تحضير الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الصغيرة لتحليل الجليكان

تم تطوير بروتوكول لتحضير الميتوكوندريا المنقاة من الخلايا الدبقية الصغيرة ، وعزل بروتينات الميتوكوندريا لإطلاق N-glycan ، والكشف السريع عن الجليكانات الميتوكوندريا تحت الخلوية باستخدام تأين الرش الكهربائي للامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء إلى جانب قياس الطيف الكتلي الدقيق لمحلل الكتلة عالي الدقة.

يعد فهم أنماط الارتباط بالجليكوزيل لبروتينات الميتوكوندريا في الخلايا الدبقية الصغيرة أمرا بالغ الأهمية لتحديد دورها في الأمراض التنكسية العصبية. نقدم هنا منهجية جديدة وعالية الإنتاجية لتحليل السكر السكري لبروتينات الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا الدبقية الصغيرة المستزرعة. تتضمن هذه الطريقة عزل الميتوكوندريا عن المزارع الدبقية الصغيرة ، وتقييم جودة عينات الميتوكوندريا ، متبوعا باستخراج البروتين الأمثل لزيادة اكتشاف الجليكان ، وتأين الرش الكهربائي بالامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء (IR-MALDESI) قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRAM) لتوفير ملامح مفصلة لغليكوزيلات الميتوكوندريا.

يؤكد هذا البروتوكول على أهمية الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا أثناء العزل ويستخدم رقابة صارمة على الجودة لضمان التكاثر ، بما في ذلك قياس نقاء الميتوكوندريا بعد الاستخراج. يسمح هذا النهج بالتنميط الشامل لتغيرات الارتباط بالجليكوزيل في الميتوكوندريا الدبقية الصغيرة في ظل ظروف تجريبية مختلفة في المختبر ، مما يوفر نظرة ثاقبة لتغيرات الميتوكوندريا المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية. يمكن تكييف هذا النهج مع العلاجات الأخرى في المختبر أو أنواع الخلايا المستنبتة الأخرى أو الخلايا الأولية. من خلال هذا النهج الموحد ، نهدف إلى تعزيز فهم جليكان الميتوكوندريا الدبقية الصغيرة ، مما يساهم في المجال الأوسع للأبحاث التنكسية العصبية.

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية الفطرية المقيمة المهيمنة في الدماغ وتمثل 10-15٪ من الخلايا في الدماغ البالغ^1،2. يستخدمون ذخيرة المستقبلات الخاصة بهم لمراقبة البيئة المكروية للدماغ ديناميكيا وتنظيم وظيفة الدماغ الطبيعية للحفاظ على توازن الدماغ³. الخلايا الدبقية الصغيرة حساسة للغاية للتغيرات في بيئتها المكروية وتخضع لتغييرات في مورفولوجيا الخلية ، والنمط المناعي ، والوظيفة مع الحالات المرضية أو المحفزات المختلفة. تتأثر حالات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بمتطلبات الطاقة الخلوية المطلوبة لوظيفتها ، مثل البلعمة أو إنتاج السيتوكين أو إصلاح الأنسجة. لذلك ، يلعب استقلاب الطاقة الخلوية دورا مهما في تنظيم التغيرات في وظيفة الخلايا الدبقية^{الصغيرة 4}. يؤدي عدم تنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة إلى الإفراط في إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (على سبيل المثال ، IL-1β و TNF-α) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يهيئ الدماغ للالتهاب العصبي^5،6. يضع خلل تنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة المزمن والبيئة الالتهابية العصبية الناتجة عن ذلك أساسا للتنكس العصبي⁷.

يمثل الدماغ 2٪ فقط من وزن الجسم ولكن 20٪ من إجمالي استهلاك الطاقة في الجسم. الميتوكوندريا هي المصدر الأساسي للطاقة في خلايا الدماغ وتعمل كلاعبين رئيسيين في التسبب في كل من اضطرابات الدماغ الحادة والمزمنة⁸. أثبتت الدراسات السابقة وجود علاقة قوية بين تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلل الأيضي في الشيخوخة⁹ والاضطرابات المرتبطة بالعمر مثل مرض الزهايمر^10،11 ، مما يسلط الضوء على الدور المحوري للميتوكوندريا في الشيخوخة الخلوية والتنكس العصبي. يؤدي ضعف وظيفة الميتوكوندريا إلى انخفاض إنتاج الطاقة ، وارتفاع الإجهاد التأكسدي ، وزيادة الالتهاب العصبي أثناء الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر.

في حين أن الأبحاث المكثفة قد أوضحت دور الميتوكوندريا في استقلاب الطاقة والشيخوخة واضطرابات الدماغ ، فإن دور التعديلات الشائعة بعد الترجمة ، مثل الارتباط بالجليكوزيل ، في بيولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها لا يزال غير مستكشف بشكل كاف. الارتباط بالجليكوزيل ، وهو الإضافة الأنزيمية لشقوق السكر التي تسمى الجليكان إلى البروتينات بواسطة إنزيمات الجليكوزيل ، هو التعديل الأكثر شيوعا بعد الترجمة في معظم خلايا الدماغ ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. تعدل الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وظيفتها المناعية تحت المحفزات الالتهابية عن طريق تنظيم تعبير الجليكان داخل الخلايا أو سطح^{الخلية 12}. يتم أيضا تنظيم الاستجابات المؤيدة والمضادة للالتهابات التي تظهرها الخلايا الدبقية الصغيرة بعد التحفيز بواسطة الجليكان¹³. تحتوي بروتينات الميتوكوندريا أيضا على تعديلات الجليكان هذه ، والتي تنظم وظيفتها وتوطينها. ومع ذلك ، فإن التحليل التفصيلي لأنماط الارتباط بالجليكوزيل في الميتوكوندريا الخاصة بالخلية في الخلايا الدبقية الصغيرة غير موجود بسبب التحديات التقنية في التحقيق في الارتباط بالجليكوزيل تحت الخلوي. على الرغم من الأدوار المميزة جيدا للارتباط بالجليكوزيل في تعديل النمط الظاهري للخلايا الدبقية الدقيقة ، فإن دور الجليكان في تعديل وظيفة الميتوكوندريا وبالتالي النمط المناعي الخلوي في الخلايا الدبقية الصغيرة لا يزال غير مفهوم جيدا.

ركزت الدراسات المحدودة التي تبحث في ارتباط بروتين الميتوكوندريا بشكل أساسي على تحديد أنماط الارتباط بالجليكوزيل القائم على الليكتين. الليكتين عبارة عن بروتينات مرتبطة بالجليكان تربط شقوق الجليكان الجزيئية^{الحيوية 14،15} ، والتي تفتقر إلى الخصوصية والقدرة على تقديم معلومات مفصلة حول تكوين الجليكان. توفر طرائق القياس الطيفي الكتلي تحديدا مفصلا لتركيبات الجليكان للتغلب على التحديات التحليلية التي يقدمها تحليل الليكتين. إحدى هذه الطرائق ، تأين الرش الكهربائي بالامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء (IR-MALDESI) ، تستخدم استراتيجية تأين هجينة ، باستخدام ليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء لإثارة الماء الموجود في العينات البيولوجية¹⁶ لامتصاص الأنواع المحايدة وإخضاعها لعمود الرش الكهربائي المتعامد ، متبوعا بالتحليل باستخدام مطياف كتلة أوربيتراب عالي الدقة. تم إثبات IR-MALDESI سابقا للتحليل المباشر لمستقلبات الأنسجة¹⁷ ، مع مزايا مميزة للتحليل السريع¹⁸ ، وطريقة التأين الناعم ، وإمكانية التنبؤ بمحتوى حمض السياليك للجليكان المرتبط ب N بناء على أنماط التوزيع النظيري لمقاربات الجليكان المكلورة¹⁹. ومع ذلك ، لم يتم إثبات تكييف هذه المنصة للتحليل المباشر للجليكانات دون الخلوية.

هنا ، نبلغ عن بروتوكول عالي الإنتاجية لعزل الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الصغيرة ، وعزل N-glycans في الميتوكوندريا ، واكتشاف N-glycan للميتوكوندريا وتحليله باستخدام قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI. سيكون هذا البروتوكول أساسيا في الكشف عن رؤى جديدة حول دور الارتباط بالجليكوزيل في وظيفة الميتوكوندريا ، مما قد يحدد أهدافا علاجية جديدة للاضطرابات الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية.

1. BV2 ثقافة خط الخلايا الدبقية الصغيرة

1. الحفاظ على خلايا BV-2 (الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الفئران C57BL / 6) في وسائط الجلوكوز المنخفضة DMEM المكملة بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) ، و 1٪ بنسليوم ستربتومايسين (PenStrep) ، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
2. قم بزراعة الخلايا في قوارير T-175 واسمح لها بالوصول إلى 70-80٪ من التقاء.
3. قم بتقسيم الخلايا عن طريق الحضانة مع إنزيمات تفكك الخلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، متبوعا بتعطيل الإنزيمات ذات الحجم المتساوي من وسائط الخلية ، والطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT).
   ملاحظة: إنزيمات تفكك الخلايا المستخدمة هنا ألطف على خلايا BV2 من التربسين ويمكن استخدامها لحماية تعبير مستضد سطح الخلية.
4. قم بشفط الوسائط ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط النمو ، واحسب الخلايا باستخدام تريبان الأزرق (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: استخدمنا عداد خلايا آلي لهذه الخطوة لحساب الخلايا.
5. لتنفيذ عزل الميتوكوندريا ، تابع إذا كانت حبيبات الخلية تحتوي على 2 × 10⁷ (20 مليون خلية / بيليه).

2. عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: اعمل بسرعة ، مع الحفاظ على كل شيء على الجليد طوال العملية. تتكون مجموعة عزل الميتوكوندريا المستخدمة لعزل الميتوكوندريا من ثلاثة مكونات: الكواشف A (المخزن المؤقت لتحلل الخلية) ، والكاشف B (مخزن مؤقت للتثبيت) ، والكاشف C (مخزن غسيل الميتوكوندريا). أضف مثبطات الإنزيم البروتيني إلى الكاشف A والكاشف C مباشرة قبل الاستخدام.

1. بيليه 2 × 10⁷ خلايا عن طريق الطرد المركزي للخلايا المحصودة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق بعناية وتخلص من المادة الطافية.
2. أضف 800 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا A (المخزن المؤقت لتحلل الخلية) ، ودوامة بسرعة متوسطة لمدة 5 ثوان ، واحتضن الأنبوب على الجليد لمدة دقيقتين بالضبط.
   ملاحظة: لا تتجاوز الحضانة لمدة 2 دقيقة.
3. أضف 10 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا B (عازلة التثبيت) ، والدوامة بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان ، واحتضن الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق ، مع الدوامة بأقصى سرعة كل دقيقة.
4. أضف 800 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C (المخزن المؤقت لغسيل الميتوكوندريا) ، واقلب الأنبوب عدة مرات للخلط ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: لا تدوام.
5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2.0 مل وقم بالدوران عند 3,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
6. انقل المادة الطافية (أجزاء العصارة الخلوية) إلى أنبوب جديد. تحتوي الحبيبات على الميتوكوندريا المعزولة.
7. أضف 500 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C إلى الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق.
8. استخدم الحبيبات لقياس كمية البروتين ومعالجته أو قم بتخزين الحبيبات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

3. تقدير البروتين باستخدام مقايسة microBCA

ملاحظة: يمكن إجراء تقدير البروتين لهذا البروتوكول باستخدام كواشف ومقايسات مختلفة. يمكن إجراء القياس الكمي لبروتينات العصارة الخلوية أو الميتوكوندريا عن طريق التطبيع مقابل إجمالي تركيز البروتين المستخدم في الفحص.

1. إعداد معايير ألبومين مصل الأبقار (BSA) بين 0 ميكروغرام / مل و 200 ميكروغرام / مل (0 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 2.5 ميكروغرام / مل ، 5 ميكروغرام / مل ، 10 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، 40 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) والفراغات مع محلول التحلل فقط.
2. أضف 150 ميكرولتر من كل معيار إلى الصفيحة المسطحة القاع المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على العينات.
3. امزج 25 جزءا من كاشف BCA الصغير MA (محلول حمض البيسينشونيني (BCA)) و 24 جزءا من الكاشف MB (محلول كبريتات النحاس) مع جزء واحد من الكاشف MC (المخزن المؤقت للتثبيت) (25: 24: 1 ، الكواشف MA: MB: MC) لإنشاء كاشف عامل. أضف 150 ميكرولتر من كاشف BCA المختلط إلى كل عينة ومعيار.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
5. استخدم قارئ الألواح لقياس الامتصاص عند 562 نانومتر وتحديد تركيز البروتين بالمنحنى القياسي. اطرح الامتصاص القياسي الفارغ من قياس الامتصاص لجميع المعايير الفردية الأخرى وتكرار العينة غير المعروفة للحصول على تركيزات بروتين العينة.

4. مراقبة جودة تحضير الميتوكوندريا (اللطخة الغربية)

1. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) لإجراء القياس الكمي للبروتين. حدد تركيز البروتين لكل عينة باستخدام مقايسة BCA الدقيقة.
2. قم بتغيير طبيعة العينات في المخزن المؤقت للعينة عند 94 ^{درجة مئوية}لمدة 5 دقائق.
3. قم بتحميل كميات متساوية (20 ميكروجرام) من بروتين الميتوكوندريا إلى المواد الهلامية مسبقة الصب (انظر جدول المواد) ، جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئي.
4. قم بتشغيل الجل لمدة 50 دقيقة عند 100 فولت.
   ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل ، لذا تأكد من إيقاف الجل عندما تصل البروتينات إلى نهاية الجل المشار إليه بالصبغة الموجودة في المخزن المؤقت للعينة.
5. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) باستخدام بروتوكول النقل الجاف في نظام نقل اللطخة الغربية لمدة 7 دقائق عند 20 فولت.
6. أخرج الغشاء وقم بحظر محلول الحجب (الجدول 1) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
7. أضف التخفيفات المناسبة للجسم المضاد الأولي إلى الغشاء في سد المخزن المؤقت بين عشية وضحاها عند 4 ^درجاتمئوية (COXIV = 1: 3,000 ، GAPDH = 1: 3,000).
   ملاحظة: يمكن اختبار عدم وجود تلوث للشبكة الإندوبلازمية النووية (ER) في تحضير الميتوكوندريا باستخدام علامات إضافية مثل lamin (علامة نووية) و ERp57 (علامة ER) في البقع الغربية.
8. اغسل الغشاء لمدة 3 × 15 دقيقة باستخدام مخزن الغسيل (الجدول 1).
9. احتضان الغشاء بالتخفيف المناسب للجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP في حجب المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة
10. اغسل الغشاء لمدة 3 × 15 دقيقة باستخدام مخزن الغسيل.
11. للتطوير ، استخدم مجموعة الركيزة المضيئة الكيميائية.
12. امسح الغشاء باستخدام جهاز تصوير هلام وغشاء.

5. عزل بروتين الميتوكوندريا لاستخراج N -glycan من الخلايا الدبقية الصغيرة

1. أعد تعليق الميتوكوندريا المعزولة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل البروتين (الجدول 1) واتركه على الجليد لمدة 20 دقيقة.
2. استنشق واستخرج ثلاث مرات واتركه لمدة 20 دقيقة على الثلج (دوامة قبل الاستخدام). إذا لم يتم إذابة حبيبات الميتوكوندريا تماما ، أضف 50 ميكرولتر أخرى من عازلة العزل وتجمع في نفس الأنبوب.
3. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق.
4. استرجع المادة الطافية ، وقم بتجميدها عند -80 ^{درجة مئوية}لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، وجففها قدر الإمكان في مكثف فراغ.
5. أعد التعليق قبل عزل الجليكان باستخدام المخزن المؤقت لهضم PNGase (الجدول 1) ل IR-MALDESI.

6. تحضير الميتوكوندريا N - جليكان ل IR-MALDESI

1. قم بتحميل 25-250 ميكروغرام من البروتين (في الحجم الأقصى 250 ميكرولتر) من بروتينات الميتوكوندريا المعزولة على مرشح قطع الوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون (MWCO).
2. قلل عينات البروتين لفضح شقوق الجليكان عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol (DTT) إلى كل عينة في الفلتر.
3. خفف العينة ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase والدوامة برفق لتجنب إزعاج المرشح.
4. قم بتغيير طبيعة بروتينات الميتوكوندريا عن طريق احتضان العينة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. استخدم 50 ميكرولتر من 1 M يودوأسيتاميد لألكل الميتوكوندريا لإعطاء تركيز نهائي ~ 200 ملي مولار ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
6. لمزيد من التركيز على طرق الميتوكوندريا المشوهة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 14,000 × جم لمدة 40 دقيقة. تجاهل التدفق.
7. اغسل العينة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase.
8. ركز البروتين السكري على الفلتر عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة وتخلص من التدفق. كرر خطوة الغسيل والتركيز 2x ، ليصبح المجموع 3x ، مما ينتج عنه تركيز في الحجم الميت للمرشح (~ 5 ميكرولتر). تجاهل كل التدفق.
9. تخلص من قارورة التجميع بمجرد اكتمال الغسيل. استخدم قارورة مجموعة جديدة لجميع المواد المزيئة والغسول المستقبلية.
10. لشق الجليكان من الأنماط السكرية للميتوكوندريا المشوهة ، انقلها إلى قارورة تجميع جديدة وأضف 2 ميكرولتر من PNGase الخالي من الجلسرين (75,000 وحدة / مل) إلى الفلتر. أضف 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر واخلطه عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل على الفلتر.
11. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة لشق جميع N-glycans من بروتينات الميتوكوندريا إنزيميا.
12. قم بإزالة N-glycans الميتوكوندريا المنبعثة عن طريق الطرد المركزي للعينة عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
13. اغسل جليكان الميتوكوندريا بإضافة 100 ميكرولتر من محلول هضم PNGase إلى الفلتر وجهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. اجمع الغسيل الذي يحتوي على أي N-glycans متبقية في نفس قارورة التجميع مثل مادة المزاء. كرر 2x وقم بإزالة الفلتر من قارورة التجميع.
14. احتضان عينات جليكان الميتوكوندريا في الفريزر -80 درجة مئوية حتى تتجمد (30-60 دقيقة) وتجف حتى تكتمل في درجة حرارة الغرفة في مكثف فراغ (4-6 ساعات لمدة 400 ميكرولتر).
    ملاحظة: يمكن تخزين N-glycans عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر قبل التحليل.
15. أعد تعليق الجليكان المجفف المرتبط ب N في 50 ميكرولتر من الماء من الدرجة LC / MS مباشرة قبل تحليل IR-MALDESI.

7. الكشف عن الجليكان المنبعثة عن طريق قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI

1. قم بإجراء معايرة الكتلة كل يوم من أيام التجربة. قم بتحميل محلول المعايرة على مضخة حقنة وادفعها بمعدل 1.2 ميكرولتر / دقيقة. قم بتطبيق جهد 3.5 كيلو فولت لتحقيق عمود رش كهربائي مستقر لمعايرة الكتلة في كل من الوضعين الموجب والسالب.
2. ماصة 5 ميكرولتر من جليكان الميتوكوندريا المعلقة على بقعة عينة على شريحة تفلون ميكروويل.
3. استخدم ليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء يعمل بطول موجي يبلغ 2.97 ميكرومتر للاستئصال بطاقة 1.8 مللي جول لكل رشقة.
4. تأين واكتشاف N-glycans في وضع التأين السابب. استخدم مذيب الرش الكهربائي الذي يتكون من 60٪ أسيتونيتريل و 1 ملي مولار من حمض الأسيتيك لإنشاء عمود رش كهربائي مستقر بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة بجهد 3.2 كيلو فولت.
5. لإجراء التحليل ، قم بإقران IR-MALDESI بمطياف كتلة HRAM تم ضبطه على قوة حل كتلة تبلغ 240,000_FWHM عند m / z 200 ، وتحليل ما بين 500 و 2,000 م / z في وضع التأين السالب.
6. قم بإيقاف تشغيل التحكم التلقائي في الكسب (AGC) وتعيين وقت حقن ثابت يبلغ 90 مللي ثانية. استخدم مصدر EasyIC للمعايرة الداخلية في الوقت الفعلي لكل طيف لتحقيق دقة قياس الكتلة العالية (MMA).

8. تحليل بيانات الميتوكوندريا N- glycan

1. حدد الجليكان المرتبط ب N يدويا من خلال البحث عن الكتل أحادية النظير وتأكيد التوزيعات النظيرية باستخدام تباعد m / z لتحديد الأيونات المشحونة المزدوجة والثلاثية التي لها حد أدنى من التدفق الأيوني يبلغ 1,000 أيون / ثانية.
2. تحويل أطياف الكتلة الخام من نسب m / z إلى كتل أحادية النظير محايدة.
3. قم بتحميل الكتل أحادية النظير إلى أداة التنبؤ ببنية السكريات قليلة السكاريد عبر الإنترنت لتحديد تركيبات الجليكان المحتملة. تأكيد التعليقات التوضيحية باستخدام قاعدة بيانات السكريات المنسقة تجريبيا²⁰ ؛ تأكد من أن كل تعريف يقع ضمن هامش 2.5 جزء في المليون MMA ، ويحتوي على بنية الجليكان الأساسية المرتبطة ب N (Hex₃HexNAc₂) ، وتستثني البنتوز أو KDN أو السكريات الأحادية HexA.
4. ارسم هياكل الجليكان المؤكدة باستخدام تسمية SNFG²¹.
5. احصل على الوفرة النسبية للجليكان من أطياف الكتلة الخام وقم بتطبيعها مقابل كمية بروتين الميتوكوندريا في ميكروغرام للحصول على الأيونات / ثانية / ميكروغرام.
6. استخدم تحليل مربع كاي لاختبار جودة التوافق بين التوزيعات النظرية والتجريبية للجليكانات المرتبطة ب N لتحديد عدد مقاربات الكلور. هذا يسمح بالتحديد المباشر لعدد أحماض السياليك¹⁹.

يمثل الشكل 1 مخططا تخطيطيا للخطوات المتضمنة في عزل الميتوكوندريا عن خط الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 لتحليل الجليكان الطيفي الكتلي. يتم تمثيل قابلية استنساخ عزل بروتين الميتوكوندريا بين مستحضرات الميتوكوندريا المختلفة من نفس كثافة البداية للخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 2 ، والذي لا يظهر فرقا كبيرا بين تركيز بروتين الميتوكوندريا المقدر باستخدام مقايسة BCA الدقيقة.

يمثل الشكل 3 نقاء عزلات الميتوكوندريا باستخدام تحليل اللطخة الغربية ل COX IV و GAPDH. هنا ، نرى التعبير عن بروتين الميتوكوندريا COX IV في جزء الميتوكوندريا المعزول في الخطوة الأخيرة من العزل القائم على الكاشف المستخدم في البروتوكول. تظهر البقع المناعية نطاق COX IV بارز في جزء الميتوكوندريا المعزول ، بينما يتم اكتشاف GAPDH فقط في الجزء السيتوبلازمي في نفس التعرض. يمكن أن تؤدي أوقات التعرض الأطول إلى اكتشاف نطاق GAPDH باهت. يتضح التعبير عن علامة GAPDH غير الميتوكوندريا في محللة الخلية بأكملها بعد عزل الميتوكوندريا ، بدون نطاقات CoxIV ، مما يشير إلى عزل كامل لجزء الميتوكوندريا والحد الأدنى من التلوث غير الميتوكوندريا. يتسق تعبير COX IV في كسور الميتوكوندريا بين المستحضرات المختلفة ذات كثافة الخلايا الأولية المتشابهة من 2 × 10⁷ خلايا.

تظهر الأطياف الكتلية التمثيلية ل N-glycans التي تم اكتشافها باستخدام IR-MALDESI في الشكل 4 وجود العديد من N-glycans المفسفرة والكبريتات والسياليلات المشحونة المنبعثة من مستخلص بروتين الميتوكوندريا باستخدام معالجة PNGase. يشير الجدول 2 إلى جميع تركيبات الجليكان التي تم تحديدها في الأطياف بأكملها ولكن لم يتم الإبلاغ عنها في GlyConnect. تؤكد قيم مربعات كاي التي تختبر جودة الملاءمة اكتشاف الجليكان المرتبط ب N مع مقارب واحد واثنين من مقاربات الكلور ، مما يؤكد اكتشاف تركيبات الجليكان هذه باستخدام IR-MALDESI في الشكل 5.

الشكل 1: مخطط البروتوكول. مخطط تخطيطي لعزل الميتوكوندريا ، ومراقبة الجودة ، واستخراج البروتين ، وإطلاق N-glycan ، والتقدير باستخدام قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI HRAM من خط الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 للكشف عن الإنتاجية العالية ل N-glycans في الميتوكوندريا. اختصار: IR-MALDESI HRAM = الامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء تأين الرش الكهربائي محلل كتلة دقيق عالي الدقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: عزل بروتين الميتوكوندريا عن خلايا BV2. (أ) المنحنى القياسي لمقايسة BCA الدقيقة باستخدام تركيزات مختلفة من BSA. (ب) استنساخ عزل بروتين الميتوكوندريا المتمثل بمحتوى بروتين ثابت من 2 × 10⁷ خلايا في ستة مستحضرات مستقلة للميتوكوندريا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نقاء تحضير الميتوكوندريا. لطخة غربية تمثيلية للجزء السيتوبلازمي وكذلك الميتوكوندريا المعزولة من خلايا BV2 الدبقية الصغيرة. يمثل الشكل النشاف المناعي للجزء السيتوبلازمي والميتوكوندريا المعزولة مع الجسم المضاد COX IV (علامة الميتوكوندريا) والجسم المضاد GAPDH (التحكم السيتوبلازمي). يشير عدم وجود نطاقات GAPDH في الميتوكوندريا المعزولة إلى الحد الأدنى من التلوث المتبادل ونقاء تحضير الميتوكوندريا لتحليل N-glycan اللاحق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحديد تركيبة تحديد الميتوكوندريا N-glycan باستخدام قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI HRAM. أطياف كتلة الجليكان في حدود 1,700-2,000 م / z تظهر عددا كبيرا من القمم المشحونة المضاعفة مع الهياكل المشروحة المحددة باستخدام Glycomod. اختصار: IR-MALDESI HRAM = الامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء تأين الرش الكهربائي محلل كتلة دقيق عالي الدقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحقق من N-glycans المكتشفة في الميتوكوندريا. توزيعات نظائر تمثيلية لأربعة (A-D) جليكان مرتبطة ب N للميتوكوندريا تظهر تراكبا للتوزيع المرصود مع التوزيعات النظرية للكلور والمقاربات غير البروتونية. تمثل قيم مربع كاي على الأطياف المتراكبة جودة الملاءمة وتؤكد اكتشاف الجليكان المرتبط ب N مع مقارب واحد واثنين من الكلور. هذا تأكيد إضافي للكشف عن تركيبات الجليكان هذه باستخدام IR-MALDESI. اختصار: IR-MALDESI = تأين الامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات المحلول والمخزن المؤقت المستخدمة في البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: تم اكتشاف Glycans المرتبطة ب N مشحونة في نهاية المطاف في الميتوكوندريا بدقة قياس الكتلة العالية في Glycomod. تدوين جليكان القصير: H = سداسي عشري ؛ N = N-أسيتيل جلوكوزامين. F = فوكوز. S = حمض N-acetylneuraminic. فوس = فوسفات. الكبريت = تعديل الكبريتات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ ، وتعديلات الجليكان تعدل النمط المناعي ووظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة. تتطلب هذه الوظائف المناعية طاقة خلوية كبيرة ، والتي يتم توفيرها في الغالب بواسطة الميتوكوندريا. والجدير بالذكر أن بروتينات الميتوكوندريا تقدم أيضا تعديلات جليكان ، والتي ظلت غير مدروسة بشكل كبير بسبب التحديات التكنولوجية في التحقيق في الارتباط بالجليكوزيل دون الخلوي. تعتمد معظم الدراسات التي تبحث في الارتباط بالجليكوزيل في الميتوكوندريا على التحديد القائم على الليكتين لأنماط الجليكان²² ، على الرغم من أن هذه الأساليب محدودة بسبب خصوصية الارتباط الضعيفة لليكتينات. التطورات الأساسية للنهج التقني المقدم في هذه الدراسة هي أنا) العزل القابل للتكرار ل N-glycans في الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الدقيقة و ii) الكشف عن N-glycans الميتوكوندريا وتحديدها باستخدام قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI HRAM. سير العمل الموصوف هنا هو التقرير الأول للكشف عن N-glycans المنبعثة من البروتينات السكرية للميتوكوندريا المعبر عنها عند المستويات الفسيولوجية في الخلايا الدبقية الصغيرة.

في البروتوكول الحالي ، يتم تعظيم عزل الميتوكوندريا باستخدام طريقة العزل القائمة على الكاشف. يمكن دمج ذلك مع طريقة التجانس Dounce لتحسين محصول الميتوكوندريا. عيب استخدام الخالط مقارنة بالعزل القائم على الكاشف هو الاختلاف في قوة وسرعة المدقة بين المشغلين ، مما يؤدي إلى زيادة التباين التجريبي وتقليل قابلية التكاثر. أشارت الدراسات السابقة^23،24 إلى استخدام هذه الطريقة وعدم وجود علامات نووية (لامين ، هيستون H3) وعلامات ER (كالنيكسين ، Erp57) في جزء الميتوكوندريا ، مما يشير إلى نقاء جزء الميتوكوندريا. يتمثل أحد القيود المحتملة للبروتوكول في الحاجة إلى 20 مليون خلية كمادة أولية لعزل الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن التركيز العالي لبروتين الميتوكوندريا الذي لوحظ في دراستنا يسمح بتقليص عدد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولي بمقدار عشرة أضعاف لعزل الميتوكوندريا بناء على التحسين الذي تم إجراؤه في الدراسات السابقة^25،26 (25-250 ميكروغرام من البروتينات) دون فقدان أي إشارات N-glycan. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تجميع العينات البيولوجية للحصول على أعداد خلايا أعلى لعزل الميتوكوندريا في حالة قابلية التوسع المحدودة للبروتوكول لخفض أعداد الخلايا من المصادر الأولية مثل الأنسجة للكشف الفعال عن الجليكان. بالإضافة إلى ذلك ، تعد خطوة إطلاق الجليكان أمرا بالغ الأهمية في هذا البروتوكول. يستخدم N-glycosidase F (PNGase F) لإطلاق جليكانات كاملة وسليمة مرتبطة ب N عن طريق التحلل المائي لرابط الأميد بين N-acetylglucosamine الأعمق (GlcNAc) وبقايا الأسباراجين²⁷. بالنسبة لتحليل N-glycan ، من الأهمية بمكان تحسين نشاط PNGase F لتحقيق إزالة الجليكوزيل الكامل لبروتينات الميتوكوندريا. يساعد تمسخ البروتين باستخدام التعرض للمذيبات والإنزيم الزائد على ضمان الانقسام الفعال والكامل وإطلاق N-glycans من بروتينات الميتوكوندريا. يعد وقت الهضم من 18 إلى 20 ساعة مثاليا لإطلاق N-glycan من خلال إكمال تفاعل PNGase F²⁶.

أحد القيود المحتملة لهذا البروتوكول هو عدم تخصيب مستخلص الميتوكوندريا للبروتينات السكرية في هذه الطريقة. في حين أن البروتينات السكرية منخفضة الوفرة قد لا يتم اكتشافها في التحليل ، فإن هذه الطريقة تقلل من الخطأ والتحيز الناتج عن تنقية تقارب الليكتين أو التخصيب الكيميائي. بينما يوفر IR-MALDESI تحديدا عالي الثقة لتكوين الجليكان المحدد ، فإن المعلومات الدقيقة حول الروابط بين بقايا الجليكان تتطلب مزيدا من التحقيق باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للجليكانات المقربة بالليثيوم لتعزيز الانقسامات عبر الحلقات²⁸ أو هضم الغليكوزيزيزاز الخارجية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام LC-MS / MS بالإضافة إلى أو كبديل لنهج IR-MALDESI ، والذي قد يوفر تغطية جليكان أعمق مع مزيد من التفاصيل الهيكلية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات السابقة العلاقة بين متوسط وفرة الأيونات من IR-MALDESI للمستقلبات مع الكميات المطلقة التي تحددها LC-MS /^{MS 29} ، مما يؤسس أساسا للقياس الكمي المباشر للمستقلبات باستخدام IR-MALDESI. تعد الطبيعة عالية الإنتاجية ل IR-MALDESI مع القدرة على إجراء تحليل MS² لتوفير تأكيد هيكلي عالي الثقة مفيدة للفحص السريع للعينات قبل السريرية والسريرية للمؤشرات الحيوية الجليكان المحتملة وتشخيص المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن الطرد المركزي للطافي بعد النووي عند 3000 × غرام بدلا من 12,000 × جم يقلل من الملوثات البيروكسيزومية والليزوزومية ، فقد لا تزال هناك آثار لهذه البروتينات موجودة في تحضير الميتوكوندريا.

في الختام ، تقدم هذه الدراسة طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية ، مع الحد الأدنى من إعداد العينة لتحليل الغليكوم الميتوكوندريا في الخلايا الدبقية الصغيرة وإمكانية كبيرة للتطبيق في تحديد الأهداف العلاجية الجديدة القائمة على الجليكان للأمراض التنكسية العصبية. يقدم هذا البروتوكول تقييما شاملا وتوحيدا للطرق التحليلية لعزل الميتوكوندريا عن الخلايا الدبقية الصغيرة والتحليل اللاحق لغليكوم الميتوكوندريا لتمكين توسيع نطاق الدراسات قبل السريرية والسريرية على نطاق واسع. يقدم هذا البروتوكول العديد من المزايا لعزل N-glycan واكتشافه: أنا) وقت عزل الميتوكوندريا للبروتوكول القائم على الكاشف منخفض (≤40 دقيقة) ؛ ب) إنتاج البروتينات لإطلاق الجليكان مرتفع ؛ ج) يمكن استخدام نفس عينات الميتوكوندريا المعدة لتحليل N-glycan في التحقيقات البيولوجية الجزيئية الأخرى مثل التحليل البروتيني وتحليل الليكتين وتحليل تدفق الميتوكوندريا. و iv) يسمح قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI HRAM بالكشف السريع والمحسن عن N-glycans بسبب استراتيجية التأين الهجين والناعم²⁸ دون الحاجة إلى الاشتقاق الكيميائي للجليكان المشحونة مثل sialoglycans و sulfoglycans³⁰.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

يود المؤلفون أن يشكروا سيث أيزنبرغ ، طالب الدراسات العليا في مختبر موديمان في NCSU ، لمساعدته في تسجيل الفيديو لبروتوكول الطيف الكتلي. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج زمالة كلية الابتكار الهندسي في جامعة ألاباما في برمنغهام ، AG068309 إلى DJT و R01GM087964-12 إلى DCM. تم رسم المخططات في هذه المخطوطة باستخدام BioRender.