טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

מחקר זה חוקר את ההשפעה של ציטוקינים פרו-דלקתיים על איי הלבלב, במיוחד תאי β המייצרים אינסולין, תוך שימוש בשילוב של טכניקות צביעה פלואורסצנטיות ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את כדאיות התאים, אפופטוזיס ומוות ספציפי לתאי β. איי עכברים מבודדים טופלו בריכוזים משתנים של קוקטייל ציטוקינים, כולל TNF-α, IL-1β ו-IFN-γ, כדי לחקות אפופטוזיס בתיווך חיסוני במהלך התפתחות סוכרת מסוג 1. הכדאיות של תאי איים הוערכה באמצעות צביעה כפולה של ה-FDA/PI, כאשר המרת ה-FDA לפלואורסצאין הצביעה על תאים ברי קיימא, ותאים מסומנים ב-PI שנפגעו ממברנה. YOPRO-1 וצביעה גרעינית סיפקו נתונים נוספים על אפופטוזיס, כאשר Annexin-V אישר תאים אפופטוטיים מוקדמים. ניתוח כמותי חשף עלייה משמעותית בשיעורי האפופטוזיס ותמותת התאים באיים שטופלו בציטוקין. כדי להעריך באופן ספציפי את ההשפעות על תאי β, נעשה שימוש בצביעה סלקטיבית של Zn²⁺ כדי לתייג תאים מייצרי אינסולין באמצעות אסוציאציה של אבץ בגרגירי אינסולין, וחשף אובדן תאי β משמעותי לאחר טיפול באיים עם ציטוקינים פרו-דלקתיים במשך 24 שעות. פרוטוקולים מרובי צביעה אלה לוכדים ומכמתים ביעילות את היקף הנזק הנגרם על ידי ציטוקינים באיים וניתן להשתמש בהם כדי להעריך טיפולים שנועדו למנוע אפופטוזיס של תאי β בסוכרת מסוג 1 מוקדמת.

איי הלבלב, הידועים גם בשם איי לנגרהנס, הם אוסף של תאים אנדוקריניים הממוקמים בתוך הלבלב. תאי β המייצרים אינסולין הם המרכיב הנפוץ והמשמעותי ביותר מבחינה תפקודית באיי הלבלב. תאי β אלה מפרישים אינסולין, הורמון הממלא תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז¹. בסוכרת מסוג 1 (T1D), מערכת החיסון מכוונת ומסתננת לאיי הלבלב, והורסת תאי β המייצרים אינסולין. התקפה אוטואימונית זו מתווכת בעיקר על ידי ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל אינטרלוקין-1β (IL-1β), גורם נמק גידול-אלפא (TNF-α) ואינטרפרון-גמא (IFN-γ)². ציטוקינים אלה יוזמים מפל של אירועי איתות בתוך תאי β שבסופו של דבר מעוררים אפופטוזיס³. אפופטוזיס, מוות תאי מתוכנת, הוא תהליך מוסדר היטב הכולל הפעלה של קספאזות, פיצול DNA והתפוררות תאים. הוא תורם לאובדן הדרגתי של מסת תאי β ותפקודם במהלך הופעת T1D³.

הבנת המנגנונים המולקולריים המניעים אפופטוזיס של תאי β היא קריטית לזיהוי אסטרטגיות למניעה או להפחתת הרס תאי β ב-T1D. כדי להשיג זאת, איי לבלב מבודדים ממודלים ניסיוניים או גופות אנושיות משמשים כמערכת מודל חזקה ומבוססת לחקר פתולוגיה של תאי β ^2,3. על ידי טיפול באיים מבודדים אלה עם ציטוקינים פרו-דלקתיים, חוקרים יכולים לשכפל את הסביבה המאפיינת את T1D המוקדם, מה שמאפשר מחקר מפורט של תפקוד לקוי של תאי β ומוות במבחנה ^4,5. ניסויים אלה מספקים תובנות מפתח לגבי הפגיעות וההישרדות של תאי β בתנאים הקשורים למחלה, והם משמשים גם כפלטפורמה לבדיקת התערבויות טיפוליות שמטרתן להגן או להציל תאי β מאפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים. על ידי שימוש במערכת מבחנה זו, אנו יכולים לנתח ביעילות כיצד איים ממינים שונים מגיבים לתנאים שונים, ולספק הבנה טובה יותר של וריאציות תפקודיות ואפופטוטיות בין מינים.

מחקרים קודמים הראו כי איים עכברים ובני אדם שטופלו במשך 24 שעות בקוקטייל (1x = 10 ננוגרם/מ"ל TNF-α, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ) של ציטוקינים שמקורם בעכברים ובבני אדם, בהתאמה, הביאו למוות משמעותי של תאי איים ^4,5,6. כדאיות האי אושרה על ידי צביעת התאים שטופלו בציטוקינים בפלואורסצאין דיאצטט (FDA) ופרופידיום יודיד (PI)^5,6. ברחבי העולם, כדאיות האיים מוערכת באמצעות טכניקת אי הכללת הצבע הסטנדרטית של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) עם ה-FDA ו-PI⁷. כתמים פלואורסצנטיים או מצעים מצומדים בצבע מעריכים את כדאיות התא על סמך שלמות הממברנה וחדירות הממברנה. ה-FDA, צבע חדיר לתאים, מומר על ידי תאים חיים לפלואורסצנטיות ירוקה (פלואורסצאין). לעומת זאת, PI, צבע שאינו מתאים לתאים, מכתים רק את גרעיני התאים המתים עם ממברנות פגועות⁷. לאחר מכן מנותחים התאים באמצעות הדמיה דו-צבעונית במיקרוסקופ קונפוקלי, שבו פלואורסצנטים ירוקים ואדומים מסמנים תאים ברי קיימא ותאים מתים, בהתאמה.

המגבלה של פרוטוקול הצביעה של ה-FDA/PI היא ש-PI נכנס רק לתאים שאיבדו את סלקטיביות הממברנה, מה שאומר שהוא לא יכול להבחין בתאים אפופטוטיים מוקדמים. יתר על כן, שיטה זו אינה יכולה להבדיל בין תת-קבוצות תאים, מה שהופך אותה לבלתי מתאימה להערכה סלקטיבית של כדאיות תאים β. פרוטוקול Annexin V/PI משמש בדרך כלל לחקר תאים אפופטוטיים, והפרוטוקול שונה כדי לשפר את הדיוק שלו⁸. השלבים המוקדמים של אפופטוזיס כוללים העברה של פוספטידילסרין מהשכבה הפנימית לשכבה החיצונית של קרום הפלזמה. אנקסין V, חלבון תלוי סידן, נקשר עם זיקה גבוהה לפוספטידילסרין החשוף הזה. צביעה עם PI מתבצעת לצד annexin-V כדי להבחין בין תאים אפופטוטיים (חיובי ל-annexin-V בלבד) לבין תאים נמקיים (חיוביים הן ל-annexin-V והן ל-PI), שכן תאים נמקיים מציגים גם פוספטידילסרין עקב פגיעה בשלמות הממברנה⁹. צבעים אחרים, כגון YOPRO-1, משמשים גם לכימות אפופטוזיס של תאי אי. קרום התא של תאים ברי קיימא אטום ל-YOPRO-1, בניגוד ל-annexin-V, שאינו יכול לכמת תאים חיים שעוברים אפופטוזיס.

כדי להעריך מוות של תאי β בלבלב, יש צורך בצבעים ספציפיים המכוונים רק לתאים המייצרים אינסולין. מאפיין מובהק של תאי β הלבלב הוא שחלק מ-Zn²⁺ תוך-תאי מאוחסן בשלפוחיות כקומפלקס אינסולין Zn²⁺ (יחס 2:1)¹⁰. Zn²⁺ חופשי קיים גם במרחב החוץ-גרגירי סביב β התאים כמאגרים. ניתן לדמיין Zn²⁺ ו-Zn²⁺ הקשורים באופן רופף לאינסולין בגרגירי הפרשה באמצעות צבעים קושרי אבץ. דיתזון, צבע קושר אבץ, משמש בדרך כלל להערכת טוהר האיים, אך לא ניתן לשלב אותו עם צבעים פלואורסצנטיים המשמשים להערכת כדאיות ותפקוד של תאי β¹¹. בדיקות UV כמו TSQ ו-Zinquin שהן סלקטיביות מאוד כלפי Zn²⁺ פותחו כדי לכמת תאי β על ידי הדמיה ומדידה של Zn²⁺ תוך-תאי חופשי^{; 12,13}. עם זאת, השימוש בהם מוגבל על ידי מסיסות ירודה, העמסת תאים לא אחידה, דרישת עירור UV ומידור לשלפוחיות חומציות¹⁴. בדיקות פלואורסצנטיות באורך גל גלוי, כגון Newport green ו-Zn²⁺ מחוון סלקטיבי, פותחו גם הם כדי להתגבר על מגבלות אלו וכיום נמצאים בשימוש נרחב לאיתור תאי β באיים אנושיים מבודדים^15,16. ל-FluoZin-3 (אינדיקטור סלקטיבי Zn²⁺) יש זיקה גבוהה יותר של Zn²⁺ ותפוקה קוונטית מעולה מאשר ניופורט גרין והוכח כיעיל להדמיית Zn²⁺ בשחרור משותף עם אינסולין באיים מבודדים^14,17.

שימוש בצבעים פלואורסצנטיים כמו FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 ו-Zn²⁺ מאפשר מדידה והבחנה בין תאים מתים ברי קיימא, אפופטוטיים וכוללים. שילוב בדיקות תואמות וסלקטיביות ביותר מציע גם שיטה ממוקדת להערכה וכימות של כדאיות תאי β ואפופטוזיס, שהיא קריטית להבנה והפחתת הרס תאי β במחקר סוכרת ופיתוח תרופות.

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קולורדו דנבר (פרוטוקולים 000929). עכברי C57Bl/6 ששימשו לניסוי זה נרכשו ממעבדת ג'קסון ושוכנו במתקן מבוקר טמפרטורה במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה למזון ומים אד ליביטום. איי העכברים המבודדים הושגו באמצעות פרוטוקול עיכול הקולגנאז, שתואר בעבר ^5,18.

1. הכנת פתרונות ומדיה תרבותית

הערה: יש להכין אמצעי תרבית, מלאי ציטוקינים וריאגנטים אחרים בתנאים סטריליים.

1. הכן מדיום תרבית איים על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 10,000 U/mL פניצילין ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ל-500 מ"ל של 1640 RPMI Medium.
2. הכן תמיסת מלח 1x חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4. הכינו תמיסת מלאי פי 1000 של קוקטייל ציטוקינים של עכברים, 10 מיקרוגרם/מ"ל TNF-α 10 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 מיקרוגרם/מ"ל IFN-γ ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ואחסנו את התמיסה ב-10 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס.
3. הכן תמיסת מלאי של 46 מיקרומטר (פי 50) של ה-FDA באצטון ואחסן אותה ב-1 מ"ל ב-20 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת מלאי PI של 1.434 מ"מ (פי 50) ב-PBS ואחסן אותה ב-1 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס.
4. הכן 500 מ"ל של מאגר קרבס-הנסלייט HEPES (BMHH) שונה בביקרבונט עם 125 מ"מ NaCl, 5.7 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl₂, 1.2 מ"מ MgCl₂ ו-10 מ"מ HEPES ב-500 מ"ל של dH₂O. התאם את ה-pH ל-7.4.
5. הכן 100 מ"ל של מאגר קשירה Annexin-V עם 10 מ"מ HEPES, 140 מ"מ NaCl ו-2.5 מ"מ CaCl₂ ב-100 מ"ל של dH₂O. התאם את ה-pH ל-7.4.
6. הכן 1mM Zn²⁺ פתרון מלאי אינדיקטור סלקטיבי ב-DMSO ואחסן ב-10 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס.
   הערה: צבעי פלורסנט רגישים לאור, ולכן האחסון והדגירה חייבים להיות בחושך.

2. טיפול באיים מבודדים עם ציטוקינים

1. בודדו איי עכברים עם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר לתוך מדיום התרבות ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי להתאושש מלחץ בידוד לפני הטיפול בציטוקינים.
2. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית האיים המעוקר לצלחות פטרי 35 מ"מ שאינן מטופלות בתרבית רקמות וסמן אותן כראוי כדי להבדיל בין כלים שטופלו בציטוקינים ולא טופלו ללא ציטוקינים.
3. עבור כלים שטופלו בציטוקין, הסר 6 מיקרוליטר של מדיום תרבית והחלף אותו ב-2 מיקרוליטר מכל ציטוקין מתמיסת המלאי כדי לתת ריכוז ציטוקינים יחסי סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ (1x RCC).
   הערה: ניתן להכין RCC תחתון של 0.5x ו-0.1x על ידי דילול תמיסות מלאי עם PBS סטרילי המכיל 0.1% BSA ב-1:1 ו-1:9, בהתאמה.
4. ב-12 שעות עד 24 שעות לאחר הבידוד, יש להרים 10-20 איים באמצעות מיקרופיפטה תחת מיקרוסקופ אור ולהעביר לכלים ולדגור בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות.

3. מדידת כדאיות האיים עם ה-FDA/PI

1. הוסף 20 מיקרוליטר כל אחת מתמיסות מלאי ה-FDA וה-PI ל-960 מיקרוליטר של מאגר BMHH המכיל 0.1% BSA כדי לתת ריכוז סופי של 0.46 מיקרומטר ו-14.34 מיקרומטר של הצבעים הפלואורסצנטיים, בהתאמה.
2. יש להפחית 100 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה לצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ.
3. 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, העבירו בזהירות לפחות 6 איים מכל טיפול לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית. דוגרים למשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך (מכסים בנייר כסף).
4. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. צלם תמונות תוך 15 דקות מרגע הצביעה של ה-FDA/PI.
5. השתמש בלייזרי עירור ב-488 ננומטר ו-514 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה עבור ה-FDA (520 ננומטר) ו-PI (620 ננומטר), בהתאמה.
6. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
7. ספור תאים ירוקים חיים (חיוביים ל-FDA) ואדומים מתים (חיוביים ל-PI) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לעכבר (n = 3). חשב את אחוז מוות התאים באופן הבא:
   אחוז המוות של האיים = מספר התאים המתים/ (מספר התאים המתים + מספר התאים החיים) x 100%

4. מדידת אפופטוזיס באמצעות צביעה

1. הוסף 8 מיקרוליטר של YOPRO-1 (תמיסה של 1 מ"מ) ל-992 מיקרוליטר של מאגר הדמיה BMHH לריכוז סופי של 0.8 מיקרומטר.
2. Aliquot 500 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה לצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית 14 מ"מ.
3. לאחר 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, העבירו בזהירות לפחות 6 איים מכל טיפול לתוך צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית ודגרו למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחושך (מכסים בנייר כסף).
4. לאחר 20 דקות של דגירה, הוסיפו טיפה של NucBlue (כתם גרעיני, 20 מיקרוליטר) לכל צלחת פטרי עם תחתית זכוכית והמשיכו בדגירה. זמן הדגירה הכולל הוא שעה אחת עבור YOPRO-1 ו-40 דקות עבור כתם גרעיני.
5. לאחר שעה אחת של דגירה, העבירו את האיים למאגר הדמיה טרי של BMHH המכיל 0.1% BSA (100 מיקרוליטר) בצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ.
6. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. השתמש בלייזרי עירור ב-405 ננומטר ו-488 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה של כתם גרעיני (460 ננומטר) ו-YOPRO-1 (509 ננומטר), בהתאמה.
7. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
8. ספור תאים כחולים חיים (חיוביים לכתם גרעיני) וירוק אפופטוטי (חיובי ל-YOPRO-1) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לכל עכבר (n = 3). חשב את אחוז תאי האי האפופטוטי באופן הבא:
   אחוז תאי האי האפופטוטיים = מספר התאים האפופטוטיים / (מספר התאים האפופטוטיים + מספר התאים החיים) x 100%

5. מדידת אפופטוזיס עם נספח V/ כתם גרעיני

1. הוסף 2 טיפות של כתם גרעיני (40 מיקרוליטר) ל-1 מ"ל של מאגר מחייב אנקסין. הכניסו 100 מיקרוליטר מהתמיסה לצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית 7 מ"מ.
2. לאחר 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, יש לשטוף בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 3x לפחות 6 איים מכל טיפול ב-PBS על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש פעמים באמצעות מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר. העבירו את האיים לצלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית עם תמיסת הכתם הגרעיני ודגרו אותם במשך 40 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך (מכסים בנייר כסף).
3. לאחר 25 דקות של דגירה, מוסיפים 5 מיקרוליטר של Annexin V Alexa Flour 488 מצומד לכל צלחת פטרי עם תחתית זכוכית וממשיכים בדגירה. זמן הדגירה הכולל הוא 40 דקות עבור הכתם הגרעיני ו-15 דקות עבור נספח V.
4. לאחר 40 דקות של דגירה, העבירו את האיים למאגר הדמיה BMHH טרי (ללא נספח V או כתם גרעיני) בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ.
5. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. השתמש בלייזרי עירור ב-405 ננומטר ו-488 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה של כתם גרעיני (460 ננומטר) ומצומד נספח V (515 ננומטר), בהתאמה.
6. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
7. ספור תאים כחולים חיים (חיוביים לכתם גרעיני) וירוק אפופטוטי (חיובי ל-Annexin V) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לעכבר (n = 3). חשב את אחוז תאי האי האפופטוטי באופן הבא:
   אחוז התאים האפופטוטיים = מספר התאים האפופטוטיים / (מספר התאים האפופטוטיים + מספר התאים החיים) x 100%

6. מדידת מוות של β תאים באמצעות מחוון סלקטיבי Zn²⁺ / כתם גרעיני / PI

1. הוסף 2 μL של Zn²⁺ אינדיקטור סלקטיבי תמיסת מלאי AM ל-998 μL של מאגר הדמיה BMHH כדי ליצור ריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
2. 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, העבירו בזהירות לפחות 6 איים מכל טיפול לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית. דגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחושך עם תמיסת AM מחוון סלקטיבי Zn²⁺ (מכסים בנייר כסף).
3. לאחר 20 דקות של דגירה, הוסיפו טיפה של כתם גרעיני (20 מיקרוליטר) לכל צלחת פטרי עם תחתית זכוכית, לפי הוראות היצרן והמשיכו בדגירה. זמן הדגירה הכולל הוא שעה אחת עבור מחוון סלקטיבי Zn²⁺ ו -40 דקות עבור כתם גרעיני.
4. לאחר שעה אחת של דגירה, העבירו את האיים למאגר הדמיה טרי של BMHH המכיל 0.1% BSA (100 מיקרוליטר) בצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ. הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PI למשך 10 דקות כדי ליצור ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל.
5. צלם תמונות תוך 15 דקות מצביעת ה-PI באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. השתמש בלייזרי עירור ב-405 ננומטר, 488 ננומטר ו-514 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה של כתם גרעיני (460 ננומטר), מחוון סלקטיבי Zn²⁺ (516 ננומטר) ו-PI (620 ננומטר), בהתאמה.
6. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
7. ספור תאים כחולים חיים (חיוביים לכתם גרעיני), ירוק אבץ (Zn²⁺ אינדיקטור סלקטיבי חיובי) ואדום מת (חיובי PI) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לעכבר (n = 3). חשב את אחוז המוות של β תאים באופן הבא:
   אחוז מוות של β תאים = מספר תאים חיוביים לאבץ וחיובי PI / (מספר תאי איים מתים + חיים) x 100%
   או
   אחוז מוות של β תאים = מספר התאים החיוביים לאבץ וחיובי PI / (מספר התאים החיוביים לאבץ) x 100%

הצביעה הכפולה עם ה-FDA וה-PI שימשה להערכת הכדאיות של איים שטופלו בציטוקינים. כל הניסויים נערכו בשלושה עותקים (n = 3), והנתונים הופקו ממספר תמונות z-stack של 10 מיקרומטר זו מזו, כאשר כל שכפול מכיל נתונים ממוצעים מ-5 או 6 איים, כדי להבטיח שחזור והשוואה סטטיסטית בין האיים המטופלים והלא מטופלים. איור 1A מציג איים בריאים מקבוצת הביקורת הלא מטופלת המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מובהקת עקב ההמרה של ה-FDA לפלואורסצאין על ידי תאים פעילים אנזימטית. היעדר או נוכחות מינימלית של פלואורסצנציה אדומה מאשרת את הכדאיות של איים אלה, מה שמעיד על קרומי תאים שלמים. לעומת זאת, איור 1B מדגים פלואורסצנטיות אדומה משמעותית באיים שטופלו בציטוקין, ומסמן תאים מתים או גוססים עם שלמות הממברנה שנפגעה. עלייה זו בקרינה האדומה מדגישה את צביעת PI של גרעינים בתאים שאינם ברי קיימא עם הפרעה בקרום. ההשפעה של ריכוז הציטוקינים על כדאיות האיים מוצגת באיור 1C. הנתונים הכמותיים מראים מתאם חיובי בין שיעור התמותה באיים לבין עלייה בריכוזי הציטוקינים (0.1x-1x RCC). תגובה תלוית מינון זו מדגישה את ההשפעות הציטוטוקסיות של ציטוקינים על תאי אי, כפי שמעידה הקרינה האדומה המוגברת בתאים מוכתמים PI עם חשיפה גבוהה יותר לציטוקינים.

כדי למדוד אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקין, תאי איים לא מטופלים ומטופלים בציטוקינים נצבעו ב-YOPRO-1 ובכתם גרעיני כדי לכמת תאים אפופטוטיים וברי-קיימא. איור 2A מציג תמונה מייצגת של תא שאינו אפופטוטי מצלחת הבקרה הלא מטופלת, שבה נצפית פלואורסצנטיות כחולה חזקה בגרעין, ללא פלואורסצנטיות ירוקה, מה שמעיד על תא בר-קיימא שאינו אפופטוטי. איור 2B מציג איים שטופלו בציטוקינים עם פלואורסצנטיות ירוקה מובהקת מ-YOPRO-1 לצד צביעה גרעינית כחולה. הקרינה הכפולה הזו מאשרת אפופטוזיס, מכיוון ש-YOPRO-1 מחלחל לקרומי תאים לחוצים. הכימות גילה שיותר מ-30% מאיי הלבלב הראו אפופטוזיס תוך 24 שעות מהחשיפה לציטוקינים (איור 2C). צביעת Annexin-V בוצעה כדי לאמת אפופטוזיס עוד יותר, והראה שכ-40% מהאיים נצבעו באופן חיובי עבור Annexin-V, ולוכדים הן תאים אפופטוטיים מוקדמים והן אלה המתקדמים דרך אפופטוזיס (איור 2D-F).

לבסוף, כדי להעריך את שיעור התמותה של β תאי הלבלב בתגובה לציטוקינים, צבענו את האיים הלא מטופלים והמטופלים בציטוקינים עם אינדיקטור סלקטיבי Zn²⁺, כתם גרעיני ו-PI (איור 3A,B). התוצאות שלנו הראו דפוס צביעה מנוקד בדיד עם האינדיקטור הסלקטיבי Zn²⁺, המצביע על כך שהמחוון הסלקטיבי Zn²⁺ קשור לאבץ חופשי וקשור באופן רופף הקשור לאינסולין בגרגירי הפרשה. בנוסף, צביעה משולשת עם צבעים אלה מאפשרת שילוב של תעלות פלואורסצנטיות מובהקות (כחול עבור כתם גרעיני, אדום עבור PI וירוק עבור מחוון סלקטיבי Zn²⁺), המאפשר הדמיה מדויקת ומולבטלת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מה שמקל על ההבחנה לא רק בין תאים חיים לתאים מתים אלא גם מוות ספציפי של תאי β המייצרים אינסולין. הוא גם מספק נתונים לכימות תיאורי של מוות β תאים כשבריר מהמספר הכולל של תאי β, תאים מתים או תאי איים. איור 3C מראה שציטוקינים גורמים להרס רב יותר של תאי β, והורסים כ-63% מהתאים המייצרים אינסולין תוך 24 שעות מהתרבית המשותפת עם איים בריאים.

איור 1: צביעה כפולה של איים עם פלואורסצאין דיאצטט (ירוק) ופרופידיום יודיד (אדום) כדי להעריך מוות מתווך ציטוקינים. (A) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מייצגות של איי עכברים לא מטופלים ו-(B) איים שטופלו בציטוקינים שנצבעו בפלואורסצאין דיאצטט (ירוק) ופרופידיום יודיד (אדום). (C) אחוז הכדאיות של איי עכברים שטופלו בריכוזי ציטוקינים יחסיים משתנים (0.1x ריבועים אדומים, 0.5x משולשים ירוקים ו-1x משולשים כחולים RCC) ואיים לא מטופלים (עיגולים שחורים). 1x RCC = 10 ננוגרם/מ"ל TNF-α, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. כל נקודת נתונים היא אי קטן. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05 ו-***p < 0.001 מצביעים על מובהקות סטטיסטית המבוססת על ANOVA עם הניתוח הפוסט-הוק של טוקי (n = 3). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צביעה של איים עם YOPRO-1 ו-Annexin-V כסמנים של אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים. (A) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מייצגות של איי עכברים לא מטופלים ו-(B) איים שטופלו בציטוקינים מוכתמים בכתם גרעיני (כחול) ו-YOPRO-1 (ירוק). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C) אחוז התאים החיוביים ל-YOPRO-1 באיים שטופלו בציטוקינים (1x משולשים כחולים RCC) ובאיים לא מטופלים (עיגולים שחורים). (D) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מייצג של איי עכברים לא מטופלים ו-(E) איים שטופלו בציטוקינים מוכתמים בכתם גרעיני (כחול) ו-Annexin V (ירוק). (F) אחוז התאים החיוביים ל-Annexin-V באיים שטופלו בציטוקינים (1x משולשים כחולים RCC) ובאיים לא מטופלים (עיגולים שחורים). 1x RCC = 10 ננוגרם/מ"ל TNF-α, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. כל נקודת נתונים היא אי קטן. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ****p<0.0001 מציין מובהקות סטטיסטית המבוססת על מבחן t בלתי תלוי של וולש (n = 3). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צביעה משולשת של איים עם כתם גרעיני (כחול), אינדיקטור סלקטיבי Zn²⁺ (ירוק) ופרופידיום יודיד (אדום) להערכת מוות ספציפי של תאי β בלבלב. (A) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מייצגות של (A) איי עכבר לא מטופלים ו-(B) איים שטופלו בציטוקינים בערימות z שונות של 10 מיקרומטר זו מזו. (C) אחוז תמותה של תאי β באיים שטופלו בציטוקינים (1x RCC). 1x RCC = 10 ננוגרם/מ"ל TNF-α, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. PI+ = סך כל התאים המתים, PI+β+ = β תאים מתים ו-β+ = סך כל β התאים (מתים וחיים). כל נקודת נתונים היא אי קטן. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ****p<0.0001 מציין מובהקות סטטיסטית המבוססת על מבחן t בלתי תלוי של וולש (n = 3). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת הבדיקות הפלואורסצנטיות המשמשות בפרוטוקול זה, העירור/פליטה שלהן ומצב התא המצוין על ידי צביעה חיובית.

מחקר זה מדגים את היעילות של שיטות רב-צביעה עם צבעים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה קונפוקלית בהערכת כדאיות תאי האי, אפופטוזיס והישרדות תאי β תחת לחץ המושרה על ידי ציטוקינים. צביעת ה-FDA/PI חשפה עלייה תלוית מינון במוות התאים בתוך איים שנחשפו לציטוקינים, כפי שניתן לראות על ידי פלואורסצנטיות אדומה המסמנת תאים פגועים בקרום, המאשרת את ההשפעה הציטוטוקסית של ציטוקינים על כדאיות התאים. צביעת ה-FDA/PI מזהה גם תאים ברי קיימא ומתים באיים אנושיים, ומציעה הערכה איכותית מהירה של כדאיות הכנת האיים האנושיים⁷. לפיכך, שיטת צביעה זו אמינה להערכת כדאיות התאים במצבים דלקתיים. תוצאה זו גם מחזקת את תפקידם של ציטוקינים בפתופיזיולוגיה של סוכרת, כאשר חשיפה ממושכת לציטוקינים מזיקה לתפקוד תאי β ולהישרדות ^5,19.

הכתמים הגרעיניים YOPRO-1 ו-Annexin-V/הכתמים הגרעיניים סיפקו תובנות נוספות לגבי אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים. איים שטופלו בציטוקינים הראו פלואורסצנטיות ירוקה מוגברת המעידה על תאים מתים הקשורים לתאים אפופטוטיים. נספח-V אישר גם את נוכחותם של תאים אפופטוטיים מוקדמים ומתקדמים. יחד, טכניקות צביעה אלו מאפיינות ביעילות אפופטוזיס בתאי β, ומאמתות אפופטוזיס כמנגנון עיקרי של מוות תאי איים כאשר הם נחשפים לציטוקינים פרו-דלקתיים³.

מעכבי חלבון קינאז שעלולים לשבש מסלולי העברת אותות אפופטוטיים, כמו גם נוגדנים ואנטגוניסטים נגד פעולותיהם של ציטוקינים פרו-דלקתיים, נחקרים כטיפולים מבטיחים שיכולים למנוע אפופטוזיס של תאי β ^5,20,21. פעילויות מחקר אלה משתמשות במיקרוסקופיה מבוססת פלואורסצנטיות כדי להעריך התערבויות פוטנציאליות להפחתת אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקין, תוך התמקדות בשימור תפקוד תאי β במודלים של סוכרת. על ידי שילוב נוסף של צביעת אינדיקטור סלקטיבית של Zn²⁺, גישה זו מאפשרת הדמיה סלקטיבית של תאי β המייצרים אינסולין באמצעות אסוציאציה של אבץ, ומספקת תצוגה ממוקדת של השפעות הציטוקינים על אוכלוסיות תאי β בתוך איים ומשפרת את הספציפיות של הניתוח¹⁶. גישה זו הבדילה בין תאי β לתאי איים אחרים וחשפה הרס משמעותי של תאי β, עם כ-63% ממקרי המוות של תאי β לאחר חשיפה לציטוקינים במחקר שלנו. ספציפיות זו היא קריטית להערכת שימור תאי β ומדגישה עוד יותר את הצורך באסטרטגיות ההגנה שלו בניהול סוכרת.

תוצאות אלו מדגישות את הרבגוניות של FDA/PI, YOPRO-1/ כתם גרעיני, ומחוון סלקטיבי Zn²⁺ / כתם גרעיני/צביעת PI בהערכת מוות של איים. שלב קריטי אחד בפרוטוקול זה הוא בחירת השילוב המתאים של בדיקות פלואורסצנטיות כדי למזער את החפיפה הספקטרלית באיסוף הנתונים. טבלה 1 מתארת את כל הבדיקות הפלואורסצנטיות המודגמות בפרוטוקול זה, יחד עם מקסימום העירור והפליטה שלהן ומצב התא (חי/מת/אפופטוטי) שכל כתם מציין. ייתכן שתידרש אופטימיזציה של מסנני עירור ופליטה כדי למזער את החפיפה הספקטרלית בין צבעים כדי לכמת במדויק תאים חיים, מתים או אפופטוטיים. בנוסף, הכדאיות של איים מבודדים פוחתת במהירות עם הזמן, לקבלת התוצאות הטובות ביותר בניתוח ההשפעות של תרכובות על כדאיות האיים, יש לבצע ניסויים תוך 72 שעות לאחר הבידוד. על ידי מתן נתונים מדויקים וניתנים לשחזור על כדאיות התאים, אפופטוזיס ומוות ספציפי לתאי β, מחקר זה ממחיש את הפוטנציאל של טכניקות אלה בפיתוח התערבויות טיפוליות שמטרתן להפחית את רעילות הציטוקינים ולשמר את תפקוד תאי β בסוכרת. מחקרים שפורסמו במעבדה שלנו השתמשו בגישה זו כדי לספק נתונים כמותיים על כדאיות תאי β והגנה מפני אפופטוזיס בנוכחות מעכב מולקולה קטנה ^5,21.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא שניתן להשיג צביעה של מוות אפופטוטי של תאי בטא רק באמצעות סמנים נוספים ספציפיים לתאי בטא שאינם חופפים ספקטרלית לצבעי פלואורסצנטיים YOPRO-1 או Annexin-V. לחלופין, ניתן לאמץ גם קווי עכברים מדווחים חזקים יותר אך יקרים, כגון עכברי מדווח אינסולין-קר עם מקדמים ספציפיים לאפופטוזיס. מודל נוקאאוט זה משלב Cre-recombinase מונע על ידי מקדם אינסולין עם מערכת דיווח כמו tdTomato ו-GFP כדי לדמיין אפופטוזיס בתאי בטא לבלב המבטאים אינסולין. מגבלה נוספת היא שספירה ידנית של תמונות איים גוזלת זמן ובעלת תפוקה נמוכה. בעוד שנעשים מאמצים במעבדה שלנו לפתח תוסף ImageJ מתאים שיספק כימות אוטומטי של תאים חיים/מתים, תוספים לספירת תאים הזמינים כיום באמצעות ImageJ (NIH) או תוכנות אחרות לספירת תאים הזמינות מסחרית עובדים בצורה הטובה ביותר עם צבעים כגון כתם גרעיני ו-PI, המזהים גרעיני תאים ויש להם גבולות ניתנים להבחנה בין תאים בודדים. לצבעים כמו FDA ו-AnnexinV יש מאמץ דליל יותר, מה שמקשה על זיהוי גבולות בין תאים בעת ספירה עם תוכנה אוטומטית.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

המענקים הבאים סיפקו מימון לעבודה זו: פרס NIDDK R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B ל-N.L.F., ו-ADA 7-20-JDF-020 ל-N.L.F. המחברים מבקשים להודות לתמיכה מהמרכז לחקר הסוכרת בקמפוס אנשוץ של אוניברסיטת קולורדו P30-DK116073 ומתקני הליבה הקשורים המשמשים לתמיכה בעבודה זו.