESI.

6. Préparation de N-glycane mitochondrial pour IR-MALDESI

1. Chargez 25 à 250 μg de protéines (dans un volume maximal de 250 μL) de protéines mitochondriales isolées sur un filtre de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 10 kDa.
2. Réduire les échantillons de protéines pour exposer les fractions glycanes en ajoutant 2 μL de 1 M de dithiothréitol (DTT) à chaque échantillon dans le filtre.
3. Diluez l’échantillon avec 200 μL de tampon de digestion PNGase et agitez légèrement le vortex pour éviter de perturber le filtre.
4. Dénaturer les protéines mitochondriales en incubant l’échantillon à 56 °C pendant 30 min.
5. Utilisez 50 μL d’iodoacétamide 1 M pour alkyler les mitochondries afin d’obtenir une concentration finale de ~200 mM, et incubez à 37 °C pendant 60 min.
6. Pour concentrer davantage les méthodes mitochondriales dénaturées, centrifuger les échantillons à 14 000 × g pendant 40 min. Jetez le flux continu.
7. Lavez l’échantillon avec 100 μL de tampon de digestion PNGase.
8. Concentrez la glycoprotéine sur le filtre à 14 000 × g pendant 20 min et jetez le flux. Répétez l’étape de lavage et de concentration 2 fois, pour un total de 3 fois, ce qui donne un concentré dans le volume mort du filtre (~5 μL). Jetez tous les flux continus.
9. Jetez le flacon de collecte une fois les lavages terminés. Utilisez un nouveau flacon de collecte pour tous les futurs éluants et lavages.
10. Pour séparer les glycanes des glycopatterns mitochondriaux dénaturés, transférez-les dans un flacon de collecte frais et ajoutez 2 μL de PNGase sans glycérol (75 000 unités/mL) au filtre. Ajoutez 98 μL de tampon de digestion PNGase, ce qui porte le volume total à 100 μL et mélangez en pipetant doucement de haut en bas sur le filtre.
11. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 18 h pour cliver enzymatiquement tous les N-glycanes des protéines mitochondriales.
12. Éluer les N-glycanes mitochondriaux libérés en centrifugeant l’échantillon à 14 000 × g pendant 20 min à 20 °C.
13. Lavez les glycanes mitochondriaux en ajoutant 100 μL de tampon de digestion PNGase dans le filtre et centrifugez à 14 000 × g pendant 20 min à 20 °C. Récupérez le nettoyant contenant les N-glycanes restants dans le même flacon de collecte que l’éluant. Répétez l’opération 2 fois et retirez le filtre du flacon de prélèvement.
14. Incuber les échantillons de glycanes mitochondriaux dans le congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient congelés (30 à 60 min) et secs jusqu’à ce qu’ils soient complètement à température ambiante dans un concentrateur sous vide (4 à 6 h pour 400 μL).
    REMARQUE : Les N-glycanes peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à 6 mois avant l’analyse.
15. Remettre en suspension les glycanes azotés séchés dans 50 μL d’eau de qualité LC/MS directement avant l’analyse IR-MALDESI.

7. Détection des glycanes libérés par spectrométrie de masse IR-MALDESI

1. Effectuez un étalonnage de masse chaque jour de l’expérience. Chargez la solution d’étalonnage sur un pousse-seringue et poussez à une vitesse de 1,2 μL/min. Appliquez une tension de 3,5 kV pour obtenir un panache d’électronébulisation stable pour l’étalonnage de masse en modes positif et négatif.
2. Pipeter 5 μL de glycanes mitochondriaux remis en suspension sur un point d’échantillon sur une lame de micropuits en téflon.
3. Utilisez un laser infrarouge moyen fonctionnant à une longueur d’onde de 2,97 μm pour l’ablation avec une énergie de 1,8 mJ par rafale.
4. Ioniser et détecter les N-glycanes en mode d’ionisation négative. Utilisez un solvant par électronébulisation composé de 60 % d’acétonitrile et de 1 mM d’acide acétique pour créer un panache d’électropulvérisation stable avec un débit de 2 μL/min à une tension de 3,2 kV.
5. Pour effectuer l’analyse, couplez IR-MALDESI à un spectromètre de masse HRAM réglé sur un pouvoir de résolution de masse de 240 000_FWHM à m/z 200, en analysant entre 500 et 2 000 m/z en mode ionisation négative.
6. Désactivez le contrôle automatique du gain (AGC) et réglez un temps d’injection fixe de 90 ms. Utilisez la source EasyIC pour l’étalonnage interne en temps réel de chaque spectre afin d’obtenir une précision de mesure de masse (MMA) élevée.

8. Analyse des données de N-glycanes mitochondriaux

1. Identifiez manuellement les glycanes liés à l’N en recherchant des masses monoisotopiques et en confirmant les distributions isotopiques à l’aide de l’espacement m/z pour déterminer les ions doublement et triplement chargés qui ont un seuil de flux d’ions minimum de 1 000 ions/s.
2. Convertissez les spectres de masse brute des rapports m/z en masses monoisotopiques neutres.
3. Téléchargez les masses monoisotopiques sur un outil de prédiction de la structure des oligosaccharides en ligne pour déterminer les compositions potentielles des glycanes. Confirmer les annotations à l’aide d’une base de données glycomique organisée expérimentalement²⁰ ; s’assurer que chaque identification se situe dans la marge de 2,5 ppm de MMA, qu’elle contient la structure de base des glycanes liés à l’azote (Hex₃HexNAc₂) et qu’elle exclut les monosaccharides pentose, KDN ou HexA.
4. Dessiner les structures glycanes confirmées à l’aide de la nomenclature SNFG²¹.
5. Obtenez l’abondance relative de glycanes à partir des spectres de masse brute et normalisez-les en fonction de la quantité de protéines mitochondriales en μg pour obtenir des ions/s/μg.
6. Utilisez l’analyse du khi-carré pour tester la qualité de l’ajustement entre les distributions théoriques et expérimentales des glycanes liés à l’azote afin de déterminer le nombre d’adduits au chlore. Cela permet de déterminer directement le nombre d’acides sialiques¹⁹.

La figure 1 représente un schéma des étapes impliquées dans l’isolement des mitochondries de la lignée cellulaire microgliale BV2 pour l’analyse des glycanes par spectrométrie de masse. La reproductibilité de l’isolement des protéines mitochondriales entre différentes préparations mitochondriales à partir de la même densité de départ des cellules microgliales est représentée à la figure 2, qui ne montre aucune différence significative entre la concentration de protéines mitochondriales estimée à l’aide du test micro BCA.

La figure 3 représente la pureté des isolements mitochondriaux à l’aide de l’analyse par transfert Western de COX IV et GAPDH. Ici, nous voyons l’expression de la protéine mitochondriale COX IV dans la fraction mitochondriale isolée dans la dernière étape de l’isolement à base de réactifs utilisé dans le protocole. Les immunoblots montrent une bande COX IV proéminente dans la fraction mitochondriale isolée, tandis que la GAPDH n’est détectée que dans la fraction cytoplasmique lors de la même exposition. Des temps d’exposition plus longs peuvent entraîner la détection d’une faible bande GAPDH. L’expression du marqueur non mitochondrial GAPDH est évidente dans le lysat cellulaire entier après isolement des mitochondries, sans les bandes CoxIV, indiquant un isolement complet de la fraction mitochondriale et une contamination non mitochondriale minimale. L’expression de COX IV dans les fractions mitochondriales est cohérente entre différentes préparations avec une densité cellulaire de départ similaire de 2 × 10^{7 cellules} .

Les spectres de masse représentatifs des N-glycanes libérés détectés à l’aide de l’IR-MALDESI dans la figure 4 montrent la présence de plusieurs N-glycanes chargés phosphorylés, sulfatés et sialylés libérés de l’extrait de protéine mitochondriale à l’aide du traitement PNGase. Le tableau 2 présente toutes les compositions de glycanes qui ont été identifiées dans l’ensemble des spectres mais qui n’ont pas été rapportées dans GlyConnect. Les valeurs du chi carré testant une qualité de l’ajustement confirment la détection de glycanes liés à l’azote avec un et deux adduits au chlore, confirmant la détection de ces compositions de glycanes à l’aide de IR-MALDESI dans la figure 5.

Figure 1 : Aperçu du protocole. Schéma de principe de l’isolement mitochondrial, du contrôle de la qualité, de l’extraction des protéines, de la libération de N-glycanes et de l’estimation à l’aide de la spectrométrie de masse IR-MALDESI HRAM de la lignée cellulaire microgliale BV2 pour la détection à haut débit des N-glycanes mitochondriaux. Abréviation : IR-MALDESI HRAM = Infrared-Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization HighResolution Accurate Mass Analyzer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Isolement de la protéine mitochondriale à partir de cellules BV2. (A) Courbe standard pour le dosage des micro-BCA utilisant différentes concentrations de BSA. (B) Reproductibilité de l’isolement des protéines mitochondriales représenté par un contenu protéique cohérent de 2 × 10⁷ cellules dans six préparations mitochondriales indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Pureté de la préparation mitochondriale. Western blot représentatif pour la fraction cytoplasmique ainsi que les mitochondries isolées des cellules microgliales BV2. La figure représente l’immunotransfert de la fraction cytoplasmique et des mitochondries isolées avec l’anticorps COX IV (marqueur mitochondrial) et l’anticorps GAPDH (contrôle cytoplasmique). L’absence de bandes GAPDH dans les mitochondries isolées indique une contamination croisée minimale et la pureté de la préparation mitochondriale pour l’analyse ultérieure des N-glycanes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Détermination de la composition d’identification des N-glycanes mitochondriaux à l’aide de la spectrométrie de masse IR-MALDESI HRAM. Spectres de masse des glycanes dans la gamme de 1 700 à 2 000 m/z montrant un nombre significatif de pics chargés de plusieurs fois avec les structures annotées déterminées à l’aide de Glycomod. Abréviation : IR-MALDESI HRAM = Infrared-Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization HighResolution Accurate Mass Analyzer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Vérification des N-glycanes mitochondriaux détectés. Distributions isotopiques représentatives pour quatre glycanes mitochondriaux liés à l’N (A-D) montrant une superposition de la distribution observée avec des distributions théoriques du chlore et des adduits déprotonés. Les valeurs du khi-carré sur les spectres superposés représentent la qualité de l’ajustement et confirment la détection des glycanes liés à l’azote avec un et deux adduits au chlore. Il s’agit d’une confirmation supplémentaire de la détection de ces compositions de glycanes à l’aide de l’IR-MALDESI. Abréviation : IR-MALDESI = Infrared-Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recettes de solutions et de tampons utilisées dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Glycanes liés à l’azote déprotonés chargés en M dernière détectés dans les mitochondries avec une grande précision de mesure de masse dans Glycomod. Notation abrégée des glycanes : H = hexose ; N = N-acétylglucosamine ; F = fucose ; S = acide N-acétylneuraminique ; Phos = phosphate ; Sulph = modification du sulfate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du cerveau, et les modifications des glycanes modulent l’immunophénotype et la fonction de la microglie. Ces fonctions immunitaires exigent une énergie cellulaire substantielle, qui est principalement fournie par les mitochondries. Notamment, les protéines mitochondriales présentent également des modifications des glycanes, qui sont restées largement sous-étudiées en raison des défis technologiques dans l’étude de la glycosylation subcellulaire. La plupart des études portant sur la glycosylation mitochondriale reposent sur l’identification des motifs glycanes basée sur les lectines²², bien que ces approches soient limitées par la faible spécificité de liaison des lectines. Les avancées essentielles de l’approche technique présentée dans cette étude sont i) l’isolement reproductible des N-glycanes mitochondriaux à partir de cellules microgliales et ii) la détection et l’identification des N-glycanes mitochondriaux à l’aide de la spectrométrie de masse IR-MALDESI HRAM. Le flux de travail décrit ici est le premier rapport de détection de N-glycanes libérés par les glycoprotéines mitochondriales exprimées à des niveaux physiologiques dans les cellules microgliales.

Dans le protocole actuel, l’isolement mitochondrial est maximisé en utilisant la méthode d’isolement basée sur les réactifs. Cela peut être combiné avec la méthode d’homogénéisation de Dounce pour améliorer le rendement mitochondrial. L’un des inconvénients de l’utilisation de l’homogénéisateur par rapport à l’isolement à base de réactifs est la variation de la force et de la vitesse du pilon entre les opérateurs, ce qui entraîne une augmentation de la variation expérimentale et une réduction de la reproductibilité. Des études antérieures^23,24 ont indiqué l’utilisation de cette méthode et l’absence de marqueurs nucléaires (lamine, histone H3) et RE (calnexine, Erp57) dans la fraction mitochondriale, indiquant la pureté de la fraction mitochondriale. Une limitation potentielle du protocole est l’exigence de 20 millions de cellules comme matériau de départ pour l’isolement des mitochondries. Cependant, la forte concentration de protéines mitochondriales observée dans notre étude permet de diviser par dix le nombre initial de cellules microgliales pour l’isolement mitochondrial sur la base de l’optimisation effectuée dans des études antérieures^25,26 (25-250 μg de protéines) sans perdre de signaux N-glycanes. De plus, le regroupement d’échantillons biologiques pour obtenir un nombre plus élevé de cellules pour l’isolement mitochondrial pourrait être effectué en cas d’évolutivité limitée du protocole pour réduire le nombre de cellules provenant de sources primaires telles que les tissus pour une détection efficace des glycanes. De plus, l’étape de libération de glycanes est essentielle dans ce protocole. La N-glycosidase F (PNGase F) est utilisée pour libérer des glycanes N-liés complets et intacts en hydrolysant la liaison amide entre la N-acétylglucosamine la plus interne (GlcNAc) et le résidu d’asparagine²⁷. Pour l’analyse des N-glycanes, il est essentiel d’optimiser l’activité de la PNGase F afin d’obtenir une déglycosylation complète des protéines mitochondriales. La dénaturation des protéines à l’aide de l’exposition aux solvants et de l’excès d’enzyme permet d’assurer un clivage et une libération efficaces et complets des N-glycanes des protéines mitochondriales. Un temps de digestion de 18 à 20 h est optimal pour la libération de N-glycanes en complétant la réaction PNGase F²⁶.

Une limitation potentielle de ce protocole est le manque d’enrichissement de l’extrait mitochondrial pour les glycoprotéines dans cette méthode. Bien que les glycoprotéines de faible abondance ne soient pas détectées dans l’analyse, cette méthode minimise l’erreur et le biais introduits par la purification par affinité des lectines ou l’enrichissement chimique. Alors que l’IR-MALDESI permet une identification à haut niveau de confiance de la composition des glycanes identifiés, des informations précises sur les liens entre les résidus de glycanes nécessitent des recherches plus approfondies à l’aide de la spectrométrie de masse en tandem des glycanes adduits au lithium pour améliorer les clivages croisés²⁸ ou les digestions d’exoglycosidase. Alternativement, LC-MS/MS peut être utilisé en plus ou comme alternative à l’approche IR-MALDESI, qui peut fournir une couverture glycane plus profonde avec plus de détails structurels. Cependant, des études antérieures ont montré la corrélation entre l’abondance moyenne des ions de l’IR-MALDESI pour les métabolites et les quantités absolues déterminées par LC-MS/^{MS 29}, établissant ainsi une base pour la quantification directe des métabolites à l’aide de l’IR-MALDESI. La nature à haut débit d’IR-MALDESI avec sa capacité à effectuer une analyse MS² pour fournir une confirmation structurelle à haut niveau de confiance est essentielle pour le dépistage rapide d’échantillons précliniques et cliniques à la recherche de biomarqueurs de glycanes potentiels et le diagnostic de la maladie. De plus, il convient de noter que bien que la centrifugation du surnageant postnucléaire à 3000 × g au lieu de 12 000 × g minimise les contaminants peroxysomales et lysosomaux, il peut encore y avoir des traces de ces protéines présentes dans la préparation mitochondriale.

En conclusion, cette étude présente une méthode simple et à haut débit, avec une préparation minimale des échantillons pour l’analyse du glycome mitochondrial dans les cellules microgliales et un grand potentiel d’application dans l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques à base de glycanes pour les maladies neurodégénératives. Ce protocole présente une évaluation complète et une normalisation des méthodes analytiques pour l’isolement mitochondrial de la microglie et l’analyse ultérieure du glycome mitochondrial afin de permettre la mise à l’échelle pour des études précliniques et cliniques à grande échelle. Ce protocole présente plusieurs avantages pour l’isolement et la détection des N-glycanes : i) le temps d’isolement mitochondrial pour le protocole basé sur les réactifs est faible (≤40 min) ; ii) le rendement en protéines pour la libération de glycanes est élevé ; iii) les mêmes échantillons mitochondriaux préparés pour l’analyse des N-glycanes peuvent être utilisés pour d’autres investigations biologiques moléculaires telles que l’analyse protéomique, l’analyse des lectines et l’analyse du flux mitochondrial ; et iv) la spectrométrie de masse IR-MALDESI HRAM permet une détection rapide et améliorée des N-glycanes grâce à la stratégie d’ionisation hybride et douce²⁸ sans qu’il soit nécessaire de procéder à une dérivation chimique des glycanes chargés comme les sialoglycanes et les sulfoglycanes³⁰.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les auteurs tiennent à remercier Seth Eisenberg, étudiant diplômé au laboratoire Muddiman de la NCSU, pour son aide dans l’enregistrement vidéo du protocole de spectrométrie de masse. Cette recherche a été financée en partie par le programme de bourses d’innovation de l’École d’ingénierie de l’Université de l’Alabama à Birmingham, AG068309 à D.J.T. et R01GM087964-12 à D.C.M. Les schémas de ce manuscrit ont été dessinés à l’aide de BioRender.