Um modelo de camundongo modificado de aneurisma intracraniano baseado em alteração hemodinâmica e hipertensão

O aneurisma intracraniano (AI) foi construído em camundongos usando os fatores de risco de hipertensão e alterações hemodinâmicas. As alterações hemodinâmicas foram induzidas pela ligadura dos ramos da artéria carótida, enquanto a hipertensão foi alcançada pela ligadura dos ramos posteriores da artéria renal. A formação de IA foi detectada por meio de angiografia por ressonância magnética, estereomicroscopia e análise anatomopatológica.

O aneurisma intracraniano (AI) representa um risco significativo à saúde devido à morbidade e mortalidade associadas à ruptura do aneurisma. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da IA permanecem obscuros e é necessário um modelo de camundongo adequado. Um modelo de IA em camundongos foi estabelecido pela ligação da artéria pterigopalatina (APP) para induzir alterações hemodinâmicas aditivas, combinadas com indução de hipertensão. Em camundongos machos C57BL/6, os vasos, incluindo o PPA direito, a artéria carótida externa (ECA), a artéria occipital (OcA) e a artéria carótida comum contralateral esquerda (CCA), foram ligados para induzir alterações hemodinâmicas. Uma semana depois, os ramos posteriores bilaterais da artéria renal (pRA) foram ligados e uma dieta com 8% de sal foi introduzida para induzir hipertensão. Angiografia por ressonância magnética (ARM), estereomicroscopia e coloração imuno-histoquímica (IHQ) foram realizadas para avaliar as alterações morfológicas e patológicas na IA três meses após a indução. No grupo experimental, quatro camundongos morreram após a indução inicial. IA em diferentes locais foi detectado em cinco dos onze camundongos restantes. Os exames microscópicos e de ressonância magnética confirmaram a formação de IA. As análises patológicas e de IHQ revelaram ruptura da lâmina elástica interna, desconexão das fibras colágenas e infiltração de macrófagos M1 CD86-positivos, achados consistentes com os observados na IA humana. Este modelo de camundongo de IA replica as alterações patológicas observadas em amostras humanas e pode servir como uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos moleculares de formação e progressão de IA.

A prevalência de aneurisma intracraniano (AI) é estimada em 3,2% da população geral¹. A IA representa um risco significativo para a saúde devido à sua alta morbidade e mortalidade associadas. A AI é uma condição patológica complexa e multidimensional influenciada por alterações hemodinâmicas, inflamação e remodelamento vascular ^2,3. Alterações hemodinâmicas e hipertensão estão implicadas na formação e progressão dos aneurismas ^4,5. A IA ocorre frequentemente em bifurcações cerebrais com tensão de cisalhamento hemodinâmica elevada⁶, e bifurcações com ângulos estreitos são identificadas como fatores de risco para o desenvolvimento de IA em humanos⁷. Apesar dos avanços nos tratamentos endovasculares e nas estratégias cirúrgicas, a hemorragia subaracnóidea causada pela ruptura da IA permanece catastrófica. Portanto, explorar tratamentos farmacológicos é uma abordagem promissora para prevenir a ruptura do aneurisma⁸. No entanto, os mecanismos subjacentes à formação patológica e progressão da IA permanecem obscuros. O desenvolvimento de um modelo de camundongo adequado para a formação e progressão de IA, com base em fatores de risco humanos, é crucial para descobrir os mecanismos subjacentes e identificar potenciais alvos terapêuticos. Este estudo tem como objetivo construir um modelo de formação de IA sem ruptura em camundongos que mimetizam as características humanas de IA.

O círculo de Willis (CW) conecta e comunica a artéria carótida interna direita (ACI), a ACI esquerda e as artérias vertebrobasilares bilaterais. A CW serve como mecanismo compensatório em casos de oclusão ou estenose da ACI ou da artéria vertebral⁹. A artéria pterigopalatina (APP) é um ramo da ACI que fornece sangue para a parte externa do cérebro¹⁰. Com base na função compensatória do CW, a oclusão do PPA aumenta o fluxo sanguíneo na ACI. A combinação da ligadura da artéria carótida comum esquerda (ACC), artéria carótida externa direita (ECA) e artéria occipital (OcA) resulta em aumento do fluxo sanguíneo no CW, particularmente em ângulos estreitos, levando a alterações hemodinâmicas. Nesse modelo, o suprimento de sangue para o cérebro é suportado pela artéria vertebrobasilar e pela ACI direita. A ligadura do PPA não contribuiu para a mortalidade nos camundongos¹¹.

Para induzir um modelo IA baseado na injeção de elastase, a hipertensão foi induzida pela liberação de angiotensina II (Ang-II) por meio de uma bomba de Alzet ou sal de acetato de desoxicorticosterona (DOCA)^12,13. O elevado custo do Alzet e do DOCA deve ser tido em conta em experiências que envolvam um grande número de animais. Os níveis de hipertensão alcançados não foram significativamente diferentes entre a ligadura dos ramos posterior e inferior das artérias renais bilaterais ou apenas os ramos posteriores das artérias renais bilaterais. No entanto, a primeira abordagem resultou em maior disfunção renal¹⁴. Portanto, a ligadura das artérias renais posteriores bilaterais (pRA) é considerada um método racional para a maioria dos investigadores.

A elastase foi injetada no líquido cefalorraquidiano na cisterna basal direita por meio de uma única injeção estereotáxica¹². O modelo IA baseado em injeção de elastase causou ruptura de 60% a 80% de IA três semanas após a injeção^15,16, o que é muito curto para estudar a formação e o desenvolvimento de IA. Além disso, não há evidências que sugiram níveis elevados de elastase em humanos durante a formação de IA. Além disso, a injeção estereotáxica na cisterna direita está associada a alta mortalidade e incapacidade em camundongos, apresentando desafios significativos para iniciantes.

Neste estudo, um modelo de camundongo de IA sem ruptura em três meses foi construído com base em fatores de risco humanos. Este modelo elimina o alto custo associado ao DOCA e ao Alzet. Além disso, pode ser realizado usando apenas um estereomicroscópio e pode ser facilmente dominado por novatos.

Todos os procedimentos operacionais em camundongos aderiram aos critérios do Comitê de Revisão Ética e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Jiaotong de Xangai. Camundongos machos C57BL/6 (8 semanas de idade, 20-25 g) foram alojados a uma temperatura de 22 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. O processo operacional é mostrado na Figura 1A. Resumidamente, nos animais anestesiados, a artéria carótida comum esquerda (ACC), a artéria carótida externa direita (ACE), a artéria occipital (OcA) e a artéria pterigopalatina (APP) foram ligadas para induzir alterações hemodinâmicas. A hipertensão foi posteriormente induzida pela ligadura das artérias renais bilaterais (bRA) uma semana após o início das alterações hemodinâmicas, e os animais foram alimentados com uma dieta contendo 8% de sal. As alterações hemodinâmicas e a formação de IA estão representadas na Figura 1B. Detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento de AIU em camundongos com base em alterações hemodinâmicas e hipertensão

NOTA: Os camundongos foram mantidos em jejum por 12 h antes da operação. Os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados embebendo-os em álcool 70% por pelo menos 30 min.

1. Administre anestesia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) usando uma máquina de anestesia para pequenos animais com inalação de isoflurano a 2% em uma mistura de O₂ (1 L / min) em uma almofada aquecida mantida a 37 ° C.
2. Ligue o CCA esquerdo
   1. Faça uma incisão linear de 1 cm ao longo da linha média cervical. Dissecar o tecido subcutâneo e o platisma para expor a traqueia.
   2. Puxe a veia jugular e localize a bainha carotídea ao longo da traqueia (Figura 2A i,ii). Separe a ACC esquerda do nervo vago. Ligue a ACC esquerda com uma sutura de seda 6-0 (Figura 2A iii,iv).
3. Ligue o ECA e o OcA corretos
   1. Exponha a estrutura anatômica do CCA, ICA, ECA, OcA, nervo vago e nervo hipoglosso no lado direito. Ligue a ECA direita com uma sutura de seda 6-0 (Figura 2A iii,iv).
   2. Isole o OcA e ligue-o com um 8-0 sutura de seda (Figura 2A v - viii). Desconecte o OcA usando duas micropinças retas.
      NOTA: A OCA, originando-se proximalmente da ECA, encontra-se abaixo do nervo hipoglosso (Figura 2A v - viii). A dissecação do OcA ajuda a expor a anatomia do PPA de forma eficaz.
4. Ligue o PPA certo
   1. Isole o nervo hipoglosso da ACI. Coloque o algodão cirúrgico entre o nervo hipoglosso e a ACI para proteger o nervo de lesões relacionadas ao procedimento.
   2. Dissecar o tecido perivascular ao redor do PPA usando micropinças. Clamp o PPA e puxe-o temporariamente para cima levemente. Coloque um 8-0 sutura de seda entre o PPA e a ACI para ligar o PPA (Figura 2A ix,x).
   3. Ligue o PPA e mantenha distância suficiente entre o local da ligadura e a origem do PPA para garantir o fluxo sanguíneo no círculo de Willis (Figura 2A x).
      NOTA: O principal desafio nesta etapa é ligar o PPA dentro de um espaço operacional extremamente apertado sem prejudicar os nervos periféricos e as estruturas vasculares. Evite comprimir a traqueia durante a exposição ao PPA.
5. Finalize a operação
   1. Esterilize o campo operacional com iodopovidona e suture a ferida. Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia.
6. Induzir hipertensão
   1. Faça uma incisão na linha média de 2 cm de comprimento no nível da^12ª vértebra nas costas. Corte os músculos dorsais para expor o rim. Clampeie o tecido adiposo ao redor do rim usando uma pinça e fixe o rim dentro da incisão muscular (Figura 2B i,ii).
   2. Isole o tecido adiposo ao redor do pedículo renal. Identifique o pRA em contato próximo com a veia renal (Figura 2B iii,iv). Prenda o pRA e puxe-o para cima usando uma micropinça reta. Dissecar a fáscia entre a APR e a veia renal com outra micropinça (Figura 2B v,vi).
      NOTA: Tenha cuidado para evitar danos à veia renal, que podem levar a um sangramento catastrófico.
   3. Ligue o pRA com uma sutura de seda 6-0 (Figura 2B vii, viii). Imediatamente após a ligadura, observe a formação de focos isquêmicos na parte superior do rim (Figura 2B ix,x). Suturar as incisões musculares e cutâneas.

2. Exame IA via ARM e estereomicroscópio

1. Realize a angiografia por ressonância magnética (ARM) de 7,0 T por tempo de voo (TOF) três meses após a indução do aneurisma para avaliar a formação de IA.
   1. Eutanásia dos camundongos por meio de exsanguinação e luxação cervical após anestesia com isoflurano (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Detecte IA sob um estereomicroscópio conforme relatado anteriormente¹⁷.
   2. Infundir as amostras com PBS resfriado, seguido de paraformaldeído a 4% e, em seguida, Microfil para visualizar vasos e aneurismas.
   3. Definir um aneurisma como um abaulamento externo 1,5 vezes maior que a artéria-mãe, conforme observado por dois neurocirurgiões independentes ^8,18.

3. Análises histológicas e imuno-histoquímicas

1. Isole os círculos de Willis sob um microscópio. Fixar os provetes com paraformaldeído a 4% a 4 °C durante 24 h¹⁹.
2. Processe as amostras em parafina e cortes congelados para coloração histológica e de imunofluorescência. Manchar as seções de parafina com as colorações EVG e Masson de acordo com as instruções do fabricante¹⁹.
3. Incube as seções de parafina com uma solução de bloqueio para minimizar a ligação inespecífica.
4. Incubar seções com anticorpos primários contra CD86 durante a noite a 4 °C. Após a incubação com um anticorpo secundário, desenvolva uma cor marrom reagindo as seções com DAB²⁰.
5. Realize a contracoloração com hematoxilina e monte as seções com uma solução de montagem aquosa²⁰.

Taxa de formação de IA
No grupo experimental (n = 15), 2 camundongos morreram na primeira semana após o procedimento inicial por razões desconhecidas. Um camundongo morreu de uma infecção na ferida nas costas no terceiro dia após o segundo procedimento, e outro camundongo morreu no dia 38 por razões desconhecidas, sem aneurismas detectados. No grupo controle (n = 5), todos os 5 camundongos sobreviveram até o sacrifício. Entre os camundongos sobreviventes do grupo experimental (n = 11), a pressão arterial sistólica três meses após a indução foi significativamente maior do que antes da indução (90 ± 1,39 mm Hg vs. 126,63 ± 1,83 mm Hg; P < 0,0001). No grupo controle (n = 5), a pressão arterial permaneceu consistente antes da indução e no sacrifício (88 ± 2,34 mmHg vs. 91,8 ± 1,2 mmHg; P > 0,05).

Avaliação e resultados da avaliação de impacto
No grupo experimental, aneurismas em diferentes locais foram detectados em 5 dos 11 camundongos sobreviventes usando MRA e microscopia de luz. Dois aneurismas localizavam-se nas bifurcações artéria cerebral anterior-artéria olfatória, dois na artéria comunicante anterior e um na artéria cerebral posterior (Figura 3). Além disso, 2 dos 11 camundongos exibiram tortuosidade na artéria cerebral anterior e na artéria cerebral média. Nenhum dos aneurismas se rompeu dentro de três meses após a indução. Nenhuma alteração aneurismática foi observada em 4 dos 11 camundongos do grupo experimental ou em qualquer um dos 5 camundongos do grupo controle.

Exame histológico e de imunofluorescência
Nos aneurismas cerebrais humanos, a parede vascular é caracterizada por ruptura da lâmina elástica, descelularização da média, desconexão das fibras colágenas e infiltração de macrófagos M1²¹. Em comparação com os vasos sanguíneos de controle, a coloração EVG-Verhoeff revelou ruptura significativa da camada elástica interna no tecido IA (Figura 4A). A coloração de Masson mostrou considerável desconexão das fibras colágenas nas paredes IA (Figura 4B). A análise imuno-histoquímica indicou infiltração significativa de macrófagos CD86 positivos na parede do aneurisma (Figura 4C,D).

Figura 1: Diagrama da indução do modelo de aneurisma de camundongo. (A) Representação esquemática da ligadura da artéria carótida comum esquerda, da artéria carótida externa direita, da artéria pterigopalatina e dos ramos posteriores bilaterais da artéria renal, juntamente com uma dieta de NaCl a 8%. (B) Alterações hemodinâmicas levando a alterações de fluxo no círculo de Willis e formação de aneurisma. Abreviaturas: ACA, artéria cerebral anterior; ACoA, artéria comunicante anterior; CCA, artéria carótida comum; ECA, artéria carótida externa; AI, aneurisma intracraniano; ACM, artéria cerebral média; ARM, angiografia por ressonância magnética; OA, artéria olfatória; OcA, artéria occipital; APP, artéria pterigopalatina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagramas anatômicos e esquemáticos da ligadura arterial. (A) Exposição e ligadura das artérias do pescoço. i-iv, ligadura da ACC esquerda; v-vi, ligadura do ECA direito; vii-viii, ligadura da OcA direita; ix-x, ligadura do PPA direito. (B) Exposição e ligadura dos ramos posteriores da artéria renal (pRA). i-iv, exposição da ara direita; v-vi, separação da ara p; vii-viii, ligadura da arra; IX-X, retorno dos rins à sua posição original. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Alterações morfológicas em aneurismas intracranianos. (A) A bifurcação normal da artéria olfatória e da artéria cerebral anterior no grupo controle. (B) Alterações aneurismáticas típicas na bifurcação da artéria olfatória e da artéria cerebral anterior observadas na ARM e ao microscópio (seta vermelha). Ampliação: 6x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise anatomopatológica dos aneurismas intracranianos. (A) Coloração EVG: A camada elástica no grupo normal está intacta e lisa, enquanto a camada elástica no grupo aneurisma é rompida. (B) Coloração de Masson: As fibras colágenas estão intactas no grupo normal, enquanto um grande número de fibras colágenas é interrompido no grupo aneurisma. (C) Coloração IHQ para CD86: células CD86 positivas estão ausentes no grupo normal, mas estão significativamente presentes na parede do aneurisma. Barras de escala = 200 μm (para imagens não ampliadas); 50 μm (para imagens ampliadas), ***P < 0,001. Abreviatura: IA, aneurisma intracraniano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este estudo apresenta uma abordagem modificada para a construção de um modelo de IA em camundongos por meio da ligadura do PPA para induzir alterações hemodinâmicas aditivas em combinação com hipertensão. A imagem de ressonância magnética e a análise microscópica demonstraram alterações aneurismáticas significativas no círculo de Willis. As alterações patológicas observadas neste modelo são consistentes com as encontradas em amostras humanas. Este modelo de camundongo pode servir como uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à formação e desenvolvimento de IA.

A IA foi induzida em camundongos ligando as artérias renais posteriores esquerdas (pRA), juntamente com uma dieta rica em sal. Cai et al. empregaram um procedimento semelhante para estabelecer um modelo de aneurisma de rato com pressão arterial normal e identificaram aneurismas cerebrais e a expansão das artérias cerebrais anteriores²². Miyamoto et al. relataram que, em comparação com a ligadura apenas do CCA esquerdo, a ligadura adicional do PPA direito e do ECA direito aumentou significativamente a formação de IA em ratos. A ligadura da ECA e da APP pode amplificar as alterações hemodinâmicas, aumentando o volume do fluxo sanguíneo¹⁸. Em humanos, a oclusão da artéria carótida tem sido associada à formação de aneurismas intracranianos²³. Portanto, este modelo de camundongo modificado de IA pode ser benéfico para explorar a formação e o desenvolvimento de IA.

A escolha de espécies animais em estudos de pesquisa é crucial e serve a propósitos de pesquisa distintos. Os modelos de ratos, que têm sido usados há décadas, exibem características patológicas específicas, como fragmentação da lâmina elástica interna e afinamento da camada de células musculares lisas. Modelos de ratos são empregados principalmente para investigar a patogênese dos aneurismas^24,25. Os modelos de coelhos, por outro lado, são particularmente adequados para estudos pré-clínicos relacionados ao tratamento endovascular 26,27,28. Em comparação com esses modelos, os camundongos são preferidos para análises genéticas devido aos seus ciclos de vida mais curtos e manipulabilidade transgênica. Além disso, os camundongos exibem semelhança significativa na expressão e função de genes ortólogos com os de humanos²⁹. Assim, os modelos de camundongos representam uma escolha ideal para investigações laboratoriais.

Em estudos anteriores, aneurismas intracranianos (AIs) foram induzidos em camundongos usando elastase para degradar a lâmina elástica³⁰. Embora os aneurismas à base de elastase apresentem alterações morfológicas e histológicas semelhantes às observadas em humanos 31,32,33, eles estão associados a uma alta taxa de ruptura, tornando-os vantajosos para o estudo da ruptura IA. No entanto, a fraqueza do vaso induzida pela elastase não representa com precisão o processo natural de formação de IA. O modelo atual, que replica as características patológicas da IA humana, foi desenvolvido com base em dois fatores de risco independentes para a formação de IA e não resultou em ruptura durante o período de observação de três meses.

Existem várias limitações para este estudo. Enquanto o modelo de camundongo foi induzido por alterações hemodinâmicas aditivas e hipertensão, a incidência de aneurismas cerebrais em uma amostra pequena não foi determinada, nem foi comparada com a incidência de aneurismas induzidos apenas por ligadura da artéria carótida comum ou ligadura bilateral das artérias renais posteriores³⁴. A janela de observação foi limitada a três meses, o que simula parcialmente o processo natural de formação do IA, mas não elimina a possibilidade de ruptura. Replicar a hemodinâmica complexa e realista dos humanos continua sendo um desafio. Além disso, as alterações hemodinâmicas causadas pela ligadura adicional do PPA não foram avaliadas e as alterações do fluxo sanguíneo não foram medidas com precisão. No entanto, IAs em camundongos foram detectados usando MRA, e as alterações patológicas observadas foram consistentes com as encontradas em IAs humanos. Este modelo de camundongo de IA é uma ferramenta valiosa para investigar o processo de formação de IA.

O manuscrito foi lido e aprovado por todos os autores nomeados, e não há outras pessoas que satisfaçam os critérios de autoria, mas não estejam listadas. Os autores não têm conflitos de interesse associados ao manuscrito e não houve apoio financeiro significativo para este trabalho que pudesse ter influenciado seu resultado. Os financiadores não estiveram envolvidos na coleta de dados, análise de dados ou redação de artigos. O manuscrito não foi publicado anteriormente online ou impresso, incluindo periódicos, sites ou blogs.

Este estudo foi apoiado pelo National Facility for Translational Medicine (Shanghai TMSK-2021-147), pelo Shanghai Renji Hospital Research Project (RJTJ-QT-007) e pela China Postdoctoral Science Foundation (Número do Certificado: 2024M760658).