Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Este estudo utiliza marcadores de morte celular e apoptose baseados em fluorescência multicoloração combinados com microscopia confocal para avaliar a apoptose induzida por citocinas e a morte específica de β células em ilhotas pancreáticas. Revela mudanças espaciais e temporais na morte celular e apoptose em resposta a estímulos extracelulares.

Este estudo investiga o efeito de citocinas pró-inflamatórias em ilhotas pancreáticas, particularmente células β produtoras de insulina, usando uma combinação de técnicas de coloração de fluorescência e microscopia confocal para avaliar a viabilidade celular, apoptose e morte específica de β células. Ilhotas isoladas de camundongos foram tratadas com concentrações variadas de um coquetel de citocinas, incluindo TNF-α, IL-1β e IFN-γ, para imitar a apoptose imunomediada durante o desenvolvimento de diabetes tipo 1. A viabilidade das células das ilhotas foi avaliada com coloração dupla FDA / PI, onde a conversão da FDA em fluoresceína indicou células viáveis e células comprometidas por membrana marcadas com PI. O YOPRO-1 e a coloração nuclear forneceram dados adicionais sobre a apoptose, com a Anexina-V confirmando as células apoptóticas precoces. A análise quantitativa revelou aumentos significativos nas taxas de apoptose e morte celular em ilhotas tratadas com citocinas. Para avaliar especificamente os efeitos nas células β, a coloração seletiva do indicador Zn²⁺ foi usada para rotular células produtoras de insulina por meio da associação de zinco em grânulos de insulina, revelando perda substancial de células β após o tratamento de ilhotas com citocinas pró-inflamatórias por 24 h. Esses protocolos de coloração múltipla capturam e quantificam efetivamente a extensão do dano induzido por citocinas nas ilhotas e podem ser usados para avaliar terapias projetadas para prevenir a apoptose de β células no diabetes tipo 1 inicial.

As ilhotas pancreáticas, também conhecidas como ilhotas de Langerhans, são uma coleção de células endócrinas localizadas dentro do pâncreas. As células β produtoras de insulina são o componente mais abundante e funcionalmente significativo das ilhotas pancreáticas. Essas células β secretam insulina, um hormônio que desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase da glicose¹. No diabetes tipo 1 (DM1), o sistema imunológico tem como alvo e se infiltra nas ilhotas pancreáticas, destruindo as células β produtoras de insulina. Esse ataque autoimune é mediado principalmente por citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon-gama (IFN-γ)². Essas citocinas iniciam uma cascata de eventos de sinalização dentro das células β que, em última análise, desencadeiam a apoptose³. A apoptose, a morte celular programada, é um processo rigidamente regulado que envolve a ativação de caspases, fragmentação do DNA e desintegração celular. Contribui para a perda gradual da massa e função de β células durante o início do DM1³.

Compreender os mecanismos moleculares que impulsionam a apoptose de β células é fundamental para identificar estratégias para prevenir ou mitigar a destruição de β células no DM1. Para conseguir isso, ilhotas pancreáticas isoladas de modelos experimentais ou cadáveres humanos servem como um sistema modelo robusto e bem estabelecido para estudar a patologia de células ^{β 2,3}. Ao tratar essas ilhotas isoladas com citocinas pró-inflamatórias, os pesquisadores podem replicar o ambiente que caracteriza o DM1 precoce, permitindo o estudo detalhado da disfunção e morte de β células in vitro ^4,5. Esses experimentos fornecem informações importantes sobre a vulnerabilidade e a sobrevivência das células β em condições associadas à doença e também servem como uma plataforma para testar intervenções terapêuticas destinadas a proteger ou resgatar células β da apoptose induzida por citocinas. Ao utilizar este sistema in vitro, podemos efetivamente analisar como ilhotas de diferentes espécies respondem a várias condições, proporcionando uma melhor compreensão das variações funcionais e apoptóticas entre as espécies.

Estudos anteriores mostraram que ilhotas de camundongos e humanos tratadas por 24 h com um coquetel (1x = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL de IL-1β e 100 ng/mL de IFN-γ) de citocinas de camundongos e derivadas de humanos, respectivamente, resultaram em morte significativa de células das ilhotas ^4,5,6. A viabilidade das ilhotas foi confirmada pela coloração das células tratadas com citocinas com diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (PI)^5,6. Globalmente, a viabilidade das ilhotas é avaliada usando a técnica padrão de exclusão de corante de ligação ao ácido desoxirribonucléico (DNA) com FDA e PI⁷. Corantes fluorescentes ou substratos conjugados com corante avaliam a viabilidade celular com base na integridade e permeabilidade da membrana. O FDA, um corante permeável às células, é convertido por células vivas em fluorescência verde (fluoresceína). Em contraste, o PI, um corante impermeável às células, cora apenas os núcleos das células mortas com membranas comprometidas⁷. As células são então analisadas por meio de imagens de duas cores em um microscópio confocal, onde as fluorescentes verdes e vermelhas marcam células viáveis e mortas, respectivamente.

A limitação do protocolo de coloração FDA/PI é que o IP só entra nas células que perderam a seletividade da membrana, o que significa que não pode distinguir células apoptóticas precoces. Além disso, este método não pode diferenciar entre subconjuntos de células, tornando-o inadequado para avaliar seletivamente a viabilidade de β células. O protocolo Anexina V/PI é comumente utilizado para o estudo de células apoptóticas, e o protocolo foi modificado para melhorar sua^acurácia8. Os estágios iniciais da apoptose envolvem a translocação da fosfatidilserina da camada interna para a externa da membrana plasmática. A anexina V, uma proteína dependente de cálcio, liga-se com alta afinidade a essa fosfatidilserina exposta. A coloração com IP é realizada juntamente com a anexina-V para distinguir as células apoptóticas (apenas anexina V-positiva) das células necróticas (positivas para anexina-V e IP), pois as células necróticas também exibem fosfatidilserina devido ao comprometimento da integridade da membrana⁹. Outros corantes, como o YOPRO-1, também são usados para quantificar a apoptose das células das ilhotas. A membrana celular das células viáveis é impermeável ao YOPRO-1, ao contrário da anexina-V, que não pode quantificar células vivas submetidas à apoptose.

Para avaliar a morte de células β pancreáticas, são necessários corantes específicos direcionados apenas às células produtoras de insulina. Uma característica distinta das células β pancreáticas é que uma porção de Zn²⁺ intracelular é armazenada nas vesículas como um complexo Zn²⁺-insulina (proporção de 2:1)¹⁰. O Zn livre²⁺ também existe no espaço extragranular ao redor das células β como reservatórios. Zn²⁺ e Zn²⁺ livres fracamente ligados à insulina em grânulos secretores podem ser visualizados usando corantes de ligação ao zinco. A ditizona, um corante de ligação ao zinco, é comumente usada para avaliar a pureza das ilhotas, mas não pode ser combinada com corantes fluorescentes usados para avaliar a viabilidade e a função das células β¹¹. Sondas UV como TSQ e Zinquin, que são altamente seletivas em relação ao Zn²⁺, foram desenvolvidas para quantificar as células β por imagem e medição de Zn²⁺ intracelular livre^{; 12,13}. No entanto, seu uso é limitado pela baixa solubilidade, carga celular desigual, necessidade de excitação UV e compartimentalização em vesículas ácidas¹⁴. Sondas fluorescentes de comprimento de onda visível, como o indicador seletivo Newport green e Zn²⁺, também foram desenvolvidas para superar essas limitações e agora são amplamente utilizadas para detectar células β em ilhotas humanas isoladas^15,16. O FluoZin-3 (indicador seletivo de Zn²⁺) tem maior afinidade de Zn²⁺ e rendimento quântico superior do que Newport Green e provou ser eficaz para imagens de Zn²⁺ co-liberadas com insulina em ilhotas isoladas^14,17.

O uso de corantes fluorescentes como FDA, PI, Anexina V, YOPRO-1 e indicador seletivo Zn²⁺ permite a medição e diferenciação entre células mortas viáveis, apoptóticas e totais. A combinação de sondas compatíveis e altamente seletivas também oferece um método direcionado para avaliar e quantificar a viabilidade e a apoptose de β células, o que é fundamental para entender e mitigar a destruição de células β na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos para diabetes.

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Denver (Protocolos 000929). Os camundongos C57Bl / 6 usados para este experimento foram comprados do Laboratório Jackson e alojados em uma instalação com temperatura controlada em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso a comida e água ad libitum. As ilhotas isoladas de camundongos foram obtidas usando o protocolo de digestão da colagenase, que foi descrito anteriormente ^5,18.

1. Preparação de soluções e meios de cultura

NOTA: Meios de cultura, estoques de citocinas e outros reagentes devem ser preparados em condições estéreis.

1. Prepare um meio de cultura de ilhotas adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS), 10.000 U / mL de penicilina e 10.000 μg / mL de estreptomicina a 500 mL de meio 1640 RPMI.
2. Prepare 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. Prepare uma solução-mãe 1000x de coquetel de citocinas de camundongo, 10 μg/mL de TNF-α 10μg/mL, 5 μg/mL de IL-1β e 100 μg/mL de IFN-γ em PBS estéril contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e armazene a solução em alíquotas de 10 μL a -20 °C.
3. Prepare uma solução estoque FDA 46 μM (50x) em acetona e armazene-a em alíquotas de 1 mL a -20 ° C. Preparar uma solução de reserva de PI a 1,434 mM (50x) em PBS e armazená-la em alíquotas de 1 ml a 4 °C.
4. Prepare 500 mL de tampão Krebs-Henseleit HEPES modificado com bicarbonato (BMHH) com 125 mM de NaCl, 5,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgCl₂ e 10 mM de HEPES em 500 mL de dH₂O. Ajuste o pH para 7,4.
5. Prepare 100 mL de tampão de ligação Annexin-V com 10 mM HEPES, 140 mM NaCl e 2,5 mM CaCl₂ em 100 mL de dH₂O. Ajuste o pH para 7,4.
6. Preparar a solução de reserva selectiva do indicador^{1mM Zn 2+} em DMSO e conservar em alíquotas de 10 μL a -20 °C.
   NOTA: Os corantes fluorescentes são sensíveis à luz, portanto, o armazenamento e a incubação devem ser no escuro.

2. Tratamento de ilhotas isoladas com citocinas

1. Isolar as ilhotas de camundongos com uma micropipeta de 10 μL no meio de cultura e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂ para se recuperar do estresse de isolamento antes do tratamento com citocinas.
2. Adicione 2 mL do meio de cultura de ilhotas esterilizado a placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos de 35 mm e rotule-as adequadamente para diferenciar placas tratadas com citocinas e não tratadas sem citocinas.
3. Para placas tratadas com citocinas, remova 6 μL de meio de cultura e substitua-o por 2 μL de cada citocina da solução estoque para obter uma concentração relativa final de citocinas de 10 ng / mL, 5 ng / mL IL-1β e 100 ng / mL IFN-γ (1x CCR).
   NOTA: O CCR mais baixo de 0,5x e 0,1x pode ser preparado diluindo as soluções de estoque com PBS estéril contendo 0,1% de BSA a 1:1 e 1:9, respectivamente.
4. Às 12 h-24 h após o isolamento, pegue 10-20 ilhotas usando uma micropipeta sob um microscópio óptico e transfira para os pratos e incube em uma incubadora umidificada a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h.
   NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo dos objetivos experimentais específicos.

3. Medição da viabilidade das ilhotas com FDA/PI

1. Adicione 20 μL de cada uma das soluções estoque FDA e PI a 960 μL do tampão BMHH contendo 0,1% de BSA para obter uma concentração final de 0,46 μM e 14,34 μM dos corantes fluorescentes, respectivamente.
2. Alíquota de 100 μl da solução de coloração para uma placa de Petri de 7 mm, não tratada com cultura de tecidos, com fundo de vidro.
3. Às 24 h após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incube por 5 a 10 min em temperatura ambiente no escuro (cubra com papel alumínio).
4. Tire imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Tire imagens dentro de 15 minutos após a coloração FDA/PI.
5. Use lasers de excitação a 488 nm e 514 nm para detectar as emissões de fluorescência para FDA (520 nm) e PI (620 nm), respectivamente.
6. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
7. Conte células verdes vivas (positivas para FDA) e vermelhas mortas (positivas para PI) manualmente no ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de morte celular da seguinte forma:
   Porcentagem de morte de ilhotas = número de células mortas/ (número de células mortas + número de células vivas) x 100%

4. Medição da apoptose por coloração

1. Adicione 8 μL de YOPRO-1 (solução de 1mM) a 992 μL de tampão de imagem BMHH para uma concentração final de 0,8 μM.
2. Alíquota de 500 μl da solução de coloração para uma placa de Petri de 14 mm, não tratada com cultura de tecidos, com fundo de vidro.
3. Às 24 h após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro e incubar durante 1 h a 37 °C no escuro (cobrir com papel alumínio).
4. Após 20 minutos de incubação, adicione uma gota de NucBlue (corante nuclear, 20 μL) a cada placa de Petri com fundo de vidro e continue a incubação. O tempo total de incubação é de 1 h para YOPRO-1 e 40 min para coloração nuclear.
5. Após 1 h de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco contendo 0,1% de BSA (100 μL) em uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos com fundo de vidro de 7 mm.
6. Tire imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação a 405 nm e 488 nm para detectar as emissões de fluorescência da coloração nuclear (460 nm) e YOPRO-1 (509 nm), respectivamente.
7. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
8. Conte células vivas azuis (positivas para coloração nuclear) e verdes apoptóticas (positivas para YOPRO-1) manualmente em ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de células das ilhotas apoptóticas da seguinte forma:
   porcentagem de células das ilhotas apoptóticas = número de células apoptóticas / (número de células apoptóticas + número de células vivas) x 100%

5. Medição da apoptose com anexina V / coloração nuclear

1. Adicione 2 gotas de corante nuclear (40 μL) a 1 mL de tampão de ligação de anexina. Alíquota de 100 μl da solução para uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos com fundo de vidro de 7 mm.
2. Às 24 h após a incubação com citocinas, enxágue cuidadosamente pipetando para cima e para baixo 3x pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento em PBS, pipetando para cima e para baixo três vezes usando a micropipeta de 10 μl. Transferir os ilhéus para a placa de Petri com fundo de vidro com a solução de corante nuclear e incubá-los durante 40 min a 37 °C no escuro (cobrir com papel alumínio).
3. Após 25 min de incubação, adicione 5 μL de Anexina V Alexa Flour 488 conjugado a cada placa de Petri com fundo de vidro e continue a incubação. O tempo total de incubação é de 40 min para a coloração nuclear e 15 min para a Anexina V.
4. Após 40 min de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco (sem anexina V ou coloração nuclear) em uma placa de Petri com fundo de vidro de 7 mm.
5. Tire imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação a 405 nm e 488 nm para detectar as emissões de fluorescência da coloração nuclear (460 nm) e do conjugado de Anexina V (515 nm), respectivamente.
6. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
7. Conte células vivas azuis (positivas para coloração nuclear) e verdes apoptóticas (positivas para anexina V) manualmente em ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de células das ilhotas apoptóticas da seguinte forma:
   porcentagem de células apoptóticas = número de células apoptóticas / (número de células apoptóticas + número de células vivas) x 100%

6. Medição da morte de células β usando indicador seletivo de Zn²⁺ / coloração nuclear / PI

1. Adicionar 2 μL de solução estoque seletiva de Zn²⁺ indicator AM a 998 μL de tampão de imagem BMHH para fazer uma concentração final de 0,2 μM. Alíquota de 500 μL da solução de coloração em uma placa de Petri de 14 mm com fundo de vidro não tratada com cultura de tecidos.
2. Às 24 h após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incubar durante 1 h a 37 °C no escuro com a solução AM de indicador selectivo de Zn²⁺ (cobrir com folha de alumínio).
3. Após 20 minutos de incubação, adicione uma gota de corante nuclear (20 μl) a cada placa de Petri com fundo de vidro, de acordo com as instruções do fabricante e continue a incubação. O tempo total de incubação é de 1 h para o indicador seletivo de Zn²⁺ e 40 min para a coloração nuclear.
4. Após 1 h de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco contendo 0,1% de BSA (100 μL) em uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos com fundo de vidro de 7 mm. Adicione 2 μL de solução estoque de PI por 10 min para fazer uma concentração final de 20 μg/mL.
5. Tire imagens dentro de 15 minutos após a coloração PI usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação a 405 nm, 488 nm e 514 nm para detectar as emissões de fluorescência da coloração nuclear (460 nm), indicador seletivo de Zn²⁺ (516 nm) e PI (620 nm), respectivamente.
6. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
7. Conte células vivas azuis (positivas para coloração nuclear), verde zinco (indicador seletivo positivo de Zn²⁺ ) e vermelho morto (PI-positivo) manualmente em ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de morte de β células da seguinte forma:
   porcentagem de morte de β células = número de células positivas para zinco e positivas para IP / (número de células mortas + ilhotas vivas) x 100%
   ou
   porcentagem de morte de β células = número de células positivas para zinco e positivas para PI / (número de células positivas para zinco) x 100%

A coloração dupla com FDA e PI foi utilizada para avaliar a viabilidade de ilhotas tratadas com citocinas. Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata (n = 3), e os dados foram gerados a partir de várias imagens z-stack de 10 μm de distância, com cada réplica contendo dados médios de 5 ou 6 ilhotas, para garantir a reprodutibilidade e comparação estatística entre as ilhotas tratadas e não tratadas. A Figura 1A mostra ilhotas saudáveis do grupo de controle não tratado exibindo fluorescência verde distinta devido à conversão de FDA em fluoresceína por células enzimaticamente ativas. A ausência ou presença mínima de fluorescência vermelha confirma a viabilidade dessas ilhotas, indicando membranas celulares intactas. Em contraste, a Figura 1B demonstra fluorescência vermelha significativa em ilhotas tratadas com citocinas, marcando células mortas ou moribundas com integridade de membrana comprometida. Esse aumento na fluorescência vermelha destaca a coloração PI de núcleos em células não viáveis com ruptura da membrana. O impacto da concentração de citocinas na viabilidade das ilhotas é mostrado na Figura 1C. Os dados quantitativos revelam uma correlação positiva entre a taxa de mortalidade das ilhotas e o aumento das concentrações de citocinas (0,1x-1x CCR). Essa resposta dose-dependente ressalta os efeitos citotóxicos das citocinas nas células das ilhotas, como evidenciado pelo aumento da fluorescência vermelha em células coradas com PI com maior exposição a citocinas.

Para medir a apoptose induzida por citocinas, as células das ilhotas não tratadas e tratadas com citocinas foram coradas com YOPRO-1 e coloração nuclear para quantificar as células apoptóticas e viáveis. A Figura 2A mostra uma imagem representativa de uma célula não apoptótica da placa de controle não tratada, onde forte fluorescência azul é observada no núcleo, sem fluorescência verde, indicando uma célula viável e não apoptótica. A Figura 2B apresenta ilhotas tratadas com citocinas com fluorescência verde distinta do YOPRO-1 ao lado de coloração nuclear azul. Essa fluorescência dupla confirma a apoptose, pois o YOPRO-1 permeia as membranas celulares estressadas. A quantificação revelou que mais de 30% das ilhotas pancreáticas apresentaram apoptose dentro de 24 h após a exposição às citocinas (Figura 2C). A coloração com anexina-V foi realizada para validar ainda mais a apoptose, mostrando que aproximadamente 40% das ilhotas coraram positivamente para a anexina-V, capturando tanto as células apoptóticas precoces quanto as que progridem por apoptose (Figura 2D-F).

Finalmente, para avaliar a taxa de mortalidade de células β pancreáticas em resposta às citocinas, coramos as ilhotas não tratadas e tratadas com citocinas com indicador seletivo de Zn²⁺ , coloração nuclear e PI (Figura 3A, B). Nossos resultados mostraram um discreto padrão de coloração pontilhada com o indicador seletivo Zn²⁺ , indicando que o indicador seletivo Zn²⁺ está ligado ao zinco livre e fracamente ligado associado à insulina em grânulos secretores. Além disso, a coloração tripla com esses corantes permite a combinação de canais de fluorescência distintos (azul para coloração nuclear, vermelho para PI e verde para indicador seletivo de Zn²⁺ ), permitindo uma visualização precisa e multiplexada sob um microscópio de fluorescência, facilitando a distinção não apenas de células vivas de mortas, mas também da morte específica das células β produtoras de insulina. Ele também fornece dados para a quantificação descritiva da morte de β células como uma fração do número total de células β, células mortas ou células de ilhotas. A Figura 3C mostra que as citocinas causam mais destruição das células β, destruindo cerca de 63% das células produtoras de insulina dentro de 24 h de co-cultura com ilhotas saudáveis.

Figura 1: Coloração dupla de ilhotas com diacetato de fluoresceína (verde) e iodeto de propídio (vermelho) para avaliar a morte mediada por citocinas. (A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de ilhotas de camundongos não tratadas e (B) ilhotas tratadas com citocinas coradas com diacetato de fluoresceína (verde) e iodeto de propídio (vermelho). (C) Viabilidade percentual de ilhotas de camundongos tratadas com concentrações relativas de citocinas variáveis (0,1x quadrados vermelhos, 0,5x triângulos verdes e 1x triângulos azuis RCC) e ilhotas não tratadas (círculos pretos). 1x CCR = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL de IL-1β e 100 ng/mL de IFN-γ. Barra de escala = 10 μm. Cada ponto de dados é uma ilhota. Os dados são apresentados como uma média ± EPM. *p < 0,05 e ***p < 0,001 indicam significância estatística com base na ANOVA com análise post-hoc de Tukey (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Coloração de ilhotas com YOPRO-1 e Anexina-V como marcadores de apoptose induzida por citocinas. (A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de ilhotas de camundongos não tratadas e (B) ilhotas tratadas com citocinas coradas com coloração nuclear (azul) e YOPRO-1 (verde). Barra de escala = 10 μm. (C) Porcentagem de células positivas para YOPRO-1 em ilhotas tratadas com citocinas (triângulos azuis 1x CCR) e ilhotas não tratadas (círculos pretos). (D) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de ilhotas de camundongos não tratadas e (E) ilhotas tratadas com citocinas coradas com coloração nuclear (azul) e Anexina V (verde). (F) Porcentagem de células positivas para Anexina-V em ilhotas tratadas com citocinas (triângulos azuis 1x CCR) e ilhotas não tratadas (círculos pretos). 1x CCR = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL de IL-1β e 100 ng/mL de IFN-γ. Barra de escala = 10 μm. Cada ponto de dados é uma ilhota. Os dados são apresentados como uma média ± EPM. **** p<0,0001 indica significância estatística com base no teste t de Welch independente (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Coloração tripla de ilhotas com coloração nuclear (azul), indicador seletivo de Zn²⁺ (verde) e iodeto de propídio (vermelho) para avaliação da morte específica de células β pancreáticas. (A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de (A) ilhotas de camundongos não tratadas e (B) ilhotas tratadas com citocinas em diferentes pilhas z de 10 μm de distância. (C) Porcentagem de morte de células β em ilhotas tratadas com citocinas (1x CCR). 1x CCR = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL de IL-1β e 100 ng/mL de IFN-γ. Barra de escala = 10 μm. PI+ = Total de células mortas, PI+β+ = Células mortas β e β+ = Total (mortas e vivas) de β células. Cada ponto de dados é uma ilhota. Os dados são apresentados como uma média ± EPM. **** p<0,0001 indica significância estatística com base no teste t de Welch independente (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de sondas fluorescentes usadas neste protocolo, sua excitação/emissão e o estado celular indicado pela coloração positiva.

Este estudo demonstra a eficácia dos métodos de multicoloração com corantes fluorescentes e microscopia confocal na avaliação da viabilidade das células das ilhotas, apoptose e sobrevivência de β células sob estresse induzido por citocinas. A coloração FDA / PI revelou um aumento dependente da dose na morte celular dentro das ilhotas expostas a citocinas, como evidenciado pela fluorescência vermelha marcando células comprometidas pela membrana, confirmando o efeito citotóxico das citocinas na viabilidade celular. A coloração FDA / PI também identifica células viáveis e mortas em ilhotas humanas, oferecendo uma rápida avaliação qualitativa da viabilidade da preparação de ilhotas humanas⁷. Assim, este método de coloração é confiável para avaliar a viabilidade celular em condições inflamatórias. Esse resultado também reforça o papel das citocinas na fisiopatologia do diabetes, onde a exposição prolongada às citocinas é prejudicial à função e sobrevida das células β ^5,19.

As colorações nucleares YOPRO-1 / e Anexina-V / nuclear forneceram informações adicionais sobre a apoptose induzida por citocinas. As ilhotas tratadas com citocinas exibiram aumento da fluorescência verde indicativa de células mortas associadas a células apoptóticas. A anexina-V também confirmou a presença de células apoptóticas precoces e progressivas. Juntas, essas técnicas de coloração caracterizam efetivamente a apoptose em células β, validando a apoptose como um mecanismo primário de morte de células de ilhotas quando expostas a citocinas pró-inflamatórias³.

Inibidores de proteína quinase que podem interromper as vias de transdução de sinal apoptótico, bem como anticorpos e antagonistas contra as ações de citocinas pró-inflamatórias, estão sendo explorados como terapêuticas promissoras que podem prevenir a apoptose de células β ^5,20,21. Essas atividades de pesquisa empregam microscopia baseada em fluorescência para avaliar possíveis intervenções para mitigar a apoptose induzida por citocinas, com foco na preservação da função das células β em modelos de diabetes. Ao incorporar ainda mais a coloração seletiva do indicador Zn²⁺, essa abordagem permite a visualização seletiva das células β produtoras de insulina por meio da associação de zinco, fornecendo uma visão direcionada dos efeitos das citocinas nas populações de células β dentro das ilhotas e aumentando a especificidade da análise¹⁶. Essa abordagem distinguiu as células β de outras células das ilhotas e revelou destruição significativa de células β, com aproximadamente 63% da morte de células β após a exposição a citocinas em nosso estudo. Essa especificidade é fundamental para avaliar a preservação de células β e destaca ainda mais a necessidade de suas estratégias protetoras no controle do diabetes.

Esses resultados ressaltam a versatilidade da coloração FDA/PI, YOPRO-1/nuclear e Zn²⁺ indicador seletivo/coloração nuclear/PI na avaliação da morte das ilhotas. Uma etapa crítica neste protocolo é a seleção da combinação apropriada de sondas fluorescentes para minimizar a sobreposição espectral na coleta de dados. A Tabela 1 descreve todas as sondas fluorescentes demonstradas neste protocolo, juntamente com seus respectivos máximos de excitação e emissão e o estado celular (vivo/morto/apoptótico) que cada coloração indica. A otimização dos filtros de excitação e emissão pode ser necessária para minimizar a sobreposição espectral entre os corantes para quantificar com precisão as células vivas, mortas ou apoptóticas. Além disso, a viabilidade das ilhotas isoladas diminui rapidamente ao longo do tempo, para melhores resultados na análise dos efeitos dos compostos na viabilidade das ilhotas, os experimentos devem ser realizados dentro de 72 h após o isolamento. Ao fornecer dados precisos e reprodutíveis sobre viabilidade celular, apoptose e morte específica de β células, este estudo ilustra o potencial dessas técnicas no desenvolvimento de intervenções terapêuticas destinadas a reduzir a toxicidade de citocinas e preservar a função das células β no diabetes. Estudos publicados em nosso laboratório usaram essa abordagem para fornecer dados quantitativos sobre a viabilidade de β células e proteção contra a apoptose na presença de um inibidor de pequenas moléculas ^5,21.

Uma limitação deste protocolo é que a coloração da morte apoptótica de células beta só pode ser obtida usando marcadores adicionais específicos de células beta que não se sobrepõem espectralmente aos corantes de fluorescência YOPRO-1 ou Annexin-V. Alternativamente, linhas de camundongos repórter mais robustas, embora caras, como os camundongos repórteres de insulina cre com promotores específicos de apoptose, também podem ser adotadas. Este modelo de nocaute combina uma Cre-recombinase impulsionada por promotor de insulina com um sistema repórter como tdTomato e GFP para visualizar a apoptose em células beta pancreáticas que expressam insulina. Outra limitação é que a contagem manual de imagens de ilhotas é demorada e tem baixo rendimento. Embora os esforços estejam em andamento em nosso laboratório para desenvolver um plug-in ImageJ adequado para fornecer quantificação automatizada de células vivas/mortas, os plug-ins de contagem de células atualmente disponíveis usando ImageJ (NIH) ou outro software de contagem de células disponível comercialmente funcionam melhor com corantes como coloração nuclear e PI, que identificam núcleos de células e têm limites distinguíveis entre células individuais. Corantes como FDA e AnnexinV têm deformação mais esparsa, dificultando a identificação de limites entre as células ao contar com software automatizado.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

As seguintes doações forneceram fundos para este trabalho: NIDDK award R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B para NLF e ADA 7-20-JDF-020 para NLF Os autores gostariam de agradecer o apoio do Centro de Pesquisa em Diabetes do Campus P30-DK116073 Anschutz da Universidade do Colorado e das instalações centrais associadas utilizadas para apoiar este trabalho.