Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تستخدم هذه الدراسة علامات متعددة التألق قائمة على موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين والموت الخاص بالخلايا β في جزر البنكرياس. يكشف عن التغيرات المكانية والزمانية في موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج استجابة للمنبهات خارج الخلية.

Abstract

تبحث هذه الدراسة في تأثير السيتوكينات المؤيدة للالتهابات على جزر البنكرياس ، وخاصة الخلايا β المنتجة للأنسولين ، باستخدام مزيج من تقنيات تلطيخ التألق والفحص المجهري متحد البؤر لتقييم صلاحية الخلية ، موت الخلايا المبرمج ، والموت الخاص بالخلايا β. تمت معالجة جزر الفئران المعزولة بتركيزات متفاوتة من كوكتيل السيتوكين ، بما في ذلك TNF-α و IL-1β و IFN-γ ، لتقليد موت الخلايا المبرمج بوساطة المناعة أثناء تطور مرض السكري من النوع 1. تم تقييم جدوى خلايا الجزر من خلال التلوين المزدوج FDA / PI ، حيث أشار تحويل إدارة الغذاء والدواء إلى فلورسين إلى خلايا قابلة للحياة ، وخلايا معرضة للخطر بالغشاء بعلامة PI. قدم YOPRO-1 والتلوين النووي بيانات إضافية عن موت الخلايا المبرمج ، مع تأكيد الملحق الخامس للخلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة. كشف التحليل الكمي عن زيادات كبيرة في معدلات موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا في الجزر المعالجة بالسيتوكينات. لتقييم التأثيرات على الخلايا β على وجه التحديد ، تم استخدام تلطيخ مؤشر Zn2+ الانتقائي لتسمية الخلايا المنتجة للأنسولين من خلال ارتباط الزنك في حبيبات الأنسولين ، مما يكشف عن فقدان كبير للخلايا β بعد معالجة الجزر بالسيتوكينات المؤيدة للالتهابات لمدة 24 ساعة. تلتقط بروتوكولات التلطيخ المتعددة هذه بشكل فعال وتحدد مدى الضرر الناجم عن السيتوكين في الجزر الصغيرة ويمكن استخدامها لتقييم العلاجات المصممة لمنع موت الخلايا المبرمج β الخلايا في مرض السكري من النوع 1 المبكر.

Introduction

جزر البنكرياس ، والمعروفة أيضا باسم جزر لانجرهانز ، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء الموجودة داخل البنكرياس. الخلايا β المنتجة للأنسولين هي المكون الأكثر وفرة وأهمية وظيفية في جزر البنكرياس. تفرز هذه الخلايا β الأنسولين ، وهو هرمون يلعب دورا مهما في الحفاظ على توازن الجلوكوز1. في مرض السكري من النوع 1 (T1D) ، يستهدف الجهاز المناعي جزر البنكرياس ويتسلل إليها ، مما يؤدي إلى تدمير الخلايا β المنتجة للأنسولين. يتم التوسط في هجوم المناعة الذاتية هذا بشكل أساسي عن طريق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك إنترلوكين -1β (IL-1β) ، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وإنترفيرون جاما (IFN-γ) 2. تبدأ هذه السيتوكينات سلسلة من أحداث الإشارات داخل الخلايا β التي تؤدي في النهاية إلى موت الخلاياالمبرمج 3. موت الخلايا المبرمج ، موت الخلايا المبرمج ، هو عملية منظمة بإحكام تنطوي على تنشيط الكاسباسات وتجزئة الحمض النووي والتفكك الخلوي. يساهم في الفقدان التدريجي لكتلة الخلايا β ووظيفتها أثناء ظهور T1D3.

يعد فهم الآليات الجزيئية التي تدفع موت الخلايا المبرمج للخلايا β أمرا بالغ الأهمية لتحديد استراتيجيات منع أو تخفيف تدمير الخلايا β في T1D. لتحقيق ذلك ، تعمل جزر البنكرياس المعزولة من النماذج التجريبية أو الجثث البشرية كنظام نموذجي قوي وراسخ لدراسة أمراض الخلايا β2،3. من خلال معالجة هذه الجزر المعزولة بالسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، يمكن للباحثين تكرار البيئة التي تميز T1D المبكر ، مما يسمح بدراسة مفصلة لخلل الخلايا β والموت في المختبر4،5. توفر هذه التجارب رؤى رئيسية حول ضعف الخلايا β وبقائها في ظل الظروف المرتبطة بالأمراض ، كما أنها تعمل كمنصة لاختبار التدخلات العلاجية التي تهدف إلى حماية أو إنقاذ الخلايا β من موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين. من خلال استخدام هذا النظام في المختبر ، يمكننا تحليل كيفية استجابة الجزر الصغيرة من الأنواع المختلفة للظروف المختلفة بشكل فعال ، مما يوفر فهما أفضل للاختلافات الوظيفية وموت الخلايا المبرمج عبر الأنواع.

أظهرت الدراسات السابقة أن الفئران والجزر الصغيرة البشرية عولجت لمدة 24 ساعة بكوكتيل (1x = 10 نانوغرام / مل TNF-α ، و 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ) من السيتوكينات المشتقة من الفئران والإنسان ، على التوالي ، أدت إلى موت كبير لخلايا الجزر4،5،6. تم تأكيد صلاحية الجزيرة عن طريق تلطيخ الخلايا المعالجة بالسيتوكين بثنائي أسيتات الفلورسين (FDA) ويوديد البروبيديوم (PI) 5،6. على الصعيد العالمي ، يتم تقييم جدوى الجزر باستخدام تقنية استبعاد الصبغة القياسية المرتبطة بحمض الديوكسي ريبونوكلييك (DNA) مع FDA و PI7. تقوم بقع الفلورسنت أو الركائز المترافقة بالصبغة بتقييم صلاحية الخلية بناء على سلامة الغشاء ونفاذيته. يتم تحويل FDA ، وهي صبغة منفذة للخلايا ، بواسطة الخلايا الحية إلى مضان أخضر (فلورسين). في المقابل ، PI ، وهي صبغة غير منفذة للخلية ، تلطخ فقط نوى الخلايا الميتة ذات الأغشية المعرضةللخطر 7. ثم يتم تحليل الخلايا من خلال التصوير ثنائي اللون على مجهر متحد البؤر ، حيث تشير الفلورسنت الأخضر والأحمر إلى الخلايا القابلة للحياة والميتة ، على التوالي.

يتمثل الحد من بروتوكول تلطيخ FDA / PI في أن PI يدخل فقط الخلايا التي فقدت انتقائية الغشاء ، مما يعني أنه لا يمكنه التمييز بين الخلايا المبرمجة المبكرة. علاوة على ذلك ، لا يمكن لهذه الطريقة التمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا ، مما يجعلها غير مناسبة لتقييم قابلية β للخلايا بقاء بشكل انتقائي. يشيع استخدام بروتوكول Annexin V / PI لدراسة الخلايا المبرمجة ، وقد تم تعديل البروتوكول لتحسين دقته8. تتضمن المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج نقل الفوسفاتيديل سيرين من الطبقة الداخلية إلى الطبقة الخارجية لغشاء البلازما. يرتبط Annexin V ، وهو بروتين يعتمد على الكالسيوم ، بتقارب عال مع هذا الفوسفاتيديل سيرين المكشوف. يتم إجراء التلوين باستخدام PI جنبا إلى جنب مع الملحق V لتمييز الخلايا المبرمج (الملحق الإيجابي V فقط) من الخلايا الميتة (إيجابية لكل من الملحق-V و PI) ، حيث تعرض الخلايا النخرية أيضا الفوسفاتيديل سيرين بسبب سلامة الغشاءالمعرضة للخطر 9. تستخدم الأصباغ الأخرى ، مثل YOPRO-1 ، أيضا لتحديد موت الخلايا المبرمج لخلايا الجزر. غشاء الخلية للخلايا القابلة للحياة غير منفذ ل YOPRO-1 ، على عكس Annexin-V ، الذي لا يمكنه تحديد الخلايا الحية التي تخضع لموت الخلايا المبرمج.

لتقييم موت خلايا البنكرياس β ، هناك حاجة إلى أصباغ محددة تستهدف الخلايا المنتجة للأنسولين فقط. السمة المميزة لخلايا البنكرياس β هي أن جزءا من Zn2+ داخل الخلايا يتم تخزينه في حويصلات كمركب الأنسولين Zn2 + (نسبة 2: 1) 10. يوجد الزنكالحر 2+ أيضا في المساحة الحبيبية حول الخلايا β كخزانات. يمكن تصور Zn2+ و Zn2+ المرتبط بشكل فضفاض بالأنسولين في حبيبات إفرازية باستخدام أصباغ ملزمة بالزنك. يستخدم Dithizone ، وهو صبغة ملزمة بالزنك ، بشكل شائع لتقييم نقاء الجزيرة ، ولكن لا يمكن دمجها مع الأصباغ الفلورية المستخدمة لتقييم صلاحية الخلايا β ووظيفتها11. تم تطوير مجسات الأشعة فوق البنفسجية مثل TSQ و Zinquin الانتقائية للغاية تجاه Zn2+ لتحديد الخلايا β عن طريق تصوير وقياس Zn 2+ الحرة داخل الخلايا. 12،13. ومع ذلك ، فإن استخدامها محدود بسبب ضعف الذوبان ، والتحميل غير المتكافئ للخلايا ، ومتطلبات الإثارة للأشعة فوق البنفسجية ، والتقسيم إلى حويصلات حمضية14. كما تم تطوير مجسات الفلورسنت ذات الطول الموجي المرئي ، مثل مؤشر نيوبورت الأخضر والزنك2+ الانتقائي للتغلب على هذه القيود وتستخدم الآن على نطاق واسع للكشف عن الخلايا β في الجزر البشرية المعزولة15،16. يحتوي FluoZin-3 (مؤشر Zn2 + الانتقائي) على تقارب أعلى من Zn2 + وعائد كمي فائق من Newport Green وقد أثبت فعاليته في تصوير Zn2 + الذي تم إطلاقه مع الأنسولين في الجزر الصغيرةالمعزولة 14،17.

يتيح استخدام الأصباغ الفلورية مثل FDA و PI و Annexin V و YOPRO-1 و Zn2 + المؤشر الانتقائي القياس والتمايز بين الخلايا الميتة القابلة للحياة والخلايا المبرمجة والكلية. يوفر الجمع بين المجسات المتوافقة والانتقائية للغاية أيضا طريقة مستهدفة لتقييم وقياس قابلية الخلايا β وموت الخلايا المبرمج ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم وتخفف تدمير الخلايا β في أبحاث مرض السكري وتطوير الأدوية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة كولورادو دنفر (البروتوكولات 000929). تم شراء الفئران C57Bl / 6 المستخدمة في هذه التجربة من مختبر جاكسون وتم إيواؤها في منشأة يتم التحكم في درجة حرارتها في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل خاص. تم الحصول على جزر الفئران المعزولة باستخدام بروتوكول هضم الكولاجيناز ، والذي تم وصفه سابقا5،18.

1. إعداد الحلول والإعلام الثقافي

ملاحظة: يجب تحضير وسائط الاستزراع ومخزونات السيتوكين والكواشف الأخرى في ظروف معقمة.

  1. قم بإعداد وسط استزراع جزيري عن طريق إضافة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS)، و10,000 وحدة / مل من البنسلين و10,000 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين إلى 500 مل من 1640 دورة في البوصة متوسطة.
  2. تحضير 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4. قم بإعداد محلول مخزون 1000x من كوكتيل السيتوكينات الفأرية ، 10 ميكروغرام / مل TNF-α 10 ميكروغرام / مل ، 5 ميكروغرام / مل IL-1β ، و 100 ميكروغرام / مل IFN-γ في PBS معقم يحتوي على 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) وتخزين المحلول في 10 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد محلول مخزون 46 ميكرومتر (50x) من FDA في الأسيتون وتخزينه في 1 مل عند -20 درجة مئوية. قم بإعداد محلول مخزون PI 1.434 ملي مولار (50x) في PBS وقم بتخزينه في حصص 1 مل عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد 500 مل من المخزن المؤقت Krebs-Henseleit HEPES المعدل بالبيكربونات (BMHH) مع 125 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 2.5 ملي كلوريدالملطيوس 2 ، و 1.2 ملي مللي كلوريد2 ، و 10 ملي مولار HEPES في 500 مل من dH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4.
  5. قم بإعداد 100 مل من المخزن المؤقت الملزم Annexin-V مع 10 ملي مولار HEPES و 140 ملي كلوريد الصوديوم و 2.5 ملي كلوريدالملليوم 2 في 100 مل من dH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4.
  6. قم بإعداد محلول مخزون مؤشر انتقائي 1 ملي مولار Zn2+ في DMSO وتخزينه في 10 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: الأصباغ الفلورية حساسة للضوء ، لذلك يجب أن يكون التخزين والحضانة في الظلام.

2. علاج الجزر المعزولة بالسيتوكينات

  1. اعزل جزر الفئران ب 10 ميكرولتر في وسط الاستزراع واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 للتعافي من إجهاد العزل قبل المعالجة بالسيتوكينات.
  2. أضف 2 مل من وسط زراعة الجزر المعقمة إلى 35 مم من أطباق بتري غير المعالجة بزراعة الأنسجة وقم بتسميتها بشكل مناسب للتمييز بين الأطباق المعالجة بالسيتوكين وغير المعالجة بدون السيتوكينات.
  3. بالنسبة للأطباق المعالجة بالسيتوكين ، قم بإزالة 6 ميكرولتر من وسط الاستزراع واستبدله ب 2 ميكرولتر من كل سيتوكين من محلول المخزون لإعطاء تركيز سيتوكين نسبي نهائي يبلغ 10 نانوغرام / مل ، و 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ (1x RCC).
    ملاحظة: يمكن تحضير RCC أقل من 0.5x و 0.1x عن طريق تخفيف محاليل المخزون باستخدام PBS معقم يحتوي على 0.1٪ BSA عند 1: 1 و 1: 9 ، على التوالي.
  4. في 12 ساعة - 24 ساعة بعد العزل ، التقط 10-20 جزيرة صغيرة باستخدام ماصة دقيقة تحت مجهر ضوئي وانقله إلى الأطباق واحتضانه في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة اعتمادا على الأهداف التجريبية المحددة.

3. قياس جدوى الجزيرة مع FDA / PI

  1. أضف 20 ميكرولتر لكل من محاليل مخزون FDA و PI إلى 960 ميكرولتر من المخزن المؤقت BMHH الذي يحتوي على 0.1٪ BSA لإعطاء تركيز نهائي قدره 0.46 ميكرومتر و 14.34 ميكرومتر من الأصباغ الفلورية ، على التوالي.
  2. Aliquot 100 ميكرولتر من محلول التلوين إلى طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة بقاع زجاجي مقاس 7 مم.
  3. بعد 24 ساعة من الحضانة باستخدام السيتوكينات ، انقل بعناية ما لا يقل عن 6 جزر صغيرة من كل علاج إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي. احتضن لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام (غطيه بورق الألمنيوم).
  4. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. التقط الصور في غضون 15 دقيقة من تلطيخ FDA / PI.
  5. استخدم ليزر الإثارة عند 488 نانومتر و 514 نانومتر للكشف عن انبعاثات التألق لإدارة الغذاء والدواء (520 نانومتر) و PI (620 نانومتر) ، على التوالي.
  6. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
  7. عد الخلايا الخضراء الحية (إيجابية إدارة الغذاء والدواء) والحمراء الميتة (إيجابية PI) يدويا في ImageJ (NIH) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (n = 3). احسب نسبة موت الخلايا على النحو التالي:
    النسبة المئوية لموت الجزيرة = عدد الخلايا الميتة / (عدد الخلايا الميتة + عدد الخلايا الحية) × 100٪

4. قياس موت الخلايا المبرمج باستخدام التلوين

  1. أضف 8 ميكرولتر من YOPRO-1 (محلول 1 ملليمتر) إلى 992 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير BMHH للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.8 ميكرومتر.
  2. Aliquot 500 ميكرولتر من محلول التلوين إلى طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 14 مم من القاع الزجاجي.
  3. بعد 24 ساعة من الحضانة بالسيتوكينات ، انقل بعناية ما لا يقل عن 6 جزر صغيرة من كل معالجة إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام (قم بتغطيته بورق الألمنيوم).
  4. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف قطرة من NucBlue (بقعة نووية ، 20 ميكرولتر) إلى كل طبق بتري ذو قاع زجاجي واستمر في الحضانة. إجمالي وقت الحضانة هو 1 ساعة ل YOPRO-1 و 40 دقيقة للبقع النووية.
  5. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، انقل الجزر إلى مخزن تصوير BMHH جديد يحتوي على 0.1٪ BSA (100 ميكرولتر) في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 7 مم.
  6. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. استخدم ليزر الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر للكشف عن انبعاثات مضان البقع النووية (460 نانومتر) و YOPRO-1 (509 نانومتر) ، على التوالي.
  7. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
  8. عد الخلايا الزرقاء الحية (إيجابية البقع النووية) والخلايا المبرمجة (إيجابية YOPRO-1) يدويا في ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (ن = 3). احسب النسبة المئوية لخلايا جزيرة موت الخلايا المبرمج على النحو التالي:
    النسبة المئوية لخلايا جزر موت الخلايا المبرمج = عدد الخلايا المبرمجة / (عدد الخلايا المبرمجة + عدد الخلايا الحية) × 100٪

5. قياس موت الخلايا المبرمج باستخدام الملحق الخامس / وصمة عار نووية

  1. أضف قطرتين من البقعة النووية (40 ميكرولتر) إلى 1 مل من المخزن المؤقت المرتبط ب Annexin. Aliquot 100 ميكرولتر من المحلول في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة بحجم 7 مم من الزجاج.
  2. بعد 24 ساعة من الحضانة باستخدام السيتوكينات ، اشطفها بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 3 أضعاف 6 جزر على الأقل من كل معالجة في PBS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات باستخدام الماصة الدقيقة سعة 10 ميكرولتر. انقل الجزر الصغيرة إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي مع محلول البقع النووية واحتضنها لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام (قم بتغطيتها بورق الألمنيوم).
  3. بعد 25 دقيقة من الحضانة ، أضف 5 ميكرولتر من دقيق Annexin V Alexa 488 إلى كل طبق بتري ذو قاع زجاجي واستمر في الحضانة. إجمالي وقت الحضانة هو 40 دقيقة للبقعة النووية و 15 دقيقة للملحق الخامس.
  4. بعد 40 دقيقة من الحضانة ، انقل الجزر إلى مخزن مؤقت جديد للتصوير BMHH (بدون Annexin V أو صبغة نووية) في طبق بتري زجاجي 7 مم.
  5. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. استخدم ليزر الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر للكشف عن انبعاثات مضان البقع النووية (460 نانومتر) والمترافق Annexin V (515 نانومتر) ، على التوالي.
  6. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
  7. عد الخلايا الزرقاء الحية (إيجابية البقع النووية) والخلايا المبرمجة (Annexin V-positive) يدويا في ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (ن = 3). احسب النسبة المئوية لخلايا جزيرة موت الخلايا المبرمج على النحو التالي:
    النسبة المئوية للخلايا المبرمجة = عدد الخلايا المبرمجة / (عدد الخلايا المبرمجة + عدد الخلايا الحية) × 100٪

6. قياس موت الخلايا β باستخدام مؤشر Zn2+ الانتقائي / وصمة عار نووية / PI

  1. أضف 2 ميكرولتر من المؤشر الانتقائي Zn2+ محلول مخزون AM إلى 998 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير BMHH لعمل تركيز نهائي يبلغ 0.2 ميكرومتر. Aliquot 500 ميكرولتر من محلول التلوين إلى طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 14 مم غير معالج بزراعة الأنسجة.
  2. بعد 24 ساعة من الحضانة باستخدام السيتوكينات ، انقل بعناية ما لا يقل عن 6 جزر صغيرة من كل علاج إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي. احتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام باستخدام محلول AM المؤشر الانتقائي Zn2+ (قم بتغطيته بورق الألمنيوم).
  3. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف قطرة من البقعة النووية (20 ميكرولتر) إلى كل طبق بتري ذو قاع زجاجي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستمر في الحضانة. إجمالي وقت الحضانة هو 1 ساعة للمؤشر الانتقائي Zn2+ و 40 دقيقة للبقع النووية.
  4. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، انقل الجزر إلى مخزن تصوير BMHH جديد يحتوي على 0.1٪ BSA (100 ميكرولتر) في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 7 مم. أضف 2 ميكرولتر من محلول مخزون PI لمدة 10 دقائق لعمل تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام / مل.
  5. التقط صورا في غضون 15 دقيقة من تلطيخ PI باستخدام الفحص المجهري الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. استخدم ليزر الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر و 514 نانومتر للكشف عن انبعاثات مضان البقع النووية (460 نانومتر) ، والمؤشر الانتقائي Zn2+ (516 نانومتر) ، و PI (620 نانومتر) ، على التوالي.
  6. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
  7. عد الخلايا الزرقاء الحية (إيجابية البقع النووية) ، والأخضر الزنك (Zn2+ المؤشر الانتقائي الإيجابي) ، والأحمر الميت (إيجابي PI) يدويا في ImageJ (NIH) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (ن = 3). احسب النسبة المئوية لموت الخلايا β على النحو التالي:
    النسبة المئوية لموت الخلايا β = عدد الخلايا الإيجابية للزنك والخلايا الإيجابية PI / (عدد الخلايا الميتة + خلايا الجزيرة الحية) × 100٪
    أو
    النسبة المئوية لموت الخلايا β = عدد الخلايا الإيجابية للزنك والخلايا الإيجابية PI / (عدد الخلايا الإيجابية للزنك) × 100٪

النتائج

تم استخدام التلوين المزدوج باستخدام FDA و PI لتقييم جدوى الجزر الصغيرة المعالجة بالسيتوكينات. أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن = 3) ، وتم إنشاء البيانات من صور متعددة z-stack بمسافة 10 ميكرومتر ، مع احتواء كل نسخة مكررة على متوسط بيانات من 5 أو 6 جزر ، لضمان قابلية التكرار والمقارنة الإحصائية بين الجزر المعالجة وغير المعالجة. يوضح الشكل 1 أ جزرا سليمة من مجموعة التحكم غير المعالجة تظهر تألالة خضراء مميزة بسبب تحويل إدارة الغذاء والدواء إلى فلورسين بواسطة الخلايا النشطة إنزيميا. يؤكد غياب أو الحد الأدنى من وجود التألق الأحمر جدوى هذه الجزر ، مما يشير إلى أغشية الخلايا السليمة. في المقابل ، يوضح الشكل 1 ب تألق أحمر كبير في الجزر المعالجة بالسيتوكين ، مما يشير إلى الخلايا الميتة أو المحتضرة بسلامة الغشاء المعرضة للخطر. تسلط هذه الزيادة في التألق الأحمر الضوء على تلطيخ PI للنوى في الخلايا غير القابلة للحياة مع اضطراب الغشاء. يظهر تأثير تركيز السيتوكين على قابلية بقاء الجزيرة في الشكل 1 ج. تكشف البيانات الكمية عن وجود علاقة إيجابية بين معدل وفيات الجزيرة وزيادة تركيزات السيتوكين (0.1x-1x RCC). تؤكد هذه الاستجابة المعتمدة على الجرعة على التأثيرات السامة للخلايا للسيتوكينات على خلايا الجزر ، كما يتضح من زيادة التألق الأحمر في الخلايا الملطخة ب PI مع التعرض العالي للسيتوكين.

لقياس موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين ، تم تلطيخ خلايا جزر الخلايا غير المعالجة والمعالجة بالسيتوكينات ب YOPRO-1 والبقع النووية لتحديد الخلايا المبرمج والقابلة للحياة. يوضح الشكل 2 أ صورة تمثيلية لخلية غير موت الخلايا المبرمج من طبق التحكم غير المعالج ، حيث لوحظ تألق أزرق قوي في النواة ، مع عدم وجود مضان أخضر ، مما يشير إلى خلية قابلة للحياة وغير موت الخلايا المبرمج. يعرض الشكل 2 ب الجزر الصغيرة المعالجة بالسيتوكين مع تألق أخضر مميز من YOPRO-1 جنبا إلى جنب مع تلطيخ نووي أزرق. يؤكد هذا التألق المزدوج موت الخلايا المبرمج ، حيث يتخلل YOPRO-1 أغشية الخلايا المجهدة. كشف القياس الكمي أن أكثر من 30٪ من جزر البنكرياس أظهرت موت الخلايا المبرمج في غضون 24 ساعة من التعرض للسيتوكين (الشكل 2 ج). تم إجراء تلطيخ Annexin-V للتحقق من صحة موت الخلايا المبرمج بشكل أكبر ، مما يدل على أن ما يقرب من 40٪ من الجزر الملطخة بشكل إيجابي للملحق الخامس ، حيث تلتقط كل من الخلايا المبرمجة المبكرة وتلك التي تتقدم من خلال موت الخلايا المبرمج (الشكل 2D-F).

أخيرا ، لتقييم معدل وفيات خلايا البنكرياس β استجابة للسيتوكينات ، قمنا بتلطيخ الجزر الصغيرة غير المعالجة والمعالجة بالسيتوكينات بمؤشر انتقائي Zn2+ ، وصمة عار نووية ، و PI (الشكل 3 أ ، ب). أظهرت نتائجنا نمطا منفصلا للتلطيخ مع مؤشر Zn2+ الانتقائي ، مما يشير إلى أن المؤشر الانتقائي Zn2+ ملزم بالزنك الحر والمرتبط بشكل فضفاض المرتبط بالأنسولين في الحبيبات الإفرازية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح التلوين الثلاثي بهذه الأصباغ بمزيج من قنوات التألق المميزة (الأزرق للبقع النووية ، والأحمر ل PI ، والأخضر للمؤشر الانتقائي Zn2+) ، مما يتيح تصورا دقيقا ومضاعفا تحت المجهر الفلوري ، مما يجعل من السهل التمييز ليس فقط بين الخلايا الحية والميتة ولكن أيضا الموت المحدد للخلايا β المنتجة للأنسولين. كما يوفر بيانات للقياس الكمي الوصفي لموت الخلايا β كجزء صغير من العدد الإجمالي للخلايا β أو الخلايا الميتة أو خلايا الجزر. يوضح الشكل 3 ج أن السيتوكينات تسبب مزيدا من تدمير الخلايا β ، مما يؤدي إلى تدمير حوالي 63٪ من الخلايا المنتجة للأنسولين في غضون 24 ساعة من الزراعة المشتركة مع الجزر السليمة.

figure-results-3644
الشكل 1: تلطيخ مزدوج للجزر بثنائي أسيتات الفلوريسين (الأخضر) ويوديد البروبيديوم (الأحمر) لتقييم الموت بوساطة السيتوكين. (أ) صور مجهرية فلورية تمثيلية لجزر الفئران غير المعالجة و (ب) الجزر المعالجة بالسيتوكينات الملطخة بثنائي أسيتات الفلوريسين (الأخضر) ويوديد البروبيديوم (الأحمر). (ج) النسبة المئوية للبقاء لجزر الفئران المعالجة بتركيزات مختلفة من السيتوكين النسبي (0.1x مربعات حمراء ، 0.5x مثلثات خضراء ، و 1x مثلثات زرقاء RCC) والجزر غير المعالجة (دوائر سوداء). 1x RCC = 10 نانوغرام / مل TNF-α ، 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. كل نقطة بيانات هي جزيرة صغيرة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. * ص < 0.05 و *** ص < 0.001 تشير إلى دلالة إحصائية بناء على ANOVA مع تحليل Tukey اللاحق (ن = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4775
الشكل 2: تلطيخ الجزر ب YOPRO-1 و Annexin-V كعلامات لموت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكينات. (أ) صور مجهرية فلورية تمثيلية لجزر الفئران غير المعالجة و (ب) الجزر المعالجة بالسيتوكين الملطخة بصبغة نووية (زرقاء) و YOPRO-1 (أخضر). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ج) النسبة المئوية للخلايا الإيجابية YOPRO-1 في الجزر الصغيرة المعالجة بالسيتوكين (1x مثلثات زرقاء RCC) والجزر غير المعالجة (الدوائر السوداء). (د) صور مجهرية فلورية تمثيلية لجزر الفئران غير المعالجة و (ه) الجزر المعالجة بالسيتوكينات الملطخة بصبغة نووية (زرقاء) والملحق الخامس (أخضر). (و) النسبة المئوية للخلايا الإيجابية للملحق الخامس في الجزر المعالجة بالسيتوكين (1x مثلثات زرقاء RCC) والجزر غير المعالجة (الدوائر السوداء). 1x RCC = 10 نانوغرام / مل TNF-α ، 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. كل نقطة بيانات هي جزيرة صغيرة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. ****p<0.0001 يشير إلى دلالة إحصائية بناء على اختبار ويلش المستقل (ن = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6153
الشكل 3: تلطيخ ثلاثي للجزر الصغيرة ذات البقع النووية (الأزرق) ، المؤشر الانتقائي Zn2+ (الأخضر) ، ويوديد البروبيديوم (الأحمر) لتقييم موت خلايا β البنكرياس المحددة. (أ) صور مجهرية مضان تمثيلية ل (أ) جزر الفئران غير المعالجة و (ب) الجزر المعالجة بالسيتوكينات في مداخن z مختلفة من المسافة 10 ميكرومتر. (ج) النسبة المئوية لموت الخلايا β في الجزر المعالجة بالسيتوكين (1x RCC). 1x RCC = 10 نانوغرام / مل TNF-α ، 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. PI+ = إجمالي الخلايا الميتة ، PI + β+ = الخلايا β الميتة و β+ = إجمالي الخلايا β (الميتة والحية). كل نقطة بيانات هي جزيرة صغيرة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. ****p<0.0001 يشير إلى دلالة إحصائية بناء على اختبار ويلش المستقل (ن = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مسبار الفلورسنتالسابق / Em (نانومتر)حالة الخلية المشار إليها
ثنائي أسيتات الفلورسين (FDA)488/520الخلايا الحية
يوديد بروبيديوم (PI)535/620الخلايا الميتة
الملحق الخامس AlexaFluor 488488/515الخلايا المبرمجة
يو برو -1488/509الخلايا المبرمجة المبكرة
وصمة عار نووية (Hoechst 33342)360/460الخلايا الحية
مؤشر Zn2+ الانتقائي488/516الخلايا المحتوية على الزنك

الجدول 1: قائمة مجسات الفلورسنت المستخدمة في هذا البروتوكول ، وإثارتها / انبعاثها ، وحالة الخلية المشار إليها بالتلوين الإيجابي.

Discussion

توضح هذه الدراسة فعالية طرق التلوين المتعدد مع الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر في تقييم صلاحية الخلايا الجزرية ، وموت الخلايا المبرمج ، وبقاء الخلايا β تحت الإجهاد الناجم عن السيتوكينات. كشف تلطيخ FDA / PI عن زيادة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا داخل الجزر المعرضة للسيتوكينات ، كما يتضح من التألق الأحمر الذي يشير إلى الخلايا المعرضة للخطر بالغشاء ، مما يؤكد التأثير السام للخلايا للسيتوكينات على بقاء الخلية. يحدد تلطيخ FDA / PI أيضا الخلايا القابلة للحياة والميتة في الجزر البشرية ، مما يوفر تقييما نوعيا سريعا لقابلية إعداد الجزر البشرية7. وبالتالي ، فإن طريقة التلوين هذه موثوقة لتقييم بقاء الخلية في الحالات الالتهابية. تعزز هذه النتيجة أيضا دور السيتوكينات في الفيزيولوجيا المرضية لمرض السكري ، حيث يكون التعرض لفترات طويلة للسيتوكين ضارا بوظيفة الخلية β والبقاءعلى قيد الحياة 5،19.

قدمت YOPRO-1 / البقع النووية والبقع النووية Annexin-V / رؤى إضافية حول موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكينات. أظهرت الجزر المعالجة بالسيتوكين زيادة في التألق الأخضر مما يدل على الخلايا الميتة المرتبطة بالخلايا المبرمجة. وأكد المرفق الخامس أيضا وجود خلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة والمتقدمة. معا ، تميز تقنيات التلوين هذه بشكل فعال موت الخلايا المبرمج في الخلايا β ، مما يثبت صحة موت الخلايا المبرمج كآلية أساسية لموت الخلايا الجزرية عند تعرضها للسيتوكينات المؤيدةللالتهابات 3.

يتم استكشاف مثبطات بروتين كيناز التي يمكن أن تعطل مسارات نقل إشارة موت الخلايا المبرمج ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة والمضادات ضد تصرفات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، كعلاجات واعدة يمكن أن تمنع موت الخلايا المبرمج للخلايا β5،20،21. تستخدم هذه الأنشطة البحثية الفحص المجهري القائم على التألق لتقييم التدخلات المحتملة للتخفيف من موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكينات ، مع التركيز على الحفاظ على وظيفة الخلايا β في نماذج مرض السكري. من خلال دمج تلطيخ المؤشر الانتقائي Zn2 + ، يتيح هذا النهج التصور الانتقائي للخلايا β المنتجة للأنسولين من خلال ارتباط الزنك ، مما يوفر رؤية مستهدفة لتأثيرات السيتوكين على مجموعات الخلايا β داخل الجزر وتعزيز خصوصية التحليل16. ميز هذا النهج الخلايا β عن الخلايا الجزرية الأخرى وكشف عن تدمير كبير للخلايا β ، مع ما يقرب من 63٪ من الخلايا β موت بعد التعرض للسيتوكين في دراستنا. هذه الخصوصية ضرورية لتقييم الحفاظ على الخلايا β وتسلط الضوء على الحاجة إلى استراتيجيات الحماية في إدارة مرض السكري.

تؤكد هذه النتائج على تعدد استخدامات FDA / PI و YOPRO-1 / الصبغة النووية و Zn2+ المؤشر الانتقائي / صبغة نووية / تلطيخ PI في تقييم موت الجزر. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في اختيار المجموعة المناسبة من مجسات الفلورسنت لتقليل التداخل الطيفي في جمع البيانات. يوضح الجدول 1 جميع مجسات الفلورسنت الموضحة في هذا البروتوكول ، جنبا إلى جنب مع الحد الأقصى للإثارة والانبعاث وحالة الخلية (الحية / الميتة / موت الخلايا المبرمج) التي تشير إليها كل بقعة. قد تكون هناك حاجة إلى تحسين مرشحات الإثارة والانبعاث لتقليل التداخل الطيفي بين الأصباغ لتحديد الخلايا الحية أو الميتة أو الخلايا المبرمج بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، تنخفض صلاحية الجزر المعزولة بسرعة بمرور الوقت ، للحصول على أفضل النتائج في تحليل تأثيرات المركبات على جدوى الجزر ، يجب إجراء التجارب في غضون 72 ساعة بعد العزل. من خلال توفير بيانات دقيقة وقابلة للتكرار حول بقاء الخلية ، وموت الخلايا المبرمج ، والموت الخاص بالخلايا β ، توضح هذه الدراسة إمكانات هذه التقنيات في تطوير التدخلات العلاجية التي تهدف إلى تقليل سمية السيتوكين والحفاظ على وظيفة الخلايا β في مرض السكري. استخدمت الدراسات المنشورة من مختبرنا هذا النهج لتوفير بيانات كمية حول بقاء الخلايا β والحماية من موت الخلايا المبرمج في وجود مثبط جزيء صغير5،21.

أحد قيود هذا البروتوكول هو أن تلطيخ موت الخلايا المبرمج لخلايا بيتا لا يمكن تحقيقه إلا باستخدام علامات إضافية خاصة بخلايا بيتا لا تتداخل طيفيا مع أصباغ YOPRO-1 أو Annexin-V. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا اعتماد خطوط فأر مراسل أكثر قوة وإن كانت باهظة الثمن ، مثل الفئران مراسلة الأنسولين ذات المحفزات الخاصة بموت الخلايا المبرمج. يجمع هذا النموذج بالضربة القاضية بين Cre-recombinase الذي يحركه محفز الأنسولين مع نظام مراسل مثل tdTomato و GFP لتصور موت الخلايا المبرمج في خلايا بيتا البنكرياس التي تعبر عن الأنسولين. قيد آخر هو أن العد اليدوي لصور الجزيرة يستغرق وقتا طويلا وله إنتاجية منخفضة. بينما تبذل الجهود في مختبرنا لتطوير مكون إضافي مناسب ل ImageJ لتوفير القياس الكمي الآلي للخلايا الحية / الميتة ، تعمل المكونات الإضافية المتاحة حاليا لعد الخلايا باستخدام ImageJ (NIH) أو غيرها من برامج عد الخلايا المتاحة تجاريا بشكل أفضل مع الأصباغ مثل البقع النووية و PI ، والتي تحدد نوى الخلية ولها حدود يمكن تمييزها بين الخلايا الفردية. تتميز الأصباغ مثل FDA و AnnexinV بمزيد من الإجهاد المتناثر ، مما يجعل من الصعب تحديد الحدود بين الخلايا عند العد باستخدام البرامج الآلية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

قدمت المنح التالية أموالا لهذا العمل: جائزة NIDDK R01 DK137221 ، JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B إلى NLF ، و ADA 7-20-JDF-020 إلى N.L.F. يود المؤلفون أن يشعروا بتقديرهم للدعم المقدم من مركز أبحاث مرض السكري في حرم جامعة كولورادو أنشوتز P30-DK116073 والمرافق الأساسية المرتبطة بها المستخدمة لدعم هذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
14 mm glass-bottom Petri dishMattekP35G-1.5-14-C
1640 RPMICorning10-041-CV
35 mm Petri dishCelltreat229638
7 mm glass-bottom Petri dishMattekP35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488Thermo Fisher (Invitrogen)A13201ex488/em515
Calcium Chloride DihydrateFisherC79
Dimethyl Sulfoxide AnhydrousSigma276855
Fetal Bovine SerumThermo Fisher (Gibco)26140079
Flouzin-3, AMThermo Fisher (Invitrogen)F24195ex488/em516
Fluorescein Diacetate (FDA)Thermo Fisher (Invitrogen)F1303ex488/em520
HEPESSigma54457
Image processing softwareNIHImageJ
Magnesium ChlorideSigmaM8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)Thermo Fisher (Invitrogen)R37605ex360/em460
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher (Gibco)15-140-122 
Phosphate-buffered Saline TabletsFisherBP2944-100
Potassium Chloride, GranularMacron6858-04
Propidium iodideThermo Fisher (Invitrogen)P1304MPex535/em620
Protein Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D Systems485-MI-100/CF
Recombinant Mouse IL-1 beta/IL-1F2 R&D Systems401-ML-100/CF
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) ProteinR&D Systems410-MT-100/CF
Sodium Chloride, CrystalMacron7581-12
Stellaris Confocal microcope with spectral detectorsLeicaDMI-8 40x water immersion objective.
Yopro-1 IodideThermo Fisher (Invitrogen)Y3603ex488/em509

References

  1. Da Silva Xavier, G. The cells of the islets of Langerhans. J Clinical medicine. 7 (3), 54 (2018).
  2. Grunnet, L. G., et al. Proinflammatory cytokines activate the intrinsic apoptotic pathway in β-cells. Diabetes. 58 (8), 1807-1815 (2009).
  3. Delaney, C. A., Pavlovic, D., Hoorens, A., Pipeleers, D. G., Eizirik, D. c. L. Cytokines induce deoxyribonucleic acid strand breaks and apoptosis in human pancreatic islet cells. Endocrinology. 138 (6), 2610-2614 (1997).
  4. Farnsworth, N. L., et al. Modulation of gap junction coupling within the islet of langerhans during the development of type 1 diabetes. Front Physiol. 13, 913611 (2022).
  5. Collins, J., et al. Cleavage of protein kinase c δ by caspase-3 mediates proinflammatory cytokine-induced apoptosis in pancreatic islets. J Biol Chem. 300 (9), 107611 (2024).
  6. Farnsworth, N. L., Walter, R., Piscopio, R. A., Schleicher, W. E., Benninger, R. K. Exendin-4 overcomes cytokine-induced decreases in gap junction coupling via protein kinase A and Epac2 in mouse and human islets. J Physiol. 597 (2), 431-447 (2019).
  7. NIH CIT Consortium Chemistry Manufacturing Controls Monitoring Committee. Purified human pancreatic islet-viability estimation of islet using fluorescent dyes (FDA/PI): Standard operating procedure of the NIH clinical islet transplantation consortium. CellR4 Repair Replace Regen Reprogram. 3 (1), e1378 (2015).
  8. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Meth. 184 (1), 39-51 (1995).
  9. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. J Vis Exp. (50), e2597 (2011).
  10. Emdin, S., Dodson, G., Cutfield, J., Cutfield, S. Role of zinc in insulin biosynthesis: some possible zinc-insulin interactions in the pancreatic B-cell. Diabetologia. 19, 174-182 (1980).
  11. ZA, L. A simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation. 45 (4), 827-830 (1988).
  12. Zalewski, P. D., et al. Video image analysis of labile zinc in viable pancreatic islet cells using a specific fluorescent probe for zinc. J Histochem Cytochem. 42 (7), 877-884 (1994).
  13. Jindal, R. M., Taylor, R. P., Gray, D. W., Esmeraldo, R., Morris, P. J. A new method for quantification of islets by measurement of zinc content. Diabetes. 41 (9), 1056-1062 (1992).
  14. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry A. 73 (7), 615-625 (2008).
  15. Lukowiak, B., et al. Identification and purification of functional human β-cells by a new specific zinc-fluorescent probe. J Histochem Cytochem. 49 (4), 519-527 (2001).
  16. Gee, K. R., Zhou, Z. L., Qian, W. J., Kennedy, R. Detection and imaging of zinc secretion from pancreatic β-cells using a new fluorescent zinc indicator. J Am Chem Soc. 124 (5), 776-778 (2002).
  17. Gyulkhandanyan, A. V., Lee, S. C., Bikopoulos, G., Dai, F., Wheeler, M. B. The Zn2+-transporting pathways in pancreatic β-cells: a role for the L-type voltage-gated Ca2+ channel. J Biol Chem. 281 (14), 9361-9372 (2006).
  18. Chen, J., et al. A murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals. J Vis Exp. (136), e57327 (2018).
  19. Farnsworth, N. L., Walter, R. L., Hemmati, A., Westacott, M. J., Benninger, R. K. Low level pro-inflammatory cytokines decrease connexin36 gap junction coupling in mouse and human islets through nitric oxide-mediated protein kinase Cδ. J Biol Chem. 291 (7), 3184-3196 (2016).
  20. Dalle, S., Abderrahmani, A., Renard, E. Pharmacological inhibitors of β-cell dysfunction and death as therapeutics for diabetes. Front Endocrinol. 14, 1076343 (2023).
  21. Collins, J., et al. Peptide-coated polycaprolactone-Benzalkonium chloride nanocapsules for targeted drug delivery to the pancreatic β-Cell. ACS Appl Bio Mater. 7 (10), 6451-6466 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved