用于聚糖分析的小胶质细胞线粒体制备

开发了一种方案，用于从小胶质细胞制备纯化的线粒体，分离线粒体蛋白以释放 N-糖，以及使用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离与高分辨率精确质量分析仪质谱联用快速检测亚细胞线粒体聚糖。

了解小胶质细胞中线粒体蛋白的糖基化模式对于确定它们在神经退行性疾病中的作用至关重要。在这里，我们提出了一种新颖的高通量方法，用于对从培养的小胶质细胞中分离的线粒体蛋白进行糖组分析。该方法包括从小胶质细胞培养物中分离线粒体，对线粒体样品进行质量评估，然后进行优化的蛋白质提取以最大限度地提高聚糖检测能力，以及红外基质辅助激光解吸电喷雾电离 （IR-MALDESI） 高分辨率精确质量 （HRAM） 质谱法，以提供线粒体糖基化的详细概况。

该方案强调了在分离过程中保持线粒体完整性的重要性，并采用严格的质量控制来确保可重复性，包括在提取后测量线粒体纯度。这种方法允许在 体外各种实验条件下全面分析小胶质细胞线粒体中的糖基化变化，从而深入了解与神经退行性疾病相关的线粒体变化。这种方法可以适用于其他 体外 处理、其他培养细胞类型或原代细胞。通过这种标准化方法，我们的目标是促进对小胶质细胞线粒体聚糖的理解，为更广泛的神经退行性研究领域做出贡献。

小胶质细胞是大脑中占主导地位的先天免疫细胞，占成人大脑细胞的 10-15% ^1,2。他们使用自己的受体库来动态监测大脑微环境并调节正常的大脑功能以维持大脑稳态³。小胶质细胞对其微环境的变化非常敏感，并在病理条件或各种刺激下经历细胞形态、免疫表型和功能的变化。小胶质细胞激活状态受其功能所需的细胞能量需求的影响，例如吞噬作用、细胞因子产生或组织修复。因此，细胞能量代谢在调节小胶质细胞功能的变化中起着至关重要的作用⁴。小胶质细胞失调导致促炎细胞因子（例如 IL-1β、TNF-α）和活性氧 （ROS） 的过度释放，使大脑易发生神经炎症 ^5,6。慢性小胶质细胞失调和由此产生的神经炎症环境为神经退行性变奠定了基础⁷。

大脑只占体重的 2%，但占身体总能量消耗的 20%。线粒体是脑细胞的主要能量来源，在急性和慢性脑部疾病的发病机制中起着关键作用⁸。以前的研究已经确定了⁹ 岁和阿尔茨海默病等年龄相关疾病中小胶质细胞活化与代谢功能障碍之间的强相关性^10,11，^强调了线粒体在细胞衰老和神经退化中的关键作用。线粒体功能受损会导致衰老和年龄相关疾病期间能量产生减少、氧化应激升高以及神经炎症增加。

虽然广泛的研究已经阐明了线粒体在能量代谢、衰老和脑部疾病中的作用，但常见的翻译后修饰（如糖基化）在线粒体生物学和功能中的作用仍未得到充分探索。糖基化，即糖基化酶促将称为聚糖的糖基团酶促加成到蛋白质上，是大多数脑细胞（包括小胶质细胞）中最常见的翻译后修饰。活化的小胶质细胞通过调节细胞内或细胞表面聚糖表达，在炎症刺激下调节其免疫功能¹²。小胶质细胞刺激后表现出的促炎和抗炎反应也受聚糖调节¹³。线粒体蛋白也具有这些聚糖修饰，可调节它们的功能和定位。然而，由于研究亚细胞糖基化的技术挑战，缺乏对小胶质细胞中细胞特异性线粒体糖基化模式的详细分析。尽管糖基化在调节小胶质细胞表型中的作用已得到充分表征，但聚糖在调节线粒体功能以及随后的作用中，小胶质细胞中的细胞免疫表型仍然知之甚少。

调查线粒体蛋白糖基化的有限研究主要集中在基于凝集素的糖基化模式鉴定上。凝集素是结合生物分子聚糖部分^14,15 的聚糖结合蛋白，缺乏提供有关聚糖组成详细信息的特异性和能力。质谱模式提供了聚糖组成的详细鉴定，以克服凝集素分析带来的分析挑战。其中一种模式是红外基质辅助激光解吸电喷雾电离 （IR-MALDESI），它采用混合电离策略，使用中红外激光共振激发生物样本¹⁶ 中发现的水，以解吸中性物质并使其受到正交电喷雾羽流的影响，然后使用高分辨率精确质量 Orbitrap 质谱仪进行分析。IR-MALDESI 先前已被证明可用于组织代谢物的直接分析¹⁷，具有快速分析¹⁸、软电离法以及基于氯化聚糖加合物同位素分布模式的 N-连接聚糖唾液酸含量的可预测性¹⁹ 的明显优势。然而，该平台用于直接分析亚细胞聚糖的适应性尚未得到证实。

在这里，我们报道了一种从小胶质细胞中分离线粒体、分离线粒体 N-聚糖以及使用 IR-MALDESI 质谱法进行线粒体 N-聚糖检测和分析的高通量方案。该协议将是揭示糖基化在线粒体功能中的作用的新见解的基础，有可能确定神经炎症和神经退行性疾病的新治疗靶点。

1. BV2 小胶质细胞系培养

1. 将 BV-2 细胞（源自 C57BL/6 小鼠的小胶质细胞）维持在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉菌-链霉素 （PenStrep） 和 1% 非必需氨基酸 （NEAA） 的 DMEM 低葡萄糖培养基中。
2. 在 T-175 培养瓶中培养细胞，并使其达到 70-80% 汇合。
3. 通过在 37 °C 下在 5% CO₂ 中与细胞解离酶孵育 5 分钟来分裂细胞，然后用等体积的细胞培养基灭活酶，并在室温 （RT） 下以 500 × g 离心细胞 5 分钟。
   注：此处使用的细胞解离酶对 BV2 细胞比胰蛋白酶更温和，可用于保护细胞表面抗原表达。
4. 吸出培养基，将细胞沉淀重悬于 1 mL 生长培养基中，并使用台盼蓝对细胞进行计数（参见 材料表）。
   注意：我们在此步骤中使用了自动细胞计数器来计数细胞。
5. 要进行线粒体分离，如果细胞沉淀包含 2 × 10⁷ （2000 万个细胞/沉淀），则继续进行。

2. 从小胶质细胞中分离线粒体

注意：快速工作，在整个过程中保持所有物品都在冰上。用于线粒体分离的线粒体分离试剂盒具有三个组分：试剂 A（细胞裂解缓冲液）、试剂 B（稳定缓冲液）和试剂 C（线粒体洗涤缓冲液）。临用前向试剂 A 和试剂 C 中加入蛋白酶抑制剂。

1. 通过在 2.0 mL 微量离心管中以 500 × g 离心收获的细胞 5 分钟，将收获的细胞沉淀 2 × 10⁷ 个细胞。小心吸出并丢弃上清液。
2. 加入 800 μL 线粒体分离试剂 A（细胞裂解缓冲液），以中速涡旋 5 秒，然后将试管在冰上孵育 2 分钟。
   注意：孵育时间不要超过 2 分钟。
3. 加入 10 μL 线粒体分离试剂 B（稳定缓冲液），以最大速度涡旋 5 秒，并将试管在冰上孵育 5 分钟，每分钟以最大速度涡旋。
4. 加入 800 μL 线粒体分离试剂 C（线粒体洗涤缓冲液），倒置试管数次混合，并在 4 °C 下以 700 × g 离心试管 10 分钟。
   注意：请勿涡旋。
5. 将上清液转移到新的 2.0 mL 试管中，并在 4 °C 下以 3,000 × g 旋转 15 分钟。
6. 将上清液（胞质部分）转移到新管中。该颗粒包含分离的线粒体。
7. 向沉淀中加入 500 μL 线粒体分离试剂 C，并以 12,000 × g 离心 5 分钟。
8. 使用沉淀进行蛋白质定量和加工，或将沉淀储存在 -80 °C 直至进一步使用。

3. 使用 microBCA 测定法进行蛋白质估计

注：可以使用不同的试剂和测定法进行该方案的蛋白质估计。细胞溶质或线粒体蛋白的定量可以通过对测定中使用的总蛋白浓度进行归一化来进行。

1. 制备 0 μg/mL 至 200 μg/mL（0 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、200 μg/mL）的牛血清白蛋白 （BSA） 标准品和仅含裂解缓冲液的空白。
2. 将 150 μL 每种标准品添加到装有样品的平底 96 孔板中。
3. 将 25 份微量 BCA 试剂 MA（二辛可宁酸 （BCA） 溶液）和 24 份试剂 MB（硫酸铜溶液）与 1 份试剂 MC（稳定缓冲液）（25：24：1，试剂 MA：MB：MC）混合，制成工作试剂。向每个样品和标准品中加入 150 μL 混合 BCA 试剂。
4. 在 37 °C 下孵育 2 小时。
5. 使用读板器测量 562 nm 处的吸光度，并用标准曲线定量蛋白质浓度。从所有其他单个标准品和未知样品重复的吸光度测量值中减去空白标准品吸光度，以获得样品蛋白质浓度。

4. 线粒体制备质量控制（western blot）

1. 将线粒体沉淀重悬于放射免疫沉淀测定缓冲液 （RIPA） 缓冲液中以进行蛋白质定量。使用 micro BCA 测定法测定每个样品的蛋白质浓度。
2. 将样品在 94 ^°C 的样品缓冲液中变性 5 分钟。
3. 将等量 （20 μg） 的线粒体蛋白连同分子量标记一起加载到预制凝胶中（参见 材料表）。
4. 在 100 V 下运行凝胶 50 分钟。
   注：电泳时间可能会有所不同，因此请确保在蛋白质到达样品缓冲液中染料指示的凝胶末端时停止凝胶。
5. 在 western 印迹转移系统中，使用干转印方案将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上，在 20 V 下 7 分钟。
6. 取出膜，在室温下使用封闭溶液（表 1）封闭 1 小时。
7. 在 4 ^oC 下，在封闭缓冲液中将适当稀释的一抗添加到膜中过夜（COXIV= 1：3,000，GAPDH = 1：3,000）。
   注：线粒体制备物中不存在核、内质网 （ER） 污染，可以通过在蛋白质印迹中使用其他标记物（如核纤层蛋白标记物）和 ERp57（ER 标记物）来检测。
8. 用洗涤缓冲液洗涤膜 3 x 15 分钟（表 1）。
9. 在封闭缓冲液中，将膜与适当稀释的 HRP 偶联二抗在封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时
10. 用洗涤缓冲液洗涤膜 3 x 15 分钟。
11. 对于显影，请使用化学发光底物试剂盒。
12. 使用凝胶和膜成像仪扫描膜。

5. 线粒体蛋白分离用于从小胶质细胞中提取 N-糖

1. 将分离的线粒体重悬于 50 μL 蛋白质分离缓冲液（表 1）中，并在冰上放置 20 分钟。
2. 吸出并分配 3 次，然后在冰上放置 20 分钟（使用前涡旋）。如果线粒体沉淀未完全溶解，则再加入 50 μL 分离缓冲液并合并到同一管中。
3. 以 13,000 × g 离心 10 分钟。
4. 回收上清液，在 -80 ^oC 下冷冻至少 1 小时，并在真空浓缩器中尽可能多地干燥。
5. 在使用 IR-MALDESI 的 PNGase 消化缓冲液（表 1）进行游离寡糖分离之前重悬。

6. 用于 IR-MALDESI 的线粒体 N -糖制备

1. 将 25-250 μg 分离的线粒体蛋白的蛋白质（最大体积为 250 μL）加载到 10 kDa 截留分子量 （MWCO） 过滤器上。
2. 向过滤器中的每个样品中添加 2 μL 1 M 二硫苏糖醇 （DTT），减少蛋白质样品以暴露聚糖部分。
3. 用 200 μL PNGase 消化缓冲液稀释样品并轻轻涡旋以避免干扰过滤器。
4. 通过将样品在 56 °C 下孵育 30 分钟来使线粒体蛋白变性。
5. 使用 50 μL 1 M 碘乙酰胺对线粒体进行烷基化，得到 ~200 mM 的最终浓度，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
6. 为了进一步浓缩变性线粒体方法，将样品以 14,000 × g 离心 40 分钟。丢弃流通件。
7. 用 100 μL PNGase 消化缓冲液洗涤样品。
8. 将糖蛋白以 14,000 × g 的浓度浓缩在过滤器上 20 分钟，然后弃去流出物。重复洗涤和浓缩步骤 2 次，总共 3 倍，在过滤器死体积 （~5 μL） 中产生浓缩物。丢弃所有流出物。
9. 洗涤完成后丢弃收集瓶。对于所有将来的洗脱液和清洗液，请使用新的收集瓶。
10. 要从变性线粒体糖型中切割聚糖，转移至新的收集瓶中，并向过滤器中加入 2 μL 不含甘油的 PNGase（75,000 单位/mL）。加入 98 μL PNGase 消化缓冲液，使总体积达到 100 μL，并在过滤器上轻轻上下吹打混合。
11. 将样品在 37 °C 下孵育 18 小时，以酶促切割线粒体蛋白中的所有 N-糖。
12. 通过在 20 °C 下以 14,000 × g 离心样品 20 分钟来洗脱释放的线粒体 N-聚糖。
13. 向过滤器中加入 100 μL PNGase 消化缓冲液洗涤线粒体聚糖，并在 20 °C 下以 14,000 × g 离心 20 分钟。 将含有任何剩余 N-糖的洗涤液收集在与洗脱液相同的收集瓶中。重复 2 次并从收集瓶中取出过滤器。
14. 将线粒体聚糖样品在 -80 °C 冰箱中孵育直至冷冻（30-60 分钟），并在室温下在真空浓缩器中干燥至完成（400 μL 为 4-6 小时）。
    注： 分析前，N-糖可在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
15. 在 IR-MALDESI 分析之前，将干燥的 N-连接糖直接重悬于 50 μL LC/MS 级水中。

7. 通过 IR-MALDESI 质谱法检测释放的游离寡糖

1. 实验的每一天都进行质量校准。将校准溶液加载到注射泵上，并以 1.2 μL/min 的速率推入。施加 3.5 kV 的电压，以获得稳定的电喷雾羽流，以便在正负模式下进行质量校准。
2. 将 5 μL 重悬的线粒体聚糖移液到 Teflon 微孔载玻片上的样品点上。
3. 使用波长为 2.97 μm 的中红外激光器进行烧蚀，每次脉冲的能量为 1.8 mJ。
4. 在负电离模式下电离并检测 N-糖。使用由 60% 乙腈和 1 mM 乙酸组成的电喷雾溶剂，在 3.2 kV 电压下产生流速为 2 μL/min 的稳定电喷雾羽流。
5. 为了进行分析，将 IR-MALDESI 与设置为 240,000_FWHM 质量分辨能力（m /z 200）的 HRAM 质谱仪耦合，在负电离模式下分析 500 至 2,000 m/z 。
6. 关闭自动增益控制 （AGC） 并设置 90 ms 的固定进样时间。使用 EasyIC 离子源对每个谱图进行实时内部校准，以实现高质量测量精度 （MMA）。

8. 线粒体 N- 糖数据分析

1. 通过搜索单同位素质量数并使用 m/z 间距确认同位素分布来手动鉴定 N-连接聚糖，以确定最小离子通量阈值为 1,000 个离子/秒的双电荷和三电荷离子。
2. 将原始质谱从 m/z 比率转换为中性单同位素质量。
3. 将单同位素质量上传到在线寡糖结构预测工具，以确定潜在的聚糖组成。使用实验整理的糖组数据库确认注释²⁰;确保每次鉴定都在 2.5 ppm MMA 的范围内，包含核心 N-连接聚糖结构（十六进制₃HexNAc₂），并不包括戊糖、KDN 或 HexA 单糖。
4. 使用 SNFG 命名法²¹ 绘制已确认的聚糖结构。
5. 从原始质谱获得游离寡糖的相对丰度，并针对线粒体蛋白的量（以 μg 为单位）进行归一化，以获得 ions/s/μg。
6. 使用卡方分析来检验 N-连接聚糖的理论分布和实验分布之间的拟合优度，以确定氯加合物的数量。这允许直接测定唾液酸的数量¹⁹.

图 1 显示了从 BV2 小胶质细胞系中分离线粒体以进行质谱聚糖分析所涉及的步骤的示意图。 图 2 表示了来自小胶质细胞相同起始密度的不同线粒体制剂之间线粒体蛋白分离的可重复性，这表明使用微 BCA 测定法估计的线粒体蛋白浓度之间没有显着差异。

图 3 表示使用 COX IV 和 GAPDH 的蛋白质印迹分析进行线粒体分离的纯度。在这里，我们看到线粒体蛋白 COX IV 在方案中使用的基于试剂的分离的最后一步中分离的线粒体部分的表达。免疫印迹在分离的线粒体部分显示突出的 COX IV 条带，而仅在相同暴露的细胞质部分检测到 GAPDH。较长的曝光时间会导致检测到微弱的 GAPDH 条带。分离线粒体后，非线粒体标志物 GAPDH 的表达在全细胞裂解物中很明显，没有 CoxIV 条带，表明线粒体部分完全分离，非线粒体污染最小。线粒体组分中的 COX IV 表达在不同制剂之间是一致的，起始细胞密度相似，为 2 × 10⁷ 个细胞。

图 4 中使用 IR-MALDESI 检测的释放 N-糖的代表性质谱显示，使用 PNGase 处理后，线粒体蛋白提取物中存在几种磷酸化、硫酸化和唾液酸化带电 N-糖。表 2 报告了在整个谱图中鉴定出但在 GlyConnect 中未报告的所有游离寡糖组成。测试拟合优度的卡方值证实了对具有 1 和 2 氯加合物的 N-糖的检测，证实了在图 5 中使用 IR-MALDESI 检测这些糖基组成。

图 1：协议大纲。 使用 IR-MALDESI HRAM 质谱法对 BV2 小胶质细胞系进行线粒体分离、质量控制、蛋白质提取、 N-糖释放和估计线粒体 N-糖高通量检测的示意图。简称：IR-MALDESI HRAM = 红外矩阵辅助激光脱附电喷雾电离高分辨率精确质量分析仪。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：从 BV2 细胞中分离线粒体蛋白。 （A） 使用不同浓度 BSA 进行微量 BCA 测定的标准曲线。（B） 线粒体蛋白分离的可重复性，以 6 个独立线粒体制剂中 2 × 10⁷ 个细胞的一致蛋白质含量为代表。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：线粒体制备的纯度。 细胞质组分以及来自 BV2 小胶质细胞的分离线粒体的代表性蛋白质印迹。该图表示使用 COX IV 抗体（线粒体标志物）和 GAPDH 抗体（细胞质对照）对细胞质组分和分离的线粒体进行免疫印迹。分离的线粒体中不存在 GAPDH 条带，表明线粒体制备物的交叉污染最小，并且用于后续 N-糖分析的线粒体制备纯度极小。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：使用 IR-MALDESI HRAM 质谱法测定线粒体 N-糖的组成。 1,700-2,000 m/z 范围内的游离寡糖质谱显示大量多电荷峰，并使用 Glycomod 确定注释结构。简称：IR-MALDESI HRAM = 红外矩阵辅助激光脱附电喷雾电离高分辨率精确质量分析仪。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：检出的线粒体 N-糖的验证。 四种 （A-D） 线粒体 N-连接聚糖的代表性同位素分布显示了观察到的分布与氯和去质子化加合物的理论分布的叠加。叠加谱图上的卡方值表示拟合优度，可确认检测具有 1 和 2 氯加合物的 N-糖。这进一步证实了使用 IR-MALDESI 检测这些游离寡糖组成。缩写：IR-MALDESI = 红外矩阵辅助激光解吸电喷雾电离。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：实验方案中使用的溶液和缓冲液配方。请点击此处下载此表格。

表 2：在线粒体中检测到的 M 带电的去质子化 N-连接糖，在 Glycomod 中具有很高的质量测量精度。聚糖简写符号：H = 己糖;N = N-乙酰氨基葡萄糖;F = 岩藻糖;S = N-乙酰神经氨酸;Phos = 磷酸盐;硫酸盐 = 硫酸盐改性。请点击此处下载此表格。

小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，聚糖修饰调节小胶质细胞的免疫表型和功能。这些免疫功能需要大量的细胞能量，而细胞能量主要由线粒体提供。值得注意的是，线粒体蛋白还存在聚糖修饰，由于研究亚细胞糖基化的技术挑战，这些修饰仍未得到充分研究。大多数调查线粒体糖基化的研究都依赖于基于凝集素的聚糖模式鉴定²²，尽管这些方法受到凝集素结合特异性差的限制。本研究中提出的技术方法的重要进展是 i） 从小胶质细胞中可重现地分离线粒体 N-糖，以及 ii） 使用 IR-MALDESI HRAM 质谱法检测和鉴定线粒体 N-糖。此处描述的工作流程是检测小胶质细胞中生理水平表达的线粒体糖蛋白释放的 N-聚糖的首次报告。

在本方案中，通过使用基于试剂的分离方法最大限度地提高线粒体分离。这可以与 Dounce 均质化方法结合使用，以提高线粒体产量。与基于试剂的分离相比，使用均质器的一个缺点是作员之间研杵的力和速度会发生变化，这会导致实验变化增加并降低可重复性。先前的研究 ^23,24 表明使用这种方法并且线粒体部分不存在核（核纤层蛋白、组蛋白 H3）和 ER 标志物（钙联接蛋白、Erp57），表明线粒体部分的纯度。该方案的一个潜在限制是需要 2000 万个细胞作为线粒体分离的起始材料。然而，根据先前研究中进行的优化，我们研究中观察到的高线粒体蛋白浓度允许将线粒体分离的初始小胶质细胞数量减少 10 倍^25,26（25-250 μg 蛋白质），而不会丢失任何 N-糖信号。此外，在方案可扩展性有限的情况下，可以混合生物样品以获得更高的细胞数量以进行线粒体分离，以降低来自组织等主要来源的细胞数量，以实现高效的聚糖检测。此外，聚糖释放步骤在本实验步骤中至关重要。N-糖苷酶 F （PNGase F） 通过水解最内层的 N-乙酰葡糖胺 （GlcNAc） 和天冬酰胺残基之间的酰胺键来释放完整和完整的 N-连接糖²⁷。对于 N-糖分析，优化 PNGase F 的活性以实现线粒体蛋白的完全去糖基化至关重要。使用溶剂暴露和过量酶进行蛋白质变性有助于确保高效、完全地切割和释放线粒体蛋白中的 N-糖。18-20 小时的消化时间是完成 PNGase F 反应释放 N-糖的最佳时间²⁶。

该方案的一个潜在限制是该方法中缺乏糖蛋白的线粒体提取物的富集。虽然在分析中可能无法检测到低丰度糖蛋白，但该方法最大限度地减少了凝集素亲和纯化或化学富集引入的误差和偏差。虽然 IR-MALDESI 对鉴定出的游离寡糖的组成进行了高可信度的鉴定，但需要使用锂加合聚糖游离寡糖的串联质谱法进一步研究有关游离寡糖残基之间键合的精确信息，以增强交叉环切割²⁸ 或外切糖苷酶消化。或者，LC-MS/MS可以作为IR-MALDESI方法的补充或替代方法，后者可以提供更深的游离寡糖覆盖和更多的结构细节。然而，以前的研究表明，IR-MALDESI 对代谢物的平均离子丰度与 LC-MS/^{MS 29} 确定的绝对量之间存在相关性，为使用 IR-MALDESI 直接定量代谢物奠定了基础。IR-MALDESI 的高通量特性能够进行 MS² 分析以提供高可信度的结构确认，有助于快速筛选临床前和临床样品中潜在的聚糖生物标志物和疾病诊断。此外，应该注意的是，尽管核后上清液以 3000 × g 而不是 12,000 × g 离心可最大限度地减少过氧化物酶体和溶酶体污染物，但线粒体制备中可能仍存在这些蛋白质的痕迹。

总之，本研究提出了一种简单的高通量方法，只需最少的样品制备即可分析小胶质细胞中的线粒体糖组，并且在鉴定基于聚糖的新型神经退行性疾病治疗靶点方面具有很大的应用潜力。该方案对从小胶质细胞中分离线粒体的分析方法以及线粒体糖组的后续分析进行了全面评估和标准化，以便能够扩大规模以进行大规模临床前和临床研究。该方案为 N-糖分离和检测提供了几个优点：i） 基于试剂的方案的线粒体分离时间短（≤40 分钟）;ii） 用于聚糖释放的蛋白质产量高;iii） 为 N-糖分析制备的相同线粒体样品可用于其他分子生物学研究，例如蛋白质组学分析、凝集素分析和线粒体流分析;iv） IR-MALDESI HRAM 质谱法采用杂化和软电离策略²⁸，无需对带电糖（如唾液聚糖和磺基聚糖）进行化学衍生化，即可快速、改进 N-糖的检测³⁰。

作者没有需要声明的利益冲突。

作者要感谢 NCSU Muddiman 实验室的研究生 Seth Eisenberg 在质谱方案的视频录制方面提供的帮助。这项研究得到了阿拉巴马大学伯明翰分校工程创新学院研究员计划的部分支持，AG068309 DJT 和 R01GM087964-12 到 D.C.M.。这份手稿中的示意图是使用 BioRender 绘制的。