Preparato mitocondriale da microglia per l'analisi dei glicani

È stato sviluppato un protocollo per la preparazione di mitocondri purificati da cellule microgliali, l'isolamento di proteine mitocondriali per il rilascio di N-glicani e il rilevamento rapido di glicani mitocondriali subcellulari utilizzando la ionizzazione elettrospray con desorbimento laser assistito da matrice a infrarossi accoppiata alla spettrometria di massa accurata dell'analizzatore di massa ad alta risoluzione.

Comprendere i modelli di glicosilazione delle proteine mitocondriali nella microglia è fondamentale per determinare il loro ruolo nelle malattie neurodegenerative. Qui, presentiamo una metodologia innovativa e ad alto rendimento per l'analisi glicomica di proteine mitocondriali isolate da microglia in coltura. Questo metodo prevede l'isolamento dei mitocondri da colture microgliali, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, seguita da un'estrazione proteica ottimizzata per massimizzare il rilevamento dei glicani e la spettrometria di massa accurata ad alta risoluzione (HRAM) con ionizzazione elettrospray per desorbimento laser assistita da matrice a infrarossi (IR-MALDESI) per fornire profili dettagliati della glicosilazione mitocondriale.

Questo protocollo sottolinea l'importanza di mantenere l'integrità mitocondriale durante l'isolamento e impiega un rigoroso controllo di qualità per garantire la riproducibilità, compresa la misurazione della purezza mitocondriale dopo l'estrazione. Questo approccio consente la profilazione completa dei cambiamenti di glicosilazione nei mitocondri microgliali in varie condizioni sperimentali in vitro, che offre informazioni sui cambiamenti mitocondriali associati a malattie neurodegenerative. Questo approccio potrebbe essere adattato ad altri trattamenti in vitro , ad altri tipi di cellule in coltura o a cellule primarie. Attraverso questo approccio standardizzato, miriamo a far progredire la comprensione dei glicani mitocondriali microgliali, contribuendo al più ampio campo della ricerca neurodegenerativa.

Le microglia sono le cellule immunitarie innate residenti dominanti nel cervello e rappresentano il 10-15% delle cellule del cervello adulto ^1,2. Usano il loro repertorio recettoriale per monitorare dinamicamente il microambiente cerebrale e regolare la normale funzione cerebrale per mantenere l'omeostasi cerebrale³. Le microglia sono molto sensibili ai cambiamenti nel loro microambiente e subiscono cambiamenti nella morfologia cellulare, nell'immunofenotipo e nella funzione con condizioni patologiche o varie stimolazioni. Gli stati di attivazione microgliale sono influenzati dalle richieste di energia cellulare necessarie per la loro funzione, come la fagocitosi, la produzione di citochine o la riparazione dei tessuti. Pertanto, il metabolismo energetico cellulare svolge un ruolo cruciale nella regolazione dei cambiamenti nella funzione microgliale⁴. La disregolazione microgliale porta a un rilascio eccessivo di citochine pro-infiammatorie (ad es. IL-1β, TNF-α) e specie reattive dell'ossigeno (ROS), predisponendo il cervello alla neuroinfiammazione ^5,6. La disregolazione cronica della microglia e il conseguente ambiente neuroinfiammatorio gettano le basi per la neurodegenerazione⁷.

Il cervello rappresenta solo il 2% del peso corporeo, ma il 20% del consumo totale di energia del corpo. I mitocondri sono la principale fonte di energia nelle cellule cerebrali e agiscono come attori chiave nella patogenesi dei disturbi cerebrali sia acuti che cronici⁸. Studi precedenti hanno stabilito una forte correlazione tra l'attivazione microgliale e la disfunzione metabolica nell'invecchiamento⁹ e i disturbi legati all'età come il morbo di Alzheimer^10,11, evidenziando il ruolo fondamentale dei mitocondri nella senescenza cellulare e nella neurodegenerazione. La funzione mitocondriale compromessa porta a una diminuzione della produzione di energia, a un elevato stress ossidativo e a un aumento della neuroinfiammazione durante l'invecchiamento e le malattie legate all'età.

Mentre un'ampia ricerca ha chiarito il ruolo dei mitocondri nel metabolismo energetico, nell'invecchiamento e nei disturbi cerebrali, il ruolo delle comuni modificazioni post-traduzionali, come la glicosilazione, nella biologia e nella funzione mitocondriale rimane insufficientemente esplorato. La glicosilazione, l'aggiunta enzimatica di porzioni di zucchero chiamate glicani alle proteine da parte degli enzimi di glicosilazione, è la modifica post-traduzionale più comune nella maggior parte delle cellule cerebrali, comprese le microglia. Le microglia attivate modulano la loro funzione immunitaria sotto stimoli infiammatori regolando l'espressione intracellulare o della superficie cellulare dei glicani¹². Le risposte pro e anti-infiammatorie esibite dalla microglia post-stimolazione sono regolate anche dai glicani¹³. Anche le proteine mitocondriali hanno queste modificazioni dei glicani, che ne regolano la funzione e la localizzazione. Tuttavia, un'analisi dettagliata dei modelli di glicosilazione mitocondriale specifici della cellula nella microglia è carente a causa delle sfide tecniche nello studio della glicosilazione subcellulare. Nonostante il ruolo ben caratterizzato della glicosilazione nella modulazione del fenotipo microgliale, il ruolo dei glicani nella modulazione della funzione mitocondriale e, successivamente, l'immunofenotipo cellulare nella microglia rimane poco compreso.

Studi limitati che indagano la glicosilazione delle proteine mitocondriali si sono concentrati principalmente sull'identificazione dei pattern di glicosilazione basata sulla lectina. Le lectine sono proteine leganti i glicani che legano le porzioni biomolecolari di glicani^14,15, che mancano della specificità e della capacità di fornire informazioni dettagliate sulla composizione dei glicani. Le modalità di spettrometria di massa offrono un'identificazione dettagliata delle composizioni dei glicani per superare le sfide analitiche presentate dall'analisi delle lectine. Una di queste modalità, la ionizzazione elettrospray a desorbimento laser assistita da matrice infrarossa (IR-MALDESI), impiega una strategia di ionizzazione ibrida, utilizzando un laser a medio infrarosso per eccitare in modo risonante l'acqua presente nei campioni biologici¹⁶ per desorbire le specie neutre e sottoporle a un pennacchio elettrospray ortogonale, seguita dall'analisi utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap ad alta risoluzione. IR-MALDESI è stato precedentemente dimostrato per l'analisi diretta dei metaboliti tissutali¹⁷, con distinti vantaggi dell'analisi rapida¹⁸, del metodo di ionizzazione morbida e della prevedibilità del contenuto di acido sialico dei glicani legati all'N in base ai modelli di distribuzione isotopica degli addotti dei glicani clorurati¹⁹. Tuttavia, l'adattamento di questa piattaforma per l'analisi diretta dei glicani subcellulari non è stato dimostrato.

Qui, riportiamo un protocollo ad alto rendimento per l'isolamento mitocondriale da cellule microgliali, l'isolamento di N-glicani mitocondriali e il rilevamento e l'analisi di N-glicani mitocondriali utilizzando la spettrometria di massa IR-MALDESI. Questo protocollo sarà fondamentale per scoprire nuove intuizioni sul ruolo della glicosilazione nella funzione mitocondriale, identificando potenzialmente nuovi bersagli terapeutici per disturbi neuroinfiammatori e neurodegenerativi.

1. Coltura di linee cellulari microgliali BV2

1. Mantenere le cellule BV-2 (cellule microgliali derivate da topi C57BL/6) in terreni DMEM a basso contenuto di glucosio integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillium-streptomicina (PenStrep) e l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA).
2. Far crescere le cellule in fiasche T-175 e lasciare che raggiungano il 70-80% di confluenza.
3. Dividere le cellule incubando con gli enzimi di dissociazione cellulare per 5 minuti a 37 °C in CO₂ al 5%, seguita dall'inattivazione degli enzimi con un volume uguale di mezzi cellulari e dalla centrifugazione delle cellule per 5 minuti a 500 × g a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Gli enzimi di dissociazione cellulare utilizzati qui sono più delicati sulle cellule BV2 rispetto alla tripsina e possono essere utilizzati per proteggere l'espressione dell'antigene sulla superficie cellulare.
4. Aspirare il terreno, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura e contare le cellule utilizzando il blu di tripano (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Per questo passaggio è stato utilizzato un contatore di celle automatizzato per il conteggio delle cellule.
5. Per effettuare l'isolamento mitocondriale, procedere se il pellet cellulare contiene 2 × 10⁷ (20 milioni di cellule/pellet).

2. Isolamento dei mitocondri da cellule microgliali

NOTA: Lavora velocemente, mantenendo tutto in ghiaccio durante tutta la procedura. Il kit di isolamento mitocondriale utilizzato per l'isolamento mitocondriale è composto da tre componenti: reagenti A (tampone di lisi cellulare), reagente B (tampone stabilizzante) e reagente C (tampone di lavaggio mitocondriale). Aggiungere gli inibitori della proteasi al reagente A e al reagente C immediatamente prima dell'uso.

1. Pellet 2 × 10⁷ celle centrifugando le cellule raccolte in una provetta da microcentrifuga da 2,0 mL a 500 × g per 5 min. Aspirare con cura ed eliminare il surnatante.
2. Aggiungere 800 μl di reagente di isolamento mitocondriale A (tampone di lisi cellulare), agitare a velocità media per 5 s e incubare la provetta su ghiaccio per esattamente 2 minuti.
   NOTA: Non superare i 2 minuti di incubazione.
3. Aggiungere 10 μl di reagente di isolamento mitocondriale B (tampone stabilizzante), agitare alla massima velocità per 5 s e incubare la provetta su ghiaccio per 5 minuti, agitando alla massima velocità ogni minuto.
4. Aggiungere 800 μl di reagente C per l'isolamento dei mitocondri (tampone di lavaggio mitocondriale), capovolgere più volte la provetta per miscelarla e centrifugare la provetta a 700 × g per 10 minuti a 4 °C.
   NOTA: Non vortice.
5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2,0 ml e centrifugare a 3.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
6. Trasferire il surnatante (porzioni citosoliche) in una nuova provetta. Il pellet contiene i mitocondri isolati.
7. Aggiungere 500 μl di reagente C per l'isolamento dei mitocondri al pellet e centrifugare a 12.000 × g per 5 minuti.
8. Utilizzare il pellet per la quantificazione e la lavorazione delle proteine o conservare il pellet a -80 °C fino a nuovo utilizzo.

3. Stima delle proteine mediante saggio di microBCA

NOTA: La stima delle proteine per questo protocollo può essere eseguita utilizzando diversi reagenti e saggi. La quantificazione delle proteine citosoliche o mitocondriali può essere eseguita normalizzando rispetto alla concentrazione proteica totale utilizzata nel saggio.

1. Preparare standard di albumina sierica bovina (BSA) tra 0 μg/mL e 200 μg/mL (0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) e bianchi con solo tampone di lisi.
2. Aggiungere 150 μl di ciascuno standard nella piastra a 96 pozzetti a fondo piatto contenente i campioni.
3. Miscelare 25 parti di reagente Micro BCA MA (soluzione di acido bicinconninico (BCA)) e 24 parti di reagente MB (soluzione di solfato di rame) con 1 parte di reagente MC (tampone stabilizzante) (25:24:1, reagenti MA:MB:MC) per creare un reagente funzionante. Aggiungere 150 μl del reagente BCA miscelato a ciascun campione e standard.
4. Incubare a 37 °C per 2 ore.
5. Utilizzare un lettore di piastre per misurare l'assorbanza a 562 nm e quantificare la concentrazione proteica con la curva standard. Sottrarre l'assorbanza standard in bianco dalla misurazione dell'assorbanza di tutti gli altri standard individuali e delle repliche di campioni sconosciuti per ottenere le concentrazioni proteiche del campione.

4. Controllo di qualità della preparazione mitocondriale (western blot)

1. Risospendere il pellet mitocondriale nel tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) per eseguire la quantificazione delle proteine. Determinare la concentrazione proteica per ciascun campione utilizzando il test micro BCA.
2. Denaturare i campioni in tampone a 94 ^oC per 5 minuti.
3. Caricare quantità uguali (20 μg) di proteina mitocondriale su gel prefabbricati (vedere la Tabella dei materiali), insieme al marcatore di peso molecolare.
4. Far funzionare il gel per 50 minuti a 100 V.
   NOTA: Il tempo di esecuzione può variare, quindi assicurarsi di interrompere il gel quando le proteine hanno raggiunto la fine del gel indicata dal colorante nel tampone del campione.
5. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando il protocollo di trasferimento a secco in un sistema di trasferimento western blot per 7 minuti a 20 V.
6. Estrarre la membrana e bloccare con la soluzione bloccante (Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Aggiungere appropriate diluizioni dell'anticorpo primario alla membrana nel tampone bloccante durante la notte a 4 ^oC (COXIV= 1:3.000, GAPDH =1:3.000).
   NOTA: L'assenza di contaminazione nucleare, del reticolo endoplasmatico (ER) nella preparazione mitocondriale può essere testata utilizzando marcatori aggiuntivi come la lamina (marcatore nucleare) e ERp57 (marcatore ER) nei western blot.
8. Lavare la membrana per 3 x 15 minuti con il tampone di lavaggio (Tabella 1).
9. Incubare la membrana con l'appropriata diluizione dell'anticorpo secondario coniugato HRP in tampone bloccante a temperatura ambiente per 1 ora
10. Lavare la membrana per 3 x 15 minuti con il tampone di lavaggio.
11. Per lo sviluppo, utilizzare un kit di substrato chemiluminescente.
12. Scansiona la membrana utilizzando un gel e un imager a membrana.

5. Isolamento di proteine mitocondriali per l'estrazione di N-glicani dalla microglia

1. Risospendere i mitocondri isolati in 50 μL di tampone di isolamento proteico (Tabella 1) e lasciare in ghiaccio per 20 minuti.
2. Aspirare ed erogare tre volte e lasciare 20 minuti sul ghiaccio (vortice prima dell'uso). Se il pellet mitocondriale non è completamente solubilizzato, aggiungere altri 50 μl del tampone di isolamento e raggrupparlo nella stessa provetta.
3. Centrifugare a 13.000 × g per 10 min.
4. Recuperare il surnatante, congelare a -80 ^oC per un minimo di 1 ora e asciugare il più possibile in un concentratore sottovuoto.
5. Risospendere prima dell'isolamento dei glicani utilizzando il tampone digest PNGase (Tabella 1) per IR-MALDESI.

6. Preparato di N-glicani mitocondriali per IR-MALDESI

1. Caricare 25-250 μg di proteine (in un volume massimo di 250 μL) di proteine mitocondriali isolate su un filtro di cut-off del peso molecolare (MWCO) da 10 kDa.
2. Ridurre i campioni di proteine per esporre le frazioni di glicani aggiungendo 2 μL di 1 M ditiotreitolo (DTT) a ciascun campione nel filtro.
3. Diluire il campione con 200 μL di tampone digestivo PNGase e vorticare leggermente per evitare di disturbare il filtro.
4. Denaturare le proteine mitocondriali incubando il campione a 56 °C per 30 minuti.
5. Utilizzare 50 μl di iodoacetamide 1 M per alchilare i mitocondri per ottenere una concentrazione finale di ~200 mM e incubare a 37 °C per 60 min.
6. Per concentrare ulteriormente i metodi mitocondriali denaturati, centrifugare i campioni a 14.000 × g per 40 minuti. Scartare il flusso.
7. Lavare il campione con 100 μL di tampone digest PNGasi.
8. Concentrare la glicoproteina sul filtro a 14.000 × g per 20 minuti ed eliminare il flusso. Ripetere la fase di lavaggio e concentrazione 2 volte, per un totale di 3 volte, ottenendo un concentrato nel volume morto del filtro (~5 μL). Scartare tutto il flusso.
9. Gettare la fiala di raccolta una volta completati i lavaggi. Utilizzare una nuova fiala di raccolta per tutti gli eluenti e i lavaggi futuri.
10. Per scindere i glicani dai glicopattern mitocondriali denaturati, trasferirli in una nuova fiala di raccolta e aggiungere 2 μL di PNGasi priva di glicerolo (75.000 unità/mL) al filtro. Aggiungere 98 μl di tampone digest PNGasi, portando il volume totale a 100 μl e mescolare pipettando delicatamente su e giù sul filtro.
11. Incubare i campioni a 37 °C per 18 ore per scindere enzimaticamente tutti gli N-glicani dalle proteine mitocondriali.
12. Eluire gli N-glicani mitocondriali rilasciati centrifugando il campione a 14.000 × g per 20 minuti a 20 °C.
13. Lavare i glicani mitocondriali aggiungendo 100 μL di tampone digestivo PNGase al filtro e centrifugare a 14.000 × g per 20 minuti a 20 °C. Raccogliere il lavaggio contenente eventuali N-glicani rimanenti nella stessa fiala di raccolta dell'eluente. Ripetere 2 volte e rimuovere il filtro dalla fiala di raccolta.
14. Incubare i campioni di glicani mitocondriali nel congelatore a -80 °C fino a congelarli (30-60 min) e asciugarli fino al completamento a temperatura ambiente in un concentratore sottovuoto (4-6 ore per 400 μL).
    NOTA: Gli N-glicani possono essere conservati a -20 °C per un massimo di 6 mesi prima dell'analisi.
15. Risospendere i glicani N-linked essiccati in 50 μL di acqua di grado LC/MS direttamente prima dell'analisi IR-MALDESI.

7. Rilevamento dei glicani rilasciati mediante spettrometria di massa IR-MALDESI

1. Eseguire la calibrazione della massa ogni giorno dell'esperimento. Caricare la soluzione di calibrazione su una pompa a siringa e spingerla a una velocità di 1,2 μl/min. Applicare una tensione di 3,5 kV per ottenere un pennacchio elettrospray stabile per la calibrazione della massa sia in modalità positiva che negativa.
2. Pipettare 5 μl di glicani mitocondriali risospesi su un punto del campione su un vetrino per micropozzetti in teflon.
3. Utilizzare un laser a medio infrarosso operante a una lunghezza d'onda di 2,97 μm per l'ablazione con un'energia di 1,8 mJ per burst.
4. Ionizzare e rilevare gli N-glicani in modalità di ionizzazione negativa. Utilizzare un solvente elettrospray composto per il 60% da acetonitrile e 1 mM di acido acetico per creare un pennacchio elettrospray stabile con una portata di 2 μL/min a una tensione di 3,2 kV.
5. Per eseguire l'analisi, accoppiare IR-MALDESI a uno spettrometro di massa HRAM impostato su una potenza di risoluzione della massa di 240.000_FWHM a m/z 200, analizzando tra 500 e 2.000 m/z in modalità di ionizzazione negativa.
6. Disattivare il controllo automatico del guadagno (AGC) e impostare un tempo di iniezione fisso di 90 ms. Utilizza la sorgente EasyIC per la calibrazione interna in tempo reale di ogni spettro per ottenere un'elevata precisione di misurazione della massa (MMA).

8. Analisi dei dati di N-glicani mitocondriali

1. Identificare manualmente i glicani legati all'N cercando le masse monoisotopiche e confermando le distribuzioni isotopiche utilizzando la spaziatura m/z per determinare gli ioni doppiamente e triplicamente caricati che hanno una soglia minima di flusso ionico di 1.000 ioni/s.
2. Converti gli spettri di massa grezza da rapporti m/z a masse monoisotopiche neutre.
3. Carica le masse monoisotopiche su uno strumento di previsione della struttura degli oligosaccaridi online per determinare le potenziali composizioni dei glicani. Confermare le annotazioni utilizzando un database glicomico curato sperimentalmente²⁰; assicurarsi che ogni identificazione rientri nel margine di 2,5 ppm di MMA, contenga la struttura centrale del glicano legato all'N (Hex₃HexNAc₂) ed escluda i monosaccaridi pentoso, KDN o HexA.
4. Disegnare le strutture dei glicani confermate utilizzando la nomenclatura SNFG²¹.
5. Ottenere l'abbondanza relativa di glicani dagli spettri di massa grezza e normalizzare rispetto alla quantità di proteina mitocondriale in μg per ottenere ioni/s/μg.
6. Utilizzare l'analisi del Chi quadrato per testare la bontà dell'adattamento tra le distribuzioni teoriche e sperimentali dei glicani legati all'N per determinare il numero di addotti del cloro. Ciò consente la determinazione diretta del numero di acidi sialici¹⁹.

La Figura 1 rappresenta uno schema schematico delle fasi coinvolte nell'isolamento dei mitocondri dalla linea cellulare microgliale BV2 per l'analisi spettrometrica di massa dei glicani. La riproducibilità dell'isolamento delle proteine mitocondriali tra diverse preparazioni mitocondriali dalla stessa densità iniziale delle cellule microgliali è rappresentata nella Figura 2, che non mostra differenze significative tra la concentrazione di proteine mitocondriali stimata utilizzando il saggio micro BCA.

La Figura 3 rappresenta la purezza degli isolamenti mitocondriali utilizzando l'analisi western blot di COX IV e GAPDH. Qui, vediamo l'espressione della proteina mitocondriale COX IV nella frazione mitocondriale isolata nella fase finale dell'isolamento basato su reagente utilizzato nel protocollo. Gli immunoblot mostrano una prominente banda COX IV nella frazione mitocondriale isolata, mentre GAPDH viene rilevato solo nella frazione citoplasmatica alla stessa esposizione. Tempi di esposizione più lunghi possono comportare il rilevamento di una banda GAPDH debole. L'espressione del marcatore non mitocondriale GAPDH è evidente nell'intero lisato cellulare dopo l'isolamento dei mitocondri, senza le bande CoxIV, indicando un completo isolamento della frazione mitocondriale e una minima contaminazione non mitocondriale. L'espressione di COX IV nelle frazioni mitocondriali è coerente tra diverse preparazioni con densità cellulare iniziale simile di 2 × 10⁷ cellule.

Gli spettri di massa rappresentativi degli N-glicani rilasciati rilevati utilizzando IR-MALDESI nella Figura 4 mostrano la presenza di diversi N-glicani caricati fosforilati, solfatati e sialilati rilasciati dall'estratto proteico mitocondriale utilizzando il trattamento con PNGasi. La Tabella 2 riporta tutte le composizioni di glicani che sono state identificate nell'intero spettro ma non sono state riportate in GlyConnect. I valori del Chi quadrato che testano una bontà di adattamento confermano la rilevazione di glicani legati all'N con uno e due addotti di cloro, confermando la rilevazione di queste composizioni di glicani utilizzando IR-MALDESI nella Figura 5.

Figura 1: Schema del protocollo. Cenni schematici dell'isolamento mitocondriale, del controllo di qualità, dell'estrazione proteica, del rilascio di N-glicani e della stima mediante spettrometria di massa IR-MALDESI HRAM da linea cellulare microgliale BV2 per la rilevazione ad alto rendimento di N-glicani mitocondriali. Abbreviazione: IR-MALDESI HRAM = analizzatore di massa accurato ad alta risoluzione a ionizzazione elettrospray a desorbimento laser assistito da matrice infrarossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Isolamento di proteine mitocondriali da cellule BV2. (A) Curva standard per il saggio di micro BCA utilizzando diverse concentrazioni di BSA. (B) Riproducibilità dell'isolamento della proteina mitocondriale rappresentata da un contenuto proteico costante da 2 × 10⁷ cellule in sei preparazioni mitocondriali indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Purezza della preparazione mitocondriale. Western blot rappresentativo per la frazione citoplasmatica e mitocondri isolati da cellule microgliali BV2. La figura rappresenta l'immunoblotting della frazione citoplasmatica e dei mitocondri isolati con anticorpo COX IV (marcatore mitocondriale) e anticorpo GAPDH (controllo citoplasmatico). L'assenza di bande GAPDH nei mitocondri isolati indica una contaminazione crociata minima e la purezza della preparazione mitocondriale per la successiva analisi degli N-glicani. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Determinazione della composizione dell'identificazione degli N-glicani mitocondriali mediante spettrometria di massa IR-MALDESI HRAM. Spettri di massa dei glicani nell'intervallo 1.700-2.000 m/z che mostrano un numero significativo di picchi a carica multipla con le strutture annotate determinate utilizzando Glycomod. Abbreviazione: IR-MALDESI HRAM = analizzatore di massa accurato ad alta risoluzione a ionizzazione elettrospray a desorbimento laser assistito da matrice infrarossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Verifica degli N-glicani mitocondriali rilevati. Distribuzioni isotopiche rappresentative per quattro glicani mitocondriali legati all'N (A-D) che mostrano una sovrapposizione della distribuzione osservata con distribuzioni teoriche di cloro e addotti deprotonati. I valori del Chi quadrato sugli spettri sovrapposti rappresentano la bontà dell'adattamento e confermano la rilevazione di glicani legati all'N con uno e due addotti di cloro. Questa è un'ulteriore conferma della rilevazione di queste composizioni di glicani mediante IR-MALDESI. Abbreviazione: IR-MALDESI = Ionizzazione elettrospray a desorbimento laser assistita da matrice infrarossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ricette di soluzioni e tamponi utilizzate nel protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Glicani legati all'N deprotonati caricati in modo definibile rilevati nei mitocondri con elevata precisione di misurazione della massa in Glycomod. Notazione abbreviata del glicano: H = esoso; N = N-acetilglucosamina; F = fucosio; S = acido N-acetilneuraminico; Phos = fosfato; Solfo = modifica del solfato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti del cervello e le modificazioni dei glicani modulano l'immunofenotipo e la funzione della microglia. Queste funzioni immunitarie richiedono una notevole energia cellulare, che viene fornita prevalentemente dai mitocondri. In particolare, le proteine mitocondriali presentano anche modificazioni dei glicani, che sono rimaste significativamente poco studiate a causa delle sfide tecnologiche nello studio della glicosilazione subcellulare. La maggior parte degli studi che indagano la glicosilazione mitocondriale si basano sull'identificazione basata sulle lectine dei pattern di glicani²², sebbene questi approcci siano limitati dalla scarsa specificità di legame delle lectine. I progressi essenziali dell'approccio tecnico presentato in questo studio sono i) l'isolamento riproducibile di N-glicani mitocondriali da cellule microgliali e ii) il rilevamento e l'identificazione di N-glicani mitocondriali mediante spettrometria di massa IR-MALDESI HRAM. Il flusso di lavoro qui descritto è il primo rapporto sulla rilevazione di N-glicani rilasciati dalle glicoproteine mitocondriali espresse a livelli fisiologici nelle cellule microgliali.

Nel presente protocollo, l'isolamento mitocondriale è massimizzato utilizzando il metodo di isolamento basato su reagenti. Questo può essere combinato con il metodo di omogeneizzazione Dounce per migliorare la resa mitocondriale. Uno svantaggio dell'utilizzo dell'omogeneizzatore rispetto all'isolamento basato su reagenti è la variazione della forza e della velocità del pestello tra gli operatori, che si traduce in una maggiore variazione sperimentale e in una ridotta riproducibilità. Studi precedenti^23,24 hanno indicato l'uso di questo metodo e l'assenza di marcatori nucleari (lamina, istone H3) e ER (calnexina, Erp57) nella frazione mitocondriale, indicando la purezza della frazione mitocondriale. Una potenziale limitazione del protocollo è la necessità di 20 milioni di cellule come materiale di partenza per l'isolamento dei mitocondri. Tuttavia, l'elevata concentrazione di proteine mitocondriali osservata nel nostro studio consente una riduzione di dieci volte del numero iniziale di cellule microgliali per l'isolamento mitocondriale sulla base dell'ottimizzazione eseguita in studi precedenti^25,26 (25-250 μg di proteine) senza perdere alcun segnale N-glicano. Inoltre, il raggruppamento di campioni biologici per ottenere un numero maggiore di cellule per l'isolamento mitocondriale potrebbe essere eseguito in caso di limitata scalabilità del protocollo per ridurre il numero di cellule da fonti primarie come i tessuti per un rilevamento efficiente dei glicani. Inoltre, la fase di rilascio del glicano è fondamentale in questo protocollo. La N-glicosidasi F (PNGasi F) viene utilizzata per rilasciare glicani N-linked completi e intatti idrolizzando il legame ammidico tra la N-acetilglucosamina (GlcNAc) più interna e il residuo di asparagina ²⁷. Per l'analisi degli N-glicani, è fondamentale ottimizzare l'attività della PNGasi F per ottenere la completa de-glicosilazione delle proteine mitocondriali. La denaturazione delle proteine mediante esposizione al solvente e l'eccesso di enzimi aiuta a garantire una scissione e un rilascio efficienti e completi degli N-glicani dalle proteine mitocondriali. Un tempo di digestione di 18-20 ore è ottimale per il rilascio di N-glicani completando la reazione PNGasi F²⁶.

Una potenziale limitazione di questo protocollo è la mancanza di arricchimento dell'estratto mitocondriale per le glicoproteine in questo metodo. Sebbene le glicoproteine a bassa abbondanza possano non essere rilevate nell'analisi, questo metodo riduce al minimo l'errore e la distorsione introdotti dalla purificazione dell'affinità delle lectine o dall'arricchimento chimico. Mentre IR-MALDESI fornisce un'identificazione ad alta confidenza della composizione dei glicani identificati, informazioni precise sui legami tra i residui di glicani richiedono ulteriori indagini utilizzando la spettrometria di massa tandem di glicani addotti dal litio per migliorare le scissioni ad anello incrociato²⁸ o le digestioni esoglicosidasi. In alternativa, la LC-MS/MS può essere utilizzata in aggiunta o in alternativa all'approccio IR-MALDESI, che può fornire una copertura più profonda dei glicani con più dettagli strutturali. Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato la correlazione tra l'abbondanza media di ioni da IR-MALDESI per i metaboliti con le quantità assolute determinate da LC-MS/MS²⁹, stabilendo una base per la quantificazione diretta dei metaboliti utilizzando IR-MALDESI. La natura ad alto rendimento di IR-MALDESI con la capacità di eseguire l'analisi MS² per fornire una conferma strutturale ad alta confidenza è fondamentale per lo screening rapido di campioni preclinici e clinici per potenziali biomarcatori di glicani e diagnosi di malattia. Inoltre, va notato che sebbene la centrifugazione del surnatante post-nucleare a 3000 × g invece che a 12.000 × g minimizzi i contaminanti perossisomiali e lisosomiali, potrebbero esserci ancora tracce di queste proteine presenti nel preparato mitocondriale.

In conclusione, questo studio presenta un metodo semplice e ad alto rendimento, con una preparazione minima del campione per l'analisi del glicoma mitocondriale nelle cellule microgliali e un grande potenziale di applicazione nell'identificazione di nuovi bersagli terapeutici a base di glicani per le malattie neurodegenerative. Questo protocollo presenta una valutazione completa e una standardizzazione dei metodi analitici per l'isolamento mitocondriale dalla microglia e la successiva analisi del glicoma mitocondriale per consentire lo scale-up per studi preclinici e clinici su larga scala. Questo protocollo presenta diversi vantaggi per l'isolamento e la rilevazione di N-glicani: i) il tempo di isolamento mitocondriale per il protocollo basato su reagenti è basso (≤40 min); ii) la resa di proteine per il rilascio di glicani è elevata; iii) gli stessi campioni mitocondriali preparati per l'analisi degli N-glicani possono essere utilizzati per altre indagini di biologia molecolare come l'analisi proteomica, l'analisi delle lectine e l'analisi del flusso mitocondriale; e iv) la spettrometria di massa IR-MALDESI HRAM consente una rilevazione rapida e migliorata degli N-glicani grazie alla strategia di ionizzazione ibrida e morbida²⁸ senza la necessità di derivatizzazione chimica dei glicani carichi come i sialogcani e i solfoglicani³⁰.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Gli autori desiderano ringraziare Seth Eisenberg, studente laureato presso il Muddiman Lab della NCSU, per il suo aiuto nella registrazione video del protocollo di spettrometria di massa. Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma School of Engineering Innovation Fellows dell'Università dell'Alabama a Birmingham, AG068309 a D.J.T. e R01GM087964-12 a D.C.M. Gli schemi in questo manoscritto sono stati disegnati utilizzando BioRender.