単離された膵島治療とアポトーシス測定

この研究では、細胞死とアポトーシスのマルチ染色蛍光ベースのマーカーを共焦点顕微鏡と組み合わせて使用し、膵島におけるサイトカイン誘発性アポトーシスとβ細胞特異的死を評価します。細胞外刺激に応答した細胞死とアポトーシスの空間的および時間的変化を明らかにします。

この研究では、蛍光染色技術と共焦点顕微鏡法を組み合わせて細胞生存率、アポトーシス、およびβ細胞特異的死を評価するために、膵島、特にインスリン産生β細胞に対する炎症誘発性サイトカインの影響を調査します。単離されたマウス膵島は、1型糖尿病の発症時に免疫介在性アポトーシスを模倣するために、TNF-α、IL-1β、IFN-γなどのさまざまな濃度のサイトカインカクテルで処理されました。膵島細胞の生存率は、FDA/PIデュアル染色で評価され、FDAのフルオレセインへの変換は生存細胞を示し、PIは膜損傷細胞をマークしました。YOPRO-1と核染色はアポトーシスに関する追加データを提供し、Annexin-Vは初期のアポトーシス細胞を確認しました。定量分析により、サイトカイン処理された膵島におけるアポトーシスと細胞死率の有意な増加が明らかになりました。β細胞への影響を特異的に評価するために、Zn²⁺ 選択的インジケーター染色を使用して、インスリン顆粒中の亜鉛会合を通じてインスリン産生細胞を標識し、炎症誘発性サイトカインで膵島を24時間処理した後、β細胞の大幅な損失を明らかにしました。これらのマルチ染色プロトコルは、サイトカイン誘発性膵島における損傷の程度を効果的に捕捉し、定量化し、初期の1型糖尿病におけるβ細胞アポトーシスを予防するように設計された治療法の評価に使用できます。

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、膵臓内にある内分泌細胞の集まりです。インスリン産生β細胞は、膵島で最も豊富で機能的に重要な成分です。これらのβ細胞は、グルコースの恒常性を維持する上で重要な役割を果たすホルモンであるインスリンを分泌します¹。1型糖尿病(T1D)では、免疫系が膵島を標的にして浸潤し、インスリン産生β細胞を破壊します。この自己免疫攻撃は、主にインターロイキン-1β(IL-1β)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターフェロンガンマ(IFN-γ)²などの炎症誘発性サイトカインによって媒介されます。これらのサイトカインは、β細胞内で一連のシグナル伝達イベントを開始し、最終的にアポトーシス³を引き起こします。アポトーシス(プログラムされた細胞死)は、カスパーゼの活性化、DNA断片化、細胞崩壊など、厳密に制御されたプロセスです。これは、T1D³の発症中にβ細胞の質量と機能が徐々に失われる原因となります。

β細胞アポトーシスを促進する分子メカニズムを理解することは、T1Dにおけるβ細胞破壊を予防または軽減する戦略を特定するために重要です。これを達成するために、実験モデルまたはヒトの死体から単離された膵島は、β細胞病理を研究するための堅牢で確立されたモデルシステムとして機能します^2,3。これらの単離された膵島を炎症誘発性サイトカインで処理することにより、研究者は初期のT1Dを特徴付ける環境を再現することができ、β細胞の機能不全とin vitroでの死の詳細な研究が可能になります^4,5。これらの実験は、疾患関連条件下でのβ細胞の脆弱性と生存に関する重要な洞察を提供するとともに、サイトカイン誘発性アポトーシスからβ細胞を保護または救出することを目的とした治療的介入をテストするためのプラットフォームとしても機能します。このin vitroシステムを利用することで、異なる種の膵島がさまざまな条件にどのように応答するかを効果的に解析することができ、種間の機能的およびアポトーシス的な変動をより深く理解することができます。

これまでの研究では、マウス由来のサイトカインとヒト由来のサイトカインをそれぞれカクテル(1x = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β、100 ng/mL IFN-γ)で24時間処理すると、膵島細胞が有意に死滅することが示されている^4,5,6。サイトカイン処理した細胞をフルオレセインジアセテート(FDA)およびヨウ化プロピジウム(PI)^5,6で染色することにより、膵島の生存率を確認しました。世界的に、膵島の生存率は、FDAおよび^PI7に準拠した標準的なデオキシリボ核酸(DNA)結合色素排除技術を使用して評価されています。蛍光染色剤または色素標識基質は、膜の完全性と透過性に基づいて細胞の生存率を評価します。細胞透過性色素であるFDAは、生細胞によって緑色蛍光(フルオレセイン)に変換されます。対照的に、細胞不透過性色素であるPIは、膜が損なわれた死細胞の核のみを染色します⁷。次に、細胞を共焦点顕微鏡で2色イメージングして分析し、緑色と赤色の蛍光灯がそれぞれ生存細胞と死細胞をマークします。

FDA/PI染色プロトコルの限界は、PIが膜選択性を失った細胞にのみ侵入するため、初期のアポトーシス細胞を区別できないことです。さらに、この方法では細胞サブセットを区別できないため、β細胞の生存率を選択的に評価するのには適していません。アネキシンV / PIプロトコルは、アポトーシス細胞の研究に一般的に使用され、プロトコルはその精度を向上させるために変更されています⁸。アポトーシスの初期段階には、原形質膜の内層から外層へのホスファチジルセリンの転座が含まれます。カルシウム依存性タンパク質であるアネキシンVは、この曝露されたホスファチジルセリンに高い親和性で結合します。アポトーシス細胞(アネキシンV陽性のみ)と壊死細胞(アネキシンV陽性のみ)を区別するために、アネキシンVによるPIによる染色が行われます。これは、壊死細胞は膜の完全性が損なわれているためにホスファチジルセリンも示します⁹。YOPRO-1などの他の色素も、膵島細胞のアポトーシスを定量するために使用されます。生細胞の細胞膜は、アポトーシスを受けている生細胞を定量化できないアネキシンVとは異なり、YOPRO-1に対して不透過性です。

膵臓β細胞死を評価するには、インスリン産生細胞のみを標的とする特異的な色素が必要です。膵臓β細胞の明確な特徴は、細胞内Zn²⁺の一部がZn²⁺-インスリン複合体(2:1比)として小胞に貯蔵されていることである¹⁰。遊離Zn²⁺は、リザーバーとしてβ細胞の周りの粒外空間にも存在します。分泌顆粒中のインスリンに緩く結合した遊離Zn²⁺およびZn²⁺は、亜鉛結合色素を用いて可視化することができます。ジンク結合性色素であるジチゾンは、膵島の純度を評価するために一般的に使用されますが、β細胞の生存率と機能を評価するために使用される蛍光色素と組み合わせることはできません¹¹。Zn²⁺に対して高い選択性を持つTSQやZinquinのようなUVプローブは、遊離細胞内Zn²⁺のイメージングと測定によりβ細胞を定量するために開発されました^。12,13.しかし、それらの使用は、溶解性が悪いこと、細胞負荷が不均一であること、UV励起要件、および酸性小胞¹⁴への区画化によって制限されている。ニューポートグリーンやZn²⁺選択的インジケーターなどの可視波長蛍光プローブも、これらの制限を克服するために開発され、現在、単離されたヒト膵島^15,16のβ細胞を検出するために広く使用されています。FluoZin-3(Zn²⁺選択的指標)は、ニューポートグリーンよりも高いZn²⁺親和性と優れた量子収率を有し、単離された島^14,17でインスリンと共放出されたZn²⁺のイメージングに効果的であることが証明されています。

FDA、PI、アネキシンV、YOPRO-1、Zn²⁺ 選択的インジケーターなどの蛍光色素を使用することで、生細胞、アポトーシス細胞、および全死細胞の測定と鑑別が可能になります。適合する高選択性プローブを組み合わせることで、糖尿病研究や医薬品開発におけるβ細胞破壊の理解と軽減に不可欠な、β細胞生存率とアポトーシスの評価と定量化のための標的法も提供されます。

マウスを用いたすべての実験は、コロラド大学デンバー校の動物管理および使用委員会(Protocols 000929)によって承認されました。この実験に使用したC57Bl/6マウスは、ジャクソン研究所から購入し、12時間の明暗サイクルの温度制御施設に収容し、餌と水を自由に利用できるようにしました。単離されたマウス膵島は、以前に報告されたコラゲナーゼ消化プロトコルを使用して取得されました^5,18。

1.溶液と培地の調製

注:培地、サイトカインストック、およびその他の試薬は、滅菌条件下で調製する必要があります。

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、10,000 U/mLペニシリン、および10,000 μg/mLストレプトマイシンを500 mLの1640 RPMI培地に添加して、膵島培養培地を調製します。
2. 1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4を調製します。0.1% ウシ血清アルブミン(BSA)を含む滅菌 PBS 中のマウスサイトカインカクテル、10 μg/mL TNF-α 10μg/mL、5 μg/mL IL-1β、および 100 μg/mL IFN-γ の 1000x ストック溶液を調製し、溶液を 10 μL アリコートで -20 °C で保存します。
3. アセトンに溶かした46 μM(50x)のFDAストック溶液を調製し、1 mLアリコートに-20°Cで保存します。 1.434 mM(50x)PIストック溶液をPBSに調製し、1 mLアリコートに4°Cで保存します。
4. 500 mLの重炭酸塩修飾Krebs-Henseleit HEPES(BMHH)緩衝液500 mLを、125 mM NaCl、5.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM MgCl₂、および10 mM HEPESを含む500 mLの重炭酸塩修飾Krebs-Henseleit HEPES(BMHH)バッファー500 mLを調製し、500 mLのdH₂Oに調製します。
5. 100 mLのdH₂O中に10 mM HEPES、140 mM NaCl、および2.5 mM CaCl₂を入れた100 mLのAnnexin-V結合緩衝液を調製し、pHを7.4に調整します。
6. 1mM Zn²⁺ 選択的インジケーターストック溶液をDMSOに調製し、-20°Cで10μLアリコートで保存します。
   注:蛍光色素は光に敏感であるため、保管とインキュベーションは暗闇で行う必要があります。

2. 単離された膵島のサイトカインによる治療

1. 10 μLのマイクロピペットでマウス膵島を培養培地に単離し、37°Cおよび5%CO₂ で一晩インキュベートして、サイトカインで処理する前に単離ストレスから回復します。
2. 滅菌した膵島培養培地2 mLを35 mmの非組織培養シャーレに添加し、適切に標識して、サイトカイン処理済みディッシュとサイトカインなしの未処理ディッシュを区別します。
3. サイトカイン処理した皿の場合は、6 μL の培地を取り出し、ストック溶液から各サイトカインを 2 μL と交換して、10 ng/mL、5 ng/mL IL-1β、および 100 ng/mL IFN-γ (1x RCC) の最終相対サイトカイン濃度を得ます。
   注:0.5倍および0.1倍の低いRCCは、0.1%BSAを含む滅菌PBSでストック溶液をそれぞれ1:1および1:9で希釈することにより調製できます。
4. 分離後12時間〜24時間で、光学顕微鏡下のマイクロピペットを使用して10〜20個の島をピックアップし、皿に移し、加湿した37°C、5%_CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
   注:インキュベーション時間は、特定の実験目的によって異なる場合があります。

3. FDA/PIによる膵島の生存率測定

1. 0.1% BSAを含むBMHHバッファー960 μLに、FDAストック溶液とPIストック溶液をそれぞれ20 μL加えると、最終濃度はそれぞれ0.46 μMおよび14.34 μMの蛍光色素が得られます。
2. 染色液100 μLを7 mmのガラス底非組織培養処理シャーレに分注します。
3. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、各処理から少なくとも6つの小島をガラス底のペトリ皿に慎重に移します。暗所で室温で5〜10分間インキュベートします(ホイルで覆います)。
4. 40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。FDA/PI染色後15分以内に画像を撮影してください。
5. 488 nmと514 nmの励起レーザーを使用して、それぞれFDA(520 nm)とPI(620 nm)の蛍光発光を検出します。
6. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
7. ImageJ(NIH)で、マウスあたり少なくとも5つの島(n = 3)について、生きた緑色(FDA陽性)および死死(PI陽性)細胞を手動でカウントします。細胞死の割合を次のように計算します。
   膵島死の割合 = 死細胞数/(死細胞数 + 生細胞数) x 100%

4. 染色法によるアポトーシス測定

1. 8 μLのYOPRO-1(1 mM溶液)を992 μLのBMHHイメージングバッファーに加えて、最終濃度を0.8 μMにします。
2. 染色液500 μLを14 mmのガラス底非組織培養処理シャーレに分注します。
3. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、各処理の少なくとも6つの膵島をガラス底のペトリ皿に慎重に移し、暗所で37°Cで1時間インキュベートします(ホイルで覆います)。
4. 20分間のインキュベーション後、NucBlue(核染色剤、20 μL)を各ガラス底シャーレに一滴加え、インキュベーションを続けます。総インキュベーション時間は、YOPRO-1では1時間、核染色では40分です。
5. インキュベーションの1時間後、7 mmガラス底の非組織培養処理シャーレ中の0.1% BSA(100 μL)を含む新鮮なBMHHイメージングバッファーに膵島を移します。
6. 40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。405 nmと488 nmの励起レーザーを使用して、それぞれ核染色(460 nm)とYOPRO-1(509 nm)の蛍光発光を検出します。
7. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
8. ImageJ(NIH)で、生きた青色(核染色陽性)およびアポトーシス緑色(YOPRO-1陽性)細胞を、マウスあたり少なくとも5つの島(n = 3)について手動でカウントします。アポトーシス膵島細胞の割合を次のように計算します。
   アポトーシス膵島細胞の割合 = アポトーシス細胞数 / (アポトーシス細胞数 + 生細胞数) x 100%

5. アネキシンV/核染色によるアポトーシス測定

1. 2滴の核染色剤(40 μL)を1 mLのアネキシン結合バッファーに加えます。溶液100μLを7 mmガラス底の非組織培養処理シャーレに分注します。
2. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、PBSの各処理から少なくとも6つの島を3回ピペッティングして、10μlのマイクロピペットを使用して3回ピペッティングして慎重にすすぎます。膵島を核染色液を入れたガラス底のシャーレに移し、暗所で37°Cで40分間インキュベートします(ホイルで覆います)。
3. 25分間のインキュベーション後、各ガラス底シャーレに5 μLのAnnexin V Alexa Flour 488コンジュゲートを加え、インキュベーションを続けます。総インキュベーション時間は、核染色で40分、アネキシンVで15分です。
4. インキュベーションの40分後、7 mmガラス底シャーレ内の新鮮なBMHHイメージングバッファー(Annexin Vまたは核染色なし)に膵島を移します。
5. 40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。405 nmと488 nmの励起レーザーを使用して、それぞれ核染色(460 nm)とアネキシンVコンジュゲート(515 nm)の蛍光発光を検出します。
6. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
7. ImageJ(NIH)で、生きた青色細胞(核染色陽性)およびアポトーシス緑色細胞(アネキシンV陽性)を、マウスあたり少なくとも5個の島(n = 3)について手動でカウントします。アポトーシス膵島細胞の割合を次のように計算します。
   アポトーシス細胞の割合 = アポトーシス細胞数 / (アポトーシス細胞数 + 生細胞数) x 100%

6. Zn²⁺ 選択的指示薬/核染色/PIを用いたβ細胞死測定

1. 2 μL の Zn²⁺ 選択的インジケーター AM ストック溶液を 998 μL の BMHH イメージングバッファーに加え、最終濃度を 0.2 μM にします。14 mm のガラス底非組織培養処理シャーレに 500 μL の染色溶液を分注します。
2. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、各処理から少なくとも6つの小島をガラス底のペトリ皿に慎重に移します。暗所でZn²⁺ 選択的インジケーターAM溶液(ホイルで覆う)を使用して、暗所で1時間インキュベートします。
3. 20分間のインキュベーション後、製造元の指示に従って、各ガラス底のシャーレに核染色剤(20 μl)を1滴加え、インキュベーションを続けます。総インキュベーション時間は、Zn²⁺ 選択的インジケーターで1時間、核染色で40分です。
4. インキュベーションの1時間後、7 mmガラス底の非組織培養処理シャーレ中の0.1% BSA(100 μL)を含む新鮮なBMHHイメージングバッファーに膵島を移します。PIストック溶液2 μLを10分間加えて、最終濃度を20 μg/mLにします。
5. PI染色後15分以内に、40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。405 nm、488 nm、514 nmの励起レーザーを使用して、それぞれ核染色(460 nm)、Zn²⁺ 選択的インジケーター(516 nm)、PI(620 nm)の蛍光発光を検出します。
6. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
7. ImageJ(NIH)で、生きた青色(核染色陽性)、亜鉛緑色(Zn²⁺ 選択的インジケーター陽性)、および死んだ赤色(PI陽性)の細胞を、マウスあたり少なくとも5つの島(n = 3)について手動でカウントします。β細胞死の割合を次のように計算します。
   β細胞死の割合=亜鉛陽性細胞およびPI陽性細胞の数/(死細胞+生膵島細胞の数)x 100%
   又は
   β細胞死の割合=亜鉛陽性細胞およびPI陽性細胞の数/(亜鉛陽性細胞の数)×100%

FDAとPIによる二重染色は、サイトカインで処理された膵島の生存率を評価するために使用されました。すべての実験はトリプリケート(n = 3)で実施され、データは10 μm離れた複数のzスタック画像から生成され、各反復には5つまたは6つの島からの平均データが含まれていました。 図1A は、酵素活性細胞によるFDAのフルオレセインへの変換により、未処理の対照群からの健康な膵島が明確な緑色蛍光を示すことを示しています。赤色蛍光が存在しないか、またはほとんど存在しないことは、これらの膵島の生存率を確認し、無傷の細胞膜を示しています。対照的に、 図1B は、サイトカイン処理された膵島で有意な赤色蛍光を示し、死んだ細胞または死にかけている細胞に膜の完全性が損なわれていることを示しています。この赤色蛍光の増加は、膜破壊を伴う非生存細胞の核のPI染色を浮き彫りにしています。サイトカイン濃度が膵島の生存率に与える影響を 図1Cに示します。定量的データは、膵島の死亡率とサイトカイン濃度の増加(0.1x-1x RCC)との間に正の相関関係があることを明らかにしています。この用量依存的な応答は、サイトカイン曝露量の多いPI染色細胞における赤色蛍光の増加によって証明されるように、サイトカインが膵島細胞に及ぼす細胞傷害性の影響を強調しています。

サイトカイン誘発性アポトーシスを測定するために、未処理およびサイトカイン処理された膵島細胞をYOPRO-1および核染色で染色し、アポトーシス細胞および生存細胞を定量しました。図2Aは、未処理の対照皿からの非アポトーシス細胞の代表的な画像を示しており、核内に強い青色の蛍光が観察され、緑色の蛍光は観察されず、生存可能な非アポトーシス細胞を示しています。図2Bは、YOPRO-1からの明確な緑色蛍光と青色核染色を有するサイトカイン処理膵島を示しています。この二重蛍光は、YOPRO-1がストレスを受けた細胞膜に浸透するため、アポトーシスを確認します。定量化により、膵島の30%以上がサイトカイン曝露から24時間以内にアポトーシスを示したことが明らかになりました(図2C)。アポトーシスをさらに検証するためにアネキシン-V染色を行ったところ、膵島の約40%がアネキシン-Vに対して陽性で染色され、初期のアポトーシス細胞とアポトーシスを通じて進行する細胞の両方を捕捉することが示されました(図2D-F)。

最後に、サイトカインに応答した膵臓β細胞死亡率を評価するために、未処理およびサイトカイン処理された膵島をZn²⁺ 選択的インジケーター、核染色、およびPIで染色しました(図3A、B)。私たちの結果は、Zn²⁺ 選択的インジケーターによる離散的な点状染色パターンを示し、Zn²⁺ 選択的インジケーターが分泌顆粒中のインスリンに関連する遊離および緩く結合した亜鉛に結合していることを示しています。さらに、これらの色素によるトリプル染色により、異なる蛍光チャネル(青は核染色、赤はPI、緑はZn²⁺ 選択的インジケーター)の組み合わせが可能となり、蛍光顕微鏡下での精密なマルチプレックス可視化が可能になり、生細胞と死細胞だけでなく、インスリン産生β細胞の特異的な死も容易に区別することができます。また、β細胞、死細胞、または膵島細胞の総数の一部としてβ細胞死を記述定量するためのデータも提供します。 図3C は、サイトカインがβ細胞のさらなる破壊を引き起こし、健康な膵島との共培養から24時間以内にインスリン産生細胞の約63%を破壊することを示しています。

図1:フルオレセインジアセテート(緑)とヨウ化プロピジウム(赤)による膵島の二重染色により、サイトカイン媒介死を評価します。 (A)未処理のマウス膵島および(B)フルオレセインジアセテート(緑)およびヨウ化プロピジウム(赤)で染色されたサイトカイン処理された膵島の代表的な蛍光顕微鏡画像。(C)さまざまな相対サイトカイン濃度(0.1倍の赤の四角、0.5倍の緑の三角、および1×RCCの青の三角)で処理されたマウス膵島および未処理の膵島(黒の円)の生存率。1x RCC = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β、および 100 ng/mL IFN-γ。スケールバー = 10 μm。各データ ポイントは小島です。±*p < 0.05 および ***p < 0.001 は、テューキーの事後分析 (n = 3) による ANOVA に基づく統計的有意性を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:サイトカイン誘発性アポトーシスのマーカーとしてYOPRO-1およびAnnexin-Vによる膵島の染色(A)未処理のマウス膵島の代表的な蛍光顕微鏡画像、および(B)核染色(青)およびYOPRO-1(緑)で染色されたサイトカイン処理された膵島。スケールバー = 10 μm. (C) サイトカイン処理した膵島(1x RCCの青い三角形)および未処理の膵島(黒い円)におけるYOPRO-1陽性細胞の割合。(D)未処理のマウス膵島および(E)核染色で染色されたサイトカイン処理された膵島(青)およびアネキシンV(緑)の代表的な蛍光顕微鏡画像。(F)サイトカイン処理した膵島(1x RCCの青い三角形)および未処理の膵島(黒い円)におけるアネキシンV陽性細胞の割合。1x RCC = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β、および 100 ng/mL IFN-γ。スケールバー = 10 μm。各データ ポイントは小島です。±****p<0.0001 は、独立ウェルチの t 検定 (n = 3) に基づく統計的有意性を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:特異的な膵臓β細胞死の評価のための核染色(青)、Zn²⁺ 選択的指示薬(緑)、ヨウ化プロピジウム(赤)による膵島の三重染色。 (A)10 μm離れた異なるzスタックでの(A)未処理のマウス膵島と(B)サイトカイン処理された膵島の代表的な蛍光顕微鏡画像。(C)サイトカイン処理された膵島(1x RCC)におけるβ細胞の死滅率。1x RCC = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β、および 100 ng/mL IFN-γ。スケールバー = 10 μm. PI+ = 総死細胞数、PI+β+ = 死β細胞、β+ = 総 (死細胞および生細胞) β細胞。各データ ポイントは小島です。±****p<0.0001 は、独立ウェルチの t 検定 (n = 3) に基づく統計的有意性を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1: このプロトコルで使用される蛍光プローブ、それらの励起/発光、および陽性染色によって示される細胞状態のリスト。

この研究は、サイトカイン誘発ストレス下での膵島細胞の生存率、アポトーシス、およびβ細胞生存の評価における蛍光色素と共焦点顕微鏡法によるマルチ染色法の有効性を示しています。FDA/PI染色では、サイトカインに曝露された膵島内での細胞死が用量依存的に増加していることが明らかになり、膜損傷細胞をマーキングする赤色蛍光によって明らかなように、サイトカインが細胞生存率に及ぼす細胞傷害性の影響が確認されました。FDA/PI染色は、ヒト膵島の生存細胞と死細胞も同定し、ヒト膵島調製の^生存率7を迅速に定性的に評価します。したがって、この染色法は、炎症状態における細胞生存率の評価に信頼性があります。この結果はまた、長期にわたるサイトカイン曝露がβ細胞機能と生存に有害である糖尿病の病態生理学におけるサイトカインの役割を強化します^5,19。

YOPRO-1/核染色およびAnnexin-V/核染色は、サイトカイン誘発性アポトーシスに関するさらなる洞察を提供しました。サイトカイン処理された膵島は、アポトーシス細胞に関連する死細胞を示す緑色の蛍光の増加を示しました。また、アネキシン-Vは、早期および進行性のアポトーシス細胞の存在を確認しました。これらの染色技術により、β細胞のアポトーシスを効果的に特徴付け、炎症誘発性サイト^カイン3に曝露されたときの膵島細胞死の主要なメカニズムとしてアポトーシスが検証されます。

アポトーシスシグナル伝達経路を阻害する可能性のあるプロテインキナーゼ阻害剤、および炎症誘発性サイトカインの作用に対する抗体および拮抗薬は、β細胞アポトーシスを予防する可能性のある有望な治療法として探求されています^5,20,21。これらの研究活動では、蛍光顕微鏡を用いて、サイトカイン誘発性アポトーシスを軽減するための潜在的な介入を評価し、糖尿病モデルにおけるβ細胞機能の保持に焦点を当てています。Zn²⁺選択的インジケーター染色をさらに組み込むことにより、このアプローチは、亜鉛会合を通じてインスリン産生β細胞の選択的可視化を可能にし、膵島内のβ細胞集団に対するサイトカイン効果の的を絞ったビューを提供し、分析の特異性を高めます¹⁶。このアプローチにより、β細胞は他の膵島細胞と区別され、有意なβ細胞の破壊が明らかになり、私たちの研究ではサイトカイン曝露後のβ細胞の死が約63%でした。この特異性は、β細胞の保存を評価するために重要であり、糖尿病管理におけるその保護戦略の必要性をさらに強調しています。

これらの結果は、膵島死の評価におけるFDA/PI、YOPRO-1/核染色、およびZn²⁺選択的インジケーター/核染色/PI染色の多様性を強調しています。このプロトコルの重要なステップの1つは、データ収集におけるスペクトルの重複を最小限に抑えるために、蛍光プローブの適切な組み合わせを選択することです。表1は、このプロトコルで示されたすべての蛍光プローブの概要を、それぞれの励起および発光の最大値、および各染色が示す細胞状態(生/死/アポトーシス)とともに概説しています。生細胞、死細胞、またはアポトーシス細胞を正確に定量するために、色素間のスペクトルオーバーラップを最小限に抑えるために、励起フィルターと蛍光フィルターの最適化が必要になる場合があります。さらに、単離された膵島の生存率は時間とともに急速に低下するため、化合物が膵島の生存率に及ぼす影響を分析する最良の結果を得るためには、単離後72時間以内に実験を実施する必要があります。この研究は、細胞生存率、アポトーシス、およびβ細胞特異的死に関する正確で再現性のあるデータを提供することにより、糖尿病におけるサイトカイン毒性の低減とβ細胞機能の保持を目的とした治療介入の開発におけるこれらの技術の可能性を示しています。私たちの研究室から発表された研究では、このアプローチを使用して、低分子阻害剤^の存在下でのβ細胞生存率とアポトーシスに対する保護に関する定量的データを提供しています^5,21。

このプロトコルの1つの制限は、ベータ細胞アポトーシス死の染色は、YOPRO-1またはAnnexin-V蛍光色素とスペクトル的に重複しない追加のベータ細胞特異的マーカーを使用してのみ達成できることです。あるいは、アポトーシス特異的プロモーターを有するインスリン−creレポーターマウスのような、より頑健ではあるが高価なレポーターマウス系統も採用することができる。このノックアウトモデルは、インスリンプロモーター駆動型CreリコンビナーゼとtdTomatoやGFPなどのレポーターシステムを組み合わせて、インスリン発現膵臓ベータ細胞のアポトーシスを可視化します。また、膵島の画像の手動カウントは時間がかかり、スループットが低いという制限もあります。当研究室では、生細胞/死細胞の定量を自動化するための適切なImageJプラグインの開発が進められていますが、現在利用可能なImageJ(NIH)やその他の市販の細胞計数ソフトウェアを使用した細胞計数プラグインは、細胞核を特定し、個々の細胞間に区別可能な境界を持つ核染色剤やPIなどの色素に最適です。FDAやAnnexinVのような色素は、スパースなひずみを持っているため、自動化されたソフトウェアでカウントする際に細胞間の境界を特定するのが困難です。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

この作業には、NIDDK賞R01 DK137221、N.L.F.へのJDRF 3-SRA-2023-1367-S-B、およびN.L.F.へのADA 7-20-JDF-020の助成金が提供されました。著者らは、コロラド大学アンシュッツキャンパスP30-DK116073の糖尿病研究センターからの支援と、この研究を支援するために利用された関連コア施設に感謝したいと思います。