Isolierte Behandlung von Pankreasinseln und Apoptosemessung

In dieser Studie werden mehrfach gefärbte fluoreszenzbasierte Marker für Zelltod und Apoptose in Kombination mit konfokaler Mikroskopie verwendet, um die Zytokin-induzierte Apoptose und den β-zellspezifischen Tod in Pankreasinseln zu bewerten. Sie zeigt räumliche und zeitliche Veränderungen des Zelltods und der Apoptose als Reaktion auf extrazelluläre Reize.

Diese Studie untersucht die Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen auf Pankreasinseln, insbesondere auf insulinproduzierende β-Zellen, unter Verwendung einer Kombination aus Fluoreszenzfärbetechniken und konfokaler Mikroskopie, um die Zellviabilität, Apoptose und den β-zellspezifischen Tod zu beurteilen. Isolierte Mausinseln wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen eines Zytokincocktails behandelt, einschließlich TNF-α, IL-1β und IFN-γ, um die immunvermittelte Apoptose während der Entwicklung von Typ-1-Diabetes nachzuahmen. Die Lebensfähigkeit von Inselzellen wurde mit der FDA/PI-Doppelfärbung bewertet, bei der die FDA-Umwandlung in Fluorescein lebensfähige Zellen und PI-markierte membrankompromittierte Zellen anzeigte. YOPRO-1 und die Kernfärbung lieferten zusätzliche Daten zur Apoptose, wobei Annexin-V frühe apoptotische Zellen bestätigte. Die quantitative Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der Apoptose- und Zelltodraten bei mit Zytokinen behandelten Inseln. Um die Auswirkungen auf β-Zellen spezifisch zu bewerten, wurde die selektive^Zn2+ -Indikatorfärbung verwendet, um insulinproduzierende Zellen durch die Zinkassoziation in Insulingranulaten zu markieren, wobei ein erheblicher β-Zell-Verlust nach Behandlung von Inselzellen mit proinflammatorischen Zytokinen für 24 Stunden festgestellt wurde. Diese Multifärbeprotokolle erfassen und quantifizieren effektiv das Ausmaß der Zytokin-induzierten Schädigung in Inselzellen und können zur Bewertung von Therapeutika verwendet werden, die entwickelt wurden, um die β-Zell-Apoptose bei frühem Typ-1-Diabetes zu verhindern.

Die Pankreasinseln, auch bekannt als Langerhans-Inseln, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die sich in der Bauchspeicheldrüse befinden. Die insulinproduzierenden β-Zellen sind der am häufigsten vorkommende und funktionell bedeutendste Bestandteil der Pankreasinseln. Diese β-Zellen sezernieren Insulin, ein Hormon, das eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase spielt¹. Bei Typ-1-Diabetes (T1D) greift das Immunsystem auf die Inseln der Bauchspeicheldrüse ab und infiltriert sie, wodurch insulinproduzierende β-Zellen zerstört werden. Dieser Autoimmunangriff wird hauptsächlich durch proinflammatorische Zytokine vermittelt, darunter Interleukin-1β (IL-1β), Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Interferon-gamma (IFN-γ)². Diese Zytokine lösen eine Kaskade von Signalereignissen innerhalb β Zellen aus, die schließlich die Apoptose^{auslösen 3}. Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein streng regulierter Prozess, der die Aktivierung von Caspasen, die DNA-Fragmentierung und den zellulären Zerfall umfasst. Es trägt zum allmählichen Verlust der β-Zellmasse und -Funktion während des Beginns von T1D³ bei.

Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die β-Zell-Apoptose antreiben, ist entscheidend für die Identifizierung von Strategien zur Verhinderung oder Abschwächung der β-Zell-Zerstörung bei T1D. Um dies zu erreichen, dienen isolierte Pankreasinseln aus experimentellen Modellen oder menschlichen Leichen als robustes und gut etabliertes Modellsystem für die Untersuchung der β-Zell-Pathologie ^2,3. Durch die Behandlung dieser isolierten Inselzellen mit proinflammatorischen Zytokinen können die Forscher die Umgebung replizieren, die für frühes T1D charakteristisch ist, was eine detaillierte Untersuchung der β-Zell-Dysfunktion und des Todes in vitro ermöglicht ^4,5. Diese Experimente liefern wichtige Einblicke in die Verwundbarkeit und das Überleben von β-Zellen unter krankheitsassoziierten Bedingungen und dienen auch als Plattform für die Erprobung therapeutischer Interventionen, die darauf abzielen, β-Zellen vor Zytokin-induzierter Apoptose zu schützen oder zu retten. Durch die Verwendung dieses In-vitro-Systems können wir effektiv analysieren, wie Inselzellen verschiedener Arten auf verschiedene Bedingungen reagieren, was zu einem besseren Verständnis der funktionellen und apoptotischen Variationen zwischen den Arten führt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Maus- und menschliche Inselzellen, die 24 Stunden lang mit einem Cocktail (1x = 10 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ) von Maus- bzw. humanen Zytokinen behandelt wurden, zu einem signifikanten Tod von Inselzellen führten ^4,5,6. Die Lebensfähigkeit der Inselzellen wurde durch Färbung der mit Zytokinen behandelten Zellen mit Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumiodid (PI) ^{bestätigt5,6}. Weltweit wird die Lebensfähigkeit der Inselzellen unter Verwendung der Standardtechnik zum Ausschluss von Desoxyribonukleinsäure (DNA)-bindenden Farbstoffen mit FDA und PI⁷ bewertet. Fluoreszierende Färbungen oder farbstoffkonjugierte Substrate beurteilen die Lebensfähigkeit der Zellen auf der Grundlage der Membranintegrität und Permeabilität. FDA, ein zelldurchlässiger Farbstoff, wird von lebenden Zellen in grüne Fluoreszenz (Fluorescein) umgewandelt. Im Gegensatz dazu färbt PI, ein zellundurchlässiger Farbstoff, nur die Zellkerne toter Zellen mit kompromittierten Membranen⁷. Die Zellen werden dann durch zweifarbige Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop analysiert, wobei grüne und rote Fluoreszenzen lebensfähige bzw. tote Zellen markieren.

Die Einschränkung des FDA/PI-Färbeprotokolls besteht darin, dass PI nur in Zellen eindringt, die ihre Membranselektivität verloren haben, was bedeutet, dass es frühe apoptotische Zellen nicht unterscheiden kann. Darüber hinaus kann diese Methode nicht zwischen Zelluntergruppen unterscheiden, was sie für die selektive Beurteilung der Lebensfähigkeit β Zellen ungeeignet macht. Das Annexin V/PI-Protokoll wird häufig für die Untersuchung apoptotischer Zellen verwendet, und das Protokoll wurde modifiziert, um seine Genauigkeit zu verbessern⁸. In den frühen Stadien der Apoptose kommt es zur Translokation von Phosphatidylserin von der inneren in die äußere Schicht der Plasmamembran. Annexin V, ein calciumabhängiges Protein, bindet mit hoher Affinität an dieses exponierte Phosphatidylserin. Die Färbung mit PI wird zusammen mit Annexin-V durchgeführt, um apoptotische Zellen (nur Annexin V-positiv) von nekrotischen Zellen (positiv für Annexin-V und PI) zu unterscheiden, da nekrotische Zellen aufgrund einer beeinträchtigten Membranintegrität auch Phosphatidylserin aufweisen⁹. Andere Farbstoffe, wie z. B. YOPRO-1, werden ebenfalls verwendet, um die Apoptose von Inselzellen zu quantifizieren. Die Zellmembran lebensfähiger Zellen ist für YOPRO-1 undurchlässig, im Gegensatz zu Annexin-V, das lebende Zellen, die sich einer Apoptose unterziehen, nicht quantifizieren kann.

Um den β-Zelltod der Bauchspeicheldrüse zu beurteilen, werden spezifische Farbstoffe benötigt, die nur auf die insulinproduzierenden Zellen abzielen. Eine Besonderheit der Pankreas-β-Zellen ist, dass ein Teil des intrazellulären Zn²⁺ in Vesikeln als Zn²⁺-Insulin-Komplex (Verhältnis 2:1) gespeichert wird10. Freies Zn²⁺ existiert auch im extragranularen Raum um die β-Zellen als Reservoire. Freies Zn²⁺ und Zn²⁺, die lose an Insulin gebunden sind, können mit Hilfe von zinkbindenden Farbstoffen sichtbar gemacht werden. Dithizon, ein zinkbindender Farbstoff, wird häufig zur Beurteilung der Reinheit von Inselzellen verwendet, kann jedoch nicht mit Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert werden, die zur Bewertung der Lebensfähigkeit und Funktion β-Zellen verwendet werden¹¹. UV-Sonden wie TSQ und Zinquin, die hochselektiv gegenüber Zn²⁺ sind, wurden entwickelt, um β-Zellen durch Bildgebung und Messung von freiem intrazellulärem Zn²⁺ zu quantifizieren^{; 12,13}. Ihre Verwendung ist jedoch durch eine schlechte Löslichkeit, eine ungleichmäßige Zellbeladung, einen UV-Anregungsbedarf und eine Kompartimentierung in saure Vesikel begrenzt¹⁴. Fluoreszenzsonden im sichtbaren Wellenlängenbereich, wie z. B. Newport-Grün und Zn²⁺-Selektivindikator, wurden ebenfalls entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, und werden heute häufig zum Nachweis von β-Zellen in isolierten menschlichen Inselzellen verwendet^15,16. FluoZin-3 (selektiver^Zn2+-Indikator) hat eine höhere^Zn2+-Affinität und eine überlegene Quantenausbeute als Newport Green und hat sich bei der Bildgebung von Zn²⁺, das zusammen mit Insulin freigesetzt wird, in isolierten Inselzellen als wirksam erwiesen^14,17.

Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen wie FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 und Zn²⁺ ermöglicht die Messung und Unterscheidung zwischen lebensfähigen, apoptotischen und vollständig toten Zellen. Die Kombination kompatibler und hochselektiver Sonden bietet auch eine gezielte Methode zur Bewertung und Quantifizierung der β-Zell-Viabilität und Apoptose, was für das Verständnis und die Eindämmung der β-Zell-Zerstörung in der Diabetesforschung und -entwicklung von entscheidender Bedeutung ist.

Alle Versuche mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado Denver genehmigt (Protokolle 000929). C57Bl/6-Mäuse, die für dieses Experiment verwendet wurden, wurden vom Jackson Laboratory gekauft und in einer temperaturkontrollierten Einrichtung in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht. Die isolierten Mausinseln wurden unter Verwendung des zuvor beschriebenen Kollagenase-Verdauungsprotokolls gewonnen ^5,18.

1. Vorbereitung der Lösungen und Nährmedien

HINWEIS: Nährmedien, Zytokinbestände und andere Reagenzien sollten unter sterilen Bedingungen hergestellt werden.

1. Bereiten Sie ein Inselkulturmedium vor, indem Sie 10 % fötales Rinderserum (FBS), 10.000 U/ml Penicillin und 10.000 μg/ml Streptomycin zu 500 ml 1640 RPMI Medium hinzufügen.
2. Bereiten Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 vor. Bereiten Sie eine 1000-fache Stammlösung aus Maus-Zytokin-Cocktail, 10 μg/ml TNF-α 10 μg/ml, 5 μg/ml IL-1β und 100 μg/ml IFN-γ in sterilem PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) vor und lagern Sie die Lösung in 10 μl Aliquoten bei -20 °C.
3. Bereiten Sie eine 46 μM (50x) FDA-Stammlösung in Aceton vor und lagern Sie sie in 1 mL Aliquots bei -20 °C. Bereiten Sie eine 1,434 mM (50x) PI-Stammlösung in PBS vor und lagern Sie sie in 1 mL Aliquots bei 4 °C.
4. Bereiten Sie 500 mL Bicarbonat-modifizierten Krebs-Henseleit HEPES (BMHH)-Puffer mit 125 mM NaCl, 5,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂ und 10 mM HEPES in 500 mL dH₂O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
5. Bereiten Sie 100 mL Annexin-V-Bindungspuffer mit 10 mM HEPES, 140 mM NaCl und 2,5 mM CaCl₂ in 100 mL dH₂O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
6. 1 mM Zn²⁺ selektive Indikator-Stammlösung in DMSO herstellen und in 10 μl Aliquoten bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Fluoreszierende Farbstoffe sind lichtempfindlich, daher müssen Lagerung und Inkubation im Dunkeln erfolgen.

2. Behandlung isolierter Inselzellen mit Zytokinen

1. Isolieren Sie Mausinseln mit einer 10-μl-Mikropipette in das Kulturmedium und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ , um sich vor der Behandlung mit Zytokinen vom Isolationsstress zu erholen.
2. Geben Sie 2 ml des sterilisierten Inselkulturmediums in 35 mm große, nicht mit Gewebekulturen behandelte Petrischalen und markieren Sie sie entsprechend, um mit Zytokinen behandelte und unbehandelte Schalen ohne Zytokine zu unterscheiden.
3. Bei mit Zytokinen behandelten Schalen entfernen Sie 6 μl Kulturmedium und ersetzen es durch 2 μl jedes Zytokins aus der Stammlösung, um eine endgültige relative Zytokinkonzentration von 10 ng/ml, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ (1x RCC) zu erhalten.
   HINWEIS: Ein niedrigerer RCC von 0,5x und 0,1x kann durch Verdünnen von Stammlösungen mit sterilem PBS mit 0,1 % BSA im Verhältnis 1:1 bzw. 1:9 hergestellt werden.
4. Um 12 h-24 h nach der Isolierung werden 10-20 Inselzellen mit einer Mikropipette unter einem Lichtmikroskop entnommen und in die Schalen überführt und in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5 % CO₂ -Inkubator für 24 h inkubiert.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach den spezifischen Versuchszielen variieren.

3. Messung der Lebensfähigkeit von Inselzellen mit FDA/PI

1. Geben Sie jeweils 20 μl FDA- und PI-Stammlösungen zu 960 μl BMHH-Puffer mit 0,1 % BSA, um eine Endkonzentration von 0,46 μM bzw. 14,34 μM der Fluoreszenzfarbstoffe zu erhalten.
2. Aliquotieren Sie 100 μl der Färbelösung in eine 7 mm große Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
3. 24 Stunden nach der Inkubation mit Zytokinen werden mindestens 6 Inselzellen aus jeder Behandlung vorsichtig in die Petrischale mit Glasboden überführt. 5 - 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren (mit Folie abdecken).
4. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach der FDA/PI-Färbung auf.
5. Verwenden Sie Anregungslaser bei 488 nm und 514 nm, um die Fluoreszenzemissionen für FDA (520 nm) bzw. PI (620 nm) zu detektieren.
6. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
7. Zählen Sie lebende grüne (FDA-positive) und tote rote (PI-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den prozentualen Anteil des Zelltods wie folgt:
   Prozentsatz des Inselsterbens = Anzahl der toten Zellen/ (Anzahl der toten Zellen + Anzahl der lebenden Zellen) x 100%

4. Apoptose-Messung mittels Färbung

1. Geben Sie 8 μl YOPRO-1 (1 mM Lösung) zu 992 μl BMHH-Bildgebungspuffer für eine Endkonzentration von 0,8 μM.
2. Aliquotieren Sie 500 μl der Färbelösung in eine 14 mm große Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
3. 24 h nach der Inkubation mit Zytokinen mindestens 6 Inselzellen aus jeder Behandlung vorsichtig in die Petrischale mit Glasboden überführen und 1 h bei 37 °C im Dunkeln inkubieren (mit Folie abdecken).
4. Nach 20 Minuten Inkubation geben Sie einen Tropfen NucBlue (Kernfärbung, 20 μl) in jede Petrischale mit Glasboden und setzen Sie die Inkubation fort. Die Gesamtinkubationszeit beträgt 1 h für YOPRO-1 und 40 min für nukleare Färbung.
5. Nach 1 Stunde Inkubation werden die Inselzellen in einen frischen BMHH-Bildgebungspuffer mit 0,1 % BSA (100 μl) in einer 7-mm-Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, übertragen.
6. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie Anregungslaser bei 405 nm und 488 nm, um die Fluoreszenzemissionen von Kernfärbung (460 nm) bzw. YOPRO-1 (509 nm) zu detektieren.
7. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
8. Zählen Sie lebende blaue (nukleäre Färbung positiv) und apoptotische grüne (YOPRO-1-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den Prozentsatz der apoptotischen Inselzellen wie folgt:
   Prozentsatz der apoptotischen Inselzellen = Anzahl der apoptotischen Zellen / (Anzahl der apoptotischen Zellen + Anzahl der lebenden Zellen) x 100%

5. Apoptose-Messung mit Annexin V/ nuklearer Färbung

1. Geben Sie 2 Tropfen Kernfärbung (40 μl) zu 1 ml Annexin-Bindungspuffer. Aliquotieren Sie 100 μl der Lösung in eine 7 mm Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
2. 24 Stunden nach der Inkubation mit Zytokinen spülen Sie vorsichtig aus, indem Sie mindestens 6 Inselzellen aus jeder PBS-Behandlung 3x auf und ab pipettieren, indem Sie mit der 10-μl-Mikropipette dreimal auf und ab pipettieren. Die Inselzellen mit der Kernfleckenlösung in die Petrischale mit Glasboden geben und 40 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren (mit Folie abdecken).
3. Nach 25 Minuten Inkubation 5 μl Annexin V Alexa Flour 488 Konjugat in jede Petrischale mit Glasboden geben und die Inkubation fortsetzen. Die Gesamtinkubationszeit beträgt 40 Minuten für den nuklearen Farbstoff und 15 Minuten für Annexin V.
4. Nach 40 Minuten Inkubation werden die Inselzellen in einen frischen BMHH-Bildgebungspuffer (ohne Annexin V oder nukleare Färbung) in einer 7-mm-Petrischale mit Glasboden überführt.
5. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie Anregungslaser bei 405 nm und 488 nm, um die Fluoreszenzemissionen von Kernfärbung (460 nm) bzw. Annexin-V-Konjugat (515 nm) zu detektieren.
6. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
7. Zählen Sie lebende blaue (nukleäre Färbung positiv) und apoptotische grüne (Annexin V-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den Prozentsatz der apoptotischen Inselzellen wie folgt:
   Prozentsatz der apoptotischen Zellen = Anzahl der apoptotischen Zellen / (Anzahl der apoptotischen Zellen + Anzahl der lebenden Zellen) x 100%

6. Messung des β-Zelltods mit selektivem Zn²⁺ -Indikator / Kernfärbung / PI

1. Geben Sie 2 μl Zn²⁺ selektiver indicatorAM-Stammlösung zu 998 μl BMHH-Bildgebungspuffer, um eine Endkonzentration von 0,2 μM zu erreichen. Aliquotieren Sie 500 μl der Färbelösung in eine 14-mm-Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
2. 24 Stunden nach der Inkubation mit Zytokinen werden mindestens 6 Inselzellen aus jeder Behandlung vorsichtig in die Petrischale mit Glasboden überführt. Inkubieren Sie 1 h bei 37 °C im Dunkeln mit dem selektiven Indikator Zn²⁺ AM-Lösung (Abdeckung mit Folie).
3. Nach 20 Minuten Inkubation geben Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen Tropfen Kernfleck (20 μl) in jede Petrischale mit Glasboden und setzen Sie die Inkubation fort. Die Gesamtinkubationszeit beträgt 1 h für den selektiven Zn²⁺ -Indikator und 40 min für die nukleare Färbung.
4. Nach 1 Stunde Inkubation werden die Inselzellen in einen frischen BMHH-Bildgebungspuffer mit 0,1 % BSA (100 μl) in einer 7-mm-Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, übertragen. Fügen Sie 10 Minuten lang 2 μl PI-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 20 μg/ml zu erreichen.
5. Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach der PI-Färbung mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie Anregungslaser bei 405 nm, 488 nm und 514 nm, um die Fluoreszenzemissionen von Kernfärbung (460 nm),^{Zn 2+} selektivem Indikator (516 nm) bzw. PI (620 nm) zu detektieren.
6. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
7. Zählen Sie lebende blaue (nukleare Färbung positiv), Zinkgrün (Zn²⁺ selektiver Indikator-positiv) und tote rote (PI-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den prozentualen Anteil des β-Zelltods wie folgt:
   Prozentsatz des β-Zelltods = Anzahl der Zink- und PI-positiven Zellen / (Anzahl der toten + lebenden Inselzellen) x 100%
   oder
   Prozentsatz des β-Zelltods = Anzahl der Zink- und PI-positiven Zellen / (Anzahl der Zink-positiven Zellen) x 100%

Die duale Färbung mit FDA und PI wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit von Inselzellen zu beurteilen, die mit Zytokinen behandelt wurden. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung (n = 3) durchgeführt, und die Daten wurden aus mehreren Z-Stapel-Bildern mit einem Abstand von 10 μm generiert, wobei jedes Replikat durchschnittliche Daten von 5 oder 6 Inselzellen enthielt, um die Reproduzierbarkeit und den statistischen Vergleich zwischen den behandelten und unbehandelten Inselzellen zu gewährleisten. Abbildung 1A zeigt gesunde Inselzellen aus der unbehandelten Kontrollgruppe, die aufgrund der Umwandlung von FDA in Fluorescein durch enzymatisch aktive Zellen eine ausgeprägte grüne Fluoreszenz aufweisen. Das Fehlen oder das minimale Vorhandensein von roter Fluoreszenz bestätigt die Lebensfähigkeit dieser Inseln, was auf intakte Zellmembranen hinweist. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 1B eine signifikante rote Fluoreszenz in mit Zytokinen behandelten Inseln, die tote oder sterbende Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität markiert. Dieser Anstieg der roten Fluoreszenz unterstreicht die PI-Färbung von Zellkernen in nicht lebensfähigen Zellen mit Membranaufschluss. Der Einfluss der Zytokinkonzentration auf die Lebensfähigkeit der Inselzellen ist in Abbildung 1C dargestellt. Die quantitativen Daten zeigen eine positive Korrelation zwischen der Sterblichkeitsrate der Inselzellen und steigenden Zytokinkonzentrationen (0,1x-1x RCC). Diese dosisabhängige Reaktion unterstreicht die zytotoxische Wirkung von Zytokinen auf Inselzellen, wie die erhöhte rote Fluoreszenz in PI-gefärbten Zellen mit höherer Zytokinexposition zeigt.

Zur Messung der Zytokin-induzierten Apoptose wurden unbehandelte und mit Zytokinen behandelte Inselzellen mit YOPRO-1 gefärbt und zur Quantifizierung apoptotischer und lebensfähiger Zellen nukleär gefärbt. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Bild einer nicht-apoptotischen Zelle aus der unbehandelten Kontrollschale, in der eine starke blaue Fluoreszenz im Zellkern beobachtet wird, ohne grüne Fluoreszenz, was auf eine lebensfähige, nicht-apoptotische Zelle hinweist. Abbildung 2B zeigt mit Zytokinen behandelte Inselzellen mit deutlicher grüner Fluoreszenz von YOPRO-1 neben blauer Kernfärbung. Diese duale Fluoreszenz bestätigt die Apoptose, da YOPRO-1 gestresste Zellmembranen durchdringt. Die Quantifizierung ergab, dass mehr als 30% der Pankreasinseln innerhalb von 24 Stunden nach der Zytokinexposition Apoptose zeigten (Abbildung 2C). Die Annexin-V-Färbung wurde durchgeführt, um die Apoptose weiter zu validieren, und zeigte, dass etwa 40 % der Inselzellen positiv auf Annexin-V gefärbt wurden, wobei sowohl frühe apoptotische Zellen als auch solche, die die Apoptose durchlaufen, erfasst wurden (Abbildung 2D-F).

Um die Pankreas-β-Zell-Todesrate als Reaktion auf Zytokine zu beurteilen, färbten wir schließlich die unbehandelten und mit Zytokinen behandelten Inselzellen mit dem selektiven Zn²⁺-Indikator, der Kernfärbung und PI (Abbildung 3A,B). Unsere Ergebnisse zeigten ein diskretes punktuelles Färbemuster mit dem selektiven Zn²⁺-Indikator, was darauf hindeutet, dass der selektive^Zn2+-Indikator an freies und locker gebundenes Zink gebunden ist, das mit Insulin in sekretorischen Granulaten assoziiert ist. Darüber hinaus ermöglicht die Dreifachfärbung mit diesen Farbstoffen die Kombination unterschiedlicher Fluoreszenzkanäle (blau für die Kernfärbung, rot für PI und grün für den selektiven Zn²⁺-Indikator), was eine präzise, gemultiplexte Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop ermöglicht, wodurch nicht nur lebende von toten Zellen, sondern auch der spezifische Tod der insulinproduzierenden β-Zellen leicht unterschieden werden kann. Es liefert auch Daten für die deskriptive Quantifizierung des β-Zelltods als Bruchteil der Gesamtzahl der β-Zellen, toten Zellen oder Inselzellen. Abbildung 3C zeigt, dass Zytokine eine stärkere Zerstörung der β-Zellen verursachen und etwa 63% der insulinproduzierenden Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Co-Kultur mit gesunden Inselzellen zerstören.

Abbildung 1: Doppelte Färbung von Inselzellen mit Fluoresceindiacetat (grün) und Propidiumiodid (rot) zur Beurteilung des Zytokin-vermittelten Todes. (A) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von unbehandelten Mausinseln und (B) mit Zytokinen behandelten Inseln, die mit Fluoresceindiacetat (grün) und Propidiumiodid (rot) gefärbt wurden. (C) Prozentuale Lebensfähigkeit von Mausinseln, die mit unterschiedlichen relativen Zytokinkonzentrationen (0,1x rote Quadrate, 0,5x grüne Dreiecke und 1x RCC blaue Dreiecke) behandelt wurden, und unbehandelten Inselzellen (schwarze Kreise). 1x RCC = 10 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ. Maßstabsleiste = 10 μm. Jeder Datenpunkt ist eine kleine Insel. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05 und ***p < 0,001 weisen auf eine statistische Signifikanz basierend auf der ANOVA mit der Post-hoc-Analyse nach Tukey hin (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Färbung von Inselzellen mit YOPRO-1 und Annexin-V als Marker für Zytokin-induzierte Apoptose. (A) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von unbehandelten Mausinseln und (B) mit Zytokinen behandelten Inseln, die mit Kernfärbung (blau) und YOPRO-1 (grün) gefärbt wurden. Maßstabsbalken = 10 μm. (C) Prozentsatz der YOPRO-1-positiven Zellen in mit Zytokinen behandelten Inselzellen (1x RCC, blaue Dreiecke) und unbehandelten Inselzellen (schwarze Kreise). (D) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von unbehandelten Mausinseln und (E) mit Zytokinen behandelten Inseln, die mit Kernfärbung (blau) und Annexin V (grün) gefärbt wurden. (F) Prozentsatz der Annexin-V-positiven Zellen in mit Zytokinen behandelten Inselzellen (1x RCC, blaue Dreiecke) und unbehandelten Inselzellen (schwarze Kreise). 1x RCC = 10 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ. Maßstabsleiste = 10 μm. Jeder Datenpunkt ist eine kleine Insel. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. ****p<0,0001 weist auf eine statistische Signifikanz hin, die auf dem unabhängigen Welch-t-Test (n = 3) basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Dreifache Färbung von Inselzellen mit Kernfärbung (blau), Zn²⁺ selektivem Indikator (grün) und Propidiumiodid (rot) zur Beurteilung des spezifischen Pankreas-β-Zelltods. (A) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von (A) unbehandelten Mausinseln und (B) mit Zytokinen behandelten Inselzellen in verschiedenen z-Stacks von 10 μm Abstand. (C) Prozentualer Tod von β-Zellen in mit Zytokinen behandelten Inselzellen (1x RCC). 1x RCC = 10 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ. Maßstabsbalken = 10 μm. PI+ = Gesamtzahl toter Zellen, PI+β+ = tote β-Zellen und β+ = Gesamtzahl (tote und lebende) β-Zellen. Jeder Datenpunkt ist eine kleine Insel. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. ****p<0,0001 weist auf eine statistische Signifikanz hin, die auf dem unabhängigen Welch-t-Test (n = 3) basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Liste der in diesem Protokoll verwendeten Fluoreszenzsonden, ihre Anregung/Emission und der durch positive Färbung angezeigte Zellzustand.

Diese Studie zeigt die Wirksamkeit von Mehrfachfärbemethoden mit fluoreszierenden Farbstoffen und konfokaler Mikroskopie bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit von Inselzellen, der Apoptose und des Überlebens von β-Zellen unter Zytokin-induziertem Stress. Die FDA/PI-Färbung zeigte eine dosisabhängige Zunahme des Zelltods bei Inselzellen, die Zytokinen ausgesetzt waren, was sich in der roten Fluoreszenz zeigt, die membrankompromittierte Zellen markierte, was die zytotoxische Wirkung von Zytokinen auf die Lebensfähigkeit der Zellen bestätigte. Die FDA/PI-Färbung identifiziert auch lebensfähige und tote Zellen in menschlichen Inselzellen und bietet eine schnelle qualitative Bewertung der Lebensfähigkeit der Präparation menschlicher Inselzellen⁷. Somit ist diese Färbemethode zuverlässig für die Beurteilung der Zellviabilität bei entzündlichen Erkrankungen. Dieses Ergebnis unterstreicht auch die Rolle von Zytokinen in der Pathophysiologie von Diabetes, wo eine längere Zytokinexposition sich nachteilig auf die β-Zell-Funktion und das Überleben auswirkt ^5,19.

Die YOPRO-1/-Kernfärbungen und Annexin-V/-Kernfärbungen lieferten zusätzliche Einblicke in die Zytokin-induzierte Apoptose. Mit Zytokinen behandelte Inselzellen zeigten eine erhöhte grüne Fluoreszenz, die auf tote Zellen hinweist, die mit apoptotischen Zellen assoziiert sind. Annexin-V bestätigte auch das Vorhandensein von frühen und fortschreitenden apoptotischen Zellen. Zusammen charakterisieren diese Färbetechniken die Apoptose in β-Zellen effektiv und validieren die Apoptose als primären Mechanismus des Zelltods von Inselzellen, wenn sie proinflammatorischen Zytokinen ausgesetzt sind³.

Proteinkinase-Inhibitoren, die apoptotische Signaltransduktionswege stören könnten, sowie Antikörper und Antagonisten gegen die Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen werden als vielversprechende Therapeutika untersucht, die die β-Zell-Apoptose verhindern könnten ^5,20,21. Diese Forschungsaktivitäten nutzen fluoreszenzbasierte Mikroskopie, um mögliche Interventionen zur Abschwächung der Zytokin-induzierten Apoptose zu evaluieren, wobei der Schwerpunkt auf der Erhaltung der β-Zell-Funktion in Diabetesmodellen liegt. Durch die weitere Einbeziehung der selektiven^Zn2+-Indikatorfärbung ermöglicht dieser Ansatz die selektive Visualisierung von insulinproduzierenden β-Zellen durch Zinkassoziation, wodurch ein gezielter Blick auf die Auswirkungen von Zytokinen auf β-Zellpopulationen innerhalb von Inselzellen ermöglicht und die Spezifität der Analyse verbessert^{wird 16}. Dieser Ansatz unterschied β-Zellen von anderen Inselzellen und zeigte eine signifikante β-Zell-Zerstörung, wobei in unserer Studie etwa 63% der β-Zellen nach Zytokin-Exposition starben. Diese Spezifität ist entscheidend für die Bewertung der β-Zell-Konservierung und unterstreicht die Notwendigkeit ihrer Schutzstrategien im Diabetesmanagement.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Vielseitigkeit der FDA/PI-, YOPRO-1/-Kernfärbung und der selektiven Zn2⁺-Indikator-/Kernfärbung/PI-Färbung bei der Beurteilung des Inseltodes. Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Auswahl der geeigneten Kombination von Fluoreszenzsonden, um die spektrale Überlappung bei der Datenerfassung zu minimieren. Tabelle 1 zeigt alle in diesem Protokoll demonstrierten Fluoreszenzsonden zusammen mit ihren jeweiligen Anregungs- und Emissionsmaxima und dem Zellzustand (lebend/tot/apoptotisch), den jede Färbung anzeigt. Die Optimierung von Anregungs- und Emissionsfiltern kann erforderlich sein, um die spektrale Überlappung zwischen Farbstoffen zu minimieren und lebende, tote oder apoptotische Zellen genau zu quantifizieren. Darüber hinaus nimmt die Lebensfähigkeit isolierter Inselzellen im Laufe der Zeit rapide ab, um die besten Ergebnisse bei der Analyse der Auswirkungen von Verbindungen auf die Lebensfähigkeit von Inselzellen zu erzielen, sollten Experimente innerhalb von 72 Stunden nach der Isolierung durchgeführt werden. Durch die Bereitstellung präziser, reproduzierbarer Daten zur Zellviabilität, Apoptose und zum β-zellspezifischen Tod veranschaulicht diese Studie das Potenzial dieser Techniken bei der Entwicklung therapeutischer Interventionen, die darauf abzielen, die Zytokintoxizität zu reduzieren und die β-Zell-Funktion bei Diabetes zu erhalten. Veröffentlichte Studien aus unserem Labor haben diesen Ansatz verwendet, um quantitative Daten zur Lebensfähigkeit β Zellen und zum Schutz vor Apoptose in Gegenwart eines niedermolekularen Inhibitors zu liefern ^5,21.

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die Färbung des apoptotischen Absterbens von Betazellen nur mit zusätzlichen betazellspezifischen Markern erreicht werden kann, die sich spektral nicht mit YOPRO-1- oder Annexin-V-Fluoreszenzfarbstoffen überlappen. Alternativ können auch robustere, wenn auch teurere Reportermauslinien, wie z. B. die Insulin-cre-Reportermäuse mit Apoptose-spezifischen Promotoren, eingesetzt werden. Dieses Knockout-Modell kombiniert eine Insulin-Promotor-getriebene Cre-Rekombinase mit einem Reportersystem wie tdTomato und GFP, um die Apoptose in insulinexprimierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse sichtbar zu machen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass das manuelle Zählen von Inselbildern zeitaufwändig ist und einen geringen Durchsatz aufweist. Während in unserem Labor daran gearbeitet wird, ein geeignetes ImageJ-Plugin für die automatisierte Quantifizierung lebender/toter Zellen zu entwickeln, funktionieren derzeit verfügbare Zellzähl-Plugins mit ImageJ (NIH) oder anderer kommerziell erhältlicher Zellzählsoftware am besten mit Farbstoffen wie Nuclear Stain und PI, die Zellkerne identifizieren und unterscheidbare Grenzen zwischen einzelnen Zellen aufweisen. Farbstoffe wie FDA und AnnexinV haben eine spärlichere Dehnung, was es schwierig macht, die Grenzen zwischen den Zellen bei der Zählung mit automatisierter Software zu identifizieren.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die folgenden Zuschüsse stellten Mittel für diese Arbeit zur Verfügung: NIDDK Award R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B an N.L.F. und ADA 7-20-JDF-020 an N.L.F. Die Autoren danken dem Diabetes Research Center an der University of Colorado Anschutz Campus P30-DK116073 und den zugehörigen Core Facilities, die zur Unterstützung dieser Arbeit eingesetzt werden.