In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

Uma abordagem de imagem de cálcio permite o registro de respostas induzidas pelo paladar no cérebro de moscas acordadas enquanto uma solução é aplicada ao labelo. As respostas gustativas primárias em Drosophila melanogaster são usadas como exemplo, mas este protocolo pode ser adaptado para estudar neurônios a jusante ou outras espécies.

Por quase duas décadas, a imagem de cálcio in vivo tem sido um método eficaz para medir as respostas celulares aos estímulos gustativos no organismo modelo da mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Um ponto forte dessa metodologia é sua capacidade de registrar respostas neurais induzidas pelo paladar em animais acordados sem a necessidade de anestesia. Essa abordagem emprega sistemas de expressão binária (por exemplo, Gal4-UAS) para expressar o indicador de cálcio GCaMP em neurônios específicos de interesse. Este protocolo descreve um procedimento no qual as moscas que expressam GCaMP são montadas com o labelo posicionado de forma segura, permitindo que a fluorescência no cérebro seja registrada com resolução de milissegundos sob um microscópio confocal enquanto uma solução é aplicada ao labelo, estimulando todas as sensilas gustativas labelares. Os exemplos fornecidos enfocam as respostas de cálcio em neurônios receptores gustativos primários de D. melanogaster. No entanto, essa abordagem pode ser adaptada para registrar a partir de outros neurônios de interesse dentro do cérebro de drosofilídeos ou outras espécies de insetos. Este método de imagem permite que os pesquisadores registrem simultaneamente as respostas coletivas de cálcio de grupos de neurônios gustativos em todo o labelo, complementando os registros eletrofisiológicos de pontas que quantificam os potenciais de ação de neurônios individuais. A técnica de imagem de cálcio in vivo descrita aqui tem sido fundamental para descobrir mecanismos moleculares e celulares de quimiossensação, identificando padrões únicos de resposta temporal em neurônios gustativos primários, investigando mecanismos de modulação gustativa e explorando o processamento do paladar em circuitos a jusante.

A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é celebrada pelas poderosas ferramentas de pesquisa genética disponíveis neste organismo modelo. Essas ferramentas fornecem a capacidade de manipular prontamente genes específicos em células-alvo, tornando-as ideais para explorar circuitos neurais fundamentais, como visão e quimiossensação1,2,3. A guestação, por meio da quimiossensação de contato, é uma via neural chave que regula os comportamentos envolvidos na alimentação, acasalamento, reprodução e, finalmente, a sobrevivência e aptidão dos animais 4,5,6,7,8,9. Entender como essa importante informação quimiossensorial é codificada e transmitida requer a descrição da atividade dos neurônios nos circuitos que são ativados por estímulos gustativos.

Em D. melanogaster, os neurônios receptores gustativos externos (GRNs) estão localizados nas patas dianteiras, tromba e asas^10,11. O labelo, no final da tromba, contém estruturas semelhantes a cabelos chamadas sensilas que podem ser mapeadas por sua morfologia com base no tamanho: longo (tipo L), intermediário (tipo I) e curto (tipo S)¹⁰. A maioria dos GRNs está concentrada neste órgão sensorial, com cada sensila contendo 2-4 tipos diferentes de GRNs, de modo que cada modalidade gustativa está espalhada pelo labelo 12,13,14,15. Enquanto os registros eletrofisiológicos da ponta podem ser usados para quantificar os potenciais de ação provenientes de GRNs em uma única sensila¹⁶, in vivo, a imagem de cálcio pode ser usada para isolar a atividade de um tipo específico de GRN em todo o labelo^14,17. Essa mesma técnica de imagem de cálcio também pode ser usada para estudar respostas neurais em circuitos gustativos a jusante 18,19,20. A imagem de cálcio requer sistemas de expressão binária, como Gal4-UAS 21,22,23, e cruzar uma linha condutora contendo ativadores transcricionais específicos da célula para uma linha efetora para obter a expressão de um GCaMP em neurônios de interesse. Quando os níveis de cálcio intracelular aumentam, esses indicadores de cálcio geneticamente codificados aumentam na intensidade da fluorescência, de modo que o nível de fluorescência está correlacionado com mudanças na atividade neuronal^24,25.

Aqui, é descrito um método para usar imagens de cálcio para observar respostas neurais a estímulos gustativos in vivo. O objetivo geral deste método é estimular apenas os GRNs rotulares para quantificar as respostas neurais induzidas pelo paladar no cérebro de moscas acordadas. São fornecidos exemplos para o uso desse método para registrar respostas nos GRNs primários do labelo em D. melanogaster, e os benefícios e desafios do uso dessa abordagem são discutidos. Esta preparação foi desenvolvida para permitir aos experimentadores a capacidade de aplicar uma solução de saborizante a um labelo de mosca imobilizado enquanto estavam sob um microscópio confocal para registrar as respostas neurais quando todo o órgão sensorial está imerso em uma solução, o que ocorre em ambientes naturais. A abordagem de imagem de cálcio in vivo descrita aqui pode ser usada para descobrir novas interações saborizante-receptor ^8,14,26,27, detalhes temporais das respostas GRN^27,28, mecanismos moleculares de modulação GRN^29,30 e processamento de sabor em circuitos a jusante ^{8,18,19,20, 28,31}.

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de solução semelhante à hemolinfa adulta (AHL)

1. Prepare uma solução estoque contendo 108 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 4 mM de NaHCO₃, 1 mM de NaH₂PO₄, 5 mM de HEPES e 15 mM de ribose.
   NOTA: A ribose é usada como um açúcar não energético para manter a osmolaridade sem alterar os níveis de nutrientes no cérebro.
2. Ajustar o pH desta solução para 7,5 antes de filtrar e conservar a 4 °C. Verifique a osmolaridade do AHL após ajustar o pH para garantir a consistência entre as preparações.
3. Prepare estoques separados de 1 M de CaCl₂ e 1 M de MgCl₂, filtre e armazene em temperatura ambiente.
4. Para preparar uma alíquota do estoque principal de AHL, adicione um pequeno volume de cálcio e magnésio para obter concentrações finais de 2 mM de cálcio e 8,2 mM de magnésio. Este AHL pode ser armazenado a 4 °C e usado por até um mês, usando pequenas alíquotas levadas à temperatura ambiente para experimentos.

2. Moscas de montagem na câmara de imagem

1. Antes de montar as moscas, afie a ponta de um depilador dental em um copo pequeno e pontiagudo usando uma pedra de amolar (Figura 1D). Prenda a ponta afiada à cera e ligue-a para pré-aquecer. As configurações de calor dependerão do tipo e comprimento da ponta: é necessária uma temperatura mínima que permita que a cera permaneça derretida ao entrar em contato (50,5 °C funciona neste exemplo).
   NOTA: Um fio pode ser enrolado ao redor da extremidade do encerador dental para fixar uma ponta de metal afiada como alternativa.
2. Anestesiar suavemente 1-5 moscas (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Minimize o tempo de exposição à anestesia, pois longos períodos de exposição ao CO₂ ou frio podem afetar o comportamento. Para CO₂, use uma almofada de mosca que forneça um fluxo contínuo e uniforme de 99,9% de CO₂ a uma taxa de 5 L/min sob um microscópio de dissecação.
3. Use uma tesoura de dissecção para remover partes das pernas, cortando as patas média e traseira na articulação fêmur/tibial e as patas dianteiras no trocânter. Use uma pinça romba para ajudar a manipular a mosca. Aparar o tarso evitará a sensação do tarso e o chute da lamínula ou do estimulador gustativo.
4. Pegue a mosca pelas asas usando uma pinça romba para posicionar a mosca de forma que a cabeça fique acima da fenda do colo do útero alvo da câmara de imagem, mas o corpo esteja abaixo. É útil iniciar a mosca totalmente para a direita ou para a esquerda. Usando o lado cego da tesoura e a pinça romba, empurre suavemente a cabeça e o tórax simultaneamente para dentro da fenda.
5. Uma vez dentro do slot, empurre a mosca para a parte de trás do slot e reposicione-a suavemente para que a mosca fique voltada para a frente da câmara. Evite girar a cabeça muito fora do alinhamento com o tórax.
6. Repita para quantas moscas forem necessárias (esta câmara de imagem pode montar até 5 moscas).
7. Reúna uma pequena gota de esmalte na ponta de um palito e aplique uma camada fina para prender a cabeça da mosca à câmara de imagem.
   NOTA: a área precisa para aplicar o esmalte depende de qual parte do cérebro está sendo fotografada. Se estiver fazendo imagens da SEZ (como mostrado aqui) ou de outras regiões mediais inferiores, o esmalte pode ser aplicado generosamente no topo da cabeça da mosca, mas para obter imagens das regiões mediais superiores, o esmalte pode ser aplicado minimamente no topo da cabeça e adicionado lateralmente perto dos olhos para deixar essa área livre para dissecção. Este protocolo é otimizado apenas para estimulação do paladar sem olfato, mas se os voláteis do esmalte forem uma preocupação, use cera ou cola UV como métodos alternativos para proteger a cabeça da mosca.

3. Depilação da tromba em uma posição estendida

1. Pegue a cera com uma mão e junte uma pequena gota de cera na ponta.
2. Por outro lado, use uma pinça semi-afiada para agarrar um palpo maxilar e puxe suavemente e segure a tromba em extensão total.
   NOTA: Tenha cuidado para segurar apenas o palpo maxilar, pois beliscar a cutícula na tromba aumenta o potencial de danos. Não prossiga se a tromba for comprimida ou a cutícula da tromba for perfurada. Um pequeno cocô de mosca pode ser usado como uma alternativa ao fórceps para retirar a tromba usando sucção durante a aplicação da cera.
3. Toque a ponta da cera na câmara perto da base da tromba até que a cera comece a fluir e, em seguida, mova-se para fazer contato com a base da tromba. Cera até a metade da haste, mas evite tocar nas sensilas labelares com a cera ou cera. A cera deste lado manterá a tromba no lugar. Não prossiga se as sensilas forem tocadas pela cera ou cera a qualquer momento.
4. Aplique a cera usando o método acima para o outro lado, fazendo uma ponte contínua de cera sobre a tromba.
5. Estenda totalmente a tromba o mais reto possível. Se necessário, mover a tromba pode ser feito reaquecendo a cera e empurrando suavemente a tromba para a posição desejada.
6. Repita para que outras moscas sejam montadas na mesma câmara.
7. Desligue o CO₂ ou remova as moscas da anestesia com gelo. Coloque as moscas montadas em uma câmara de umidade por 60 minutos para se recuperar (caixa de ponteira de pipeta limpa e vazia com lenços umedecidos e sem fiapos).

4. Dissecção para revelar a região cerebral de interesse

1. Remova as moscas da câmara de umidade. As moscas devem estar claramente vivas, movendo ativamente seu abdômen, pernas e antenas. Configure o microscópio confocal ou de dois fótons antes da dissecação.
2. Ligue a cera para reparar possíveis quebras na cera durante a dissecção e prepare a temperatura ambiente AHL.
3. Usando uma pinça muito afiada, aperte as duas antenas e, em seguida, aperte a cutícula para fornecer um orifício para inserir um lado da pinça afiada. Passe a pinça sob a cutícula para removê-la da região que cobre a área de interesse do cérebro. A Figura 1F indica um X sobre as áreas da cutícula a serem alvo com a pinça para remoção.
4. Lave o cérebro exposto em AHL aplicando generosamente AHL (~ 100 μL) na cabeça e, em seguida, removendo tudo, exceto uma fina camada de AHL para evitar que o cérebro seque.
   NOTA: Se a cera quebrar em qualquer ponto e precisar ser reparada, remova brevemente todo o AHL ao redor da cabeça antes de reaquecer a cera para prender novamente a tromba na posição estendida.
5. Usando uma pinça afiada, remova os sacos de ar e quaisquer detritos grandes que cubram o cérebro. Evite penetrar no cérebro mantendo as pontas do fórceps visíveis.
6. Lave com AHL ~ 3 vezes para remover todos os pequenos detritos.
7. Certifique-se de que a região do cérebro de interesse esteja claramente visível. Para obter uma imagem específica da zona subesofágica (SEZ) como neste exemplo, corte o esôfago na base perto da tromba e perto do ponto onde ele passa pelo cérebro, beliscando com uma pinça muito afiada e removendo esta peça para expor a SEZ.
   NOTA: As moscas não podem ingerir soluções após a remoção do esôfago e nenhuma ativação de GRN faríngeo pode ocorrer.
8. Sob o microscópio de dissecação, posicione a lamínula de 10 mm x 20 mm na ranhura angular da câmara de imagem. Certifique-se de que ele esteja na base da tromba sem quebrar a cera. A ponta do labelo não deve tocar na lamínula.

5. Imagem e estimulação do paladar

1. Ligue o microscópio confocal ou de dois fótons e esteja pronto para a captura de imagens. Configure um micromanipulador com um tubo capilar posicionado para entregar os saborizantes à mosca enquanto eles estão no estágio do microscópio.
   NOTA: A imagem de dois fótons pode capturar fluorescência de neurônios que estão mais profundos no tecido cerebral.
2. Carregue ~ 2 μL de água (ou outro controle negativo) no tubo capilar do
   estimulador no estágio do microscópio.
3. Encontre a mosca dissecada e concentre-se no labelo usando um campo claro de imersão em ar de 10x. Alinhe o capilar com o labelo sob esta visão. Câmeras adicionais apontadas para o labelo da mosca podem ser incluídas para visualizar o alinhamento do capilar com a mosca de vários ângulos.
   NOTA: Certifique-se de que todas as sensilas labelares estão sendo estimuladas com a solução durante o alinhamento; Se a posição do estimulador ou labelo não for perpendicular o suficiente para isso, ajuste de acordo. Os capilares podem ser puxados e lixados com uma pedra de amolar para proporcionar um ajuste mais apertado ao redor do labelo.
4. Deixe o capilar posicionado diretamente na frente do labelo, próximo, mas sem tocar.
5. Mova o palco para que a região do cérebro de interesse fique centralizada e mude para uma objetiva de imersão em água com maior ampliação (40x usada neste exemplo).
6. Adicione aproximadamente 200 μL de AHL no topo do cérebro para fazer contato com o objetivo de imersão. Remova todas as bolhas.
7. Oriente o foco usando campo claro para mover cuidadosamente no plano z para encontrar a borda da cutícula que foi removida e centralizar a região do cérebro de interesse.
8. Mude para a potência do laser de 488 nm para encontrar a expressão de GCaMP na área de interesse.
   NOTA: Dependendo da linha do driver e da versão do GCaMP usada, pode ser necessária alguma otimização inicial para amplificar a relação sinal-ruído para preparações individuais. A co-expressão de RFP pode ser útil para neurônios com baixa fluorescência de GCaMP basal.
9. Prepare uma coleção de imagens de lapso de tempo. A velocidade dependerá do microscópio específico e do sinal GCaMP, mas capturar pelo menos uma imagem a cada ~ 100 ms é o ideal.
   NOTA: A captura de um único plano Z de fluorescência ao longo do tempo otimizará a velocidade de captura para fornecer cinética de cálcio detalhada. Pilhas de imagens tiradas em vários planos Z em cada ponto de tempo podem diminuir as taxas de captura, mas registrarão respostas em neuritos que estão em diferentes profundidades no tecido.
10. Depois de coletar pelo menos 5 s de fluorescência de linha de base, mova manualmente o estimulador para que o capilar cubra o labelo por um período de tempo específico (5 s neste exemplo) e, em seguida, remova o estímulo e capture pelo tempo desejado.
11. Remova o AHL e retorne ao campo claro de 10x para garantir que a lamínula, o estimulador e o labelo ainda estejam na mesma posição.
    NOTA: Se o estimulador não estiver bem alinhado com o labelo ou for girado demais, o labelo pode ser movido ou o capilar pode atingir a câmara de imagem, potencialmente quebrando a cera e criando um vazamento do AHL.
12. Remova a câmara de imagem. Use um pano sem fiapos para remover a primeira solução e lave a pipeta com água. Em seguida, pipete ~ 2 μL do próximo saborizante no tubo capilar.
13. Mova a câmara de imagem de volta para o palco e repita as etapas 5.4 a 5.12 para esta solução.
    NOTA: A alta tensão superficial da maioria dos saborizantes apresenta produtos químicos residuais da permanência no labelo em voo. No entanto, se os saborizantes forem altamente saturados ou viscosos, a água pode ser movida sobre o labelo várias vezes para lavar o órgão sensorial antes do próximo estímulo.
14. Repita para quantas soluções desejar para esta mosca.
15. Retorne à etapa 3 para preparar a próxima mosca para a imagem.

6. Análise de imagem

1. Abra a pilha de imagens a ser analisada no software de processamento de imagens. Se necessário, execute uma subtração em segundo plano usando uma região fora do sinal GCaMP.
2. Selecione uma região de interesse (ROI) apertada ao redor das projeções a serem quantificadas usando a ferramenta à mão livre ou de forma e certifique-se de que a seleção seja aplicada a todas as imagens na pilha.
3. Gere uma lista das leituras de fluorescência ao longo do tempo para esse ROI e exporte-a para uma planilha para processamento posterior. Use o perfil do eixo Z de plotagem no ImageJ (FIJI) ou uma função semelhante no software de processamento de imagem de sua escolha.
4. Na planilha, selecione 10 pontos de tempo consecutivos durante o registro da linha de base na etapa 5.10 como uma linha de base representativa. Calcule a média e o desvio padrão.
5. Para obter ΔF/F como uma porcentagem, calcule ((F - média da linha de base F)/média da linha de base F)*100) para cada ponto de tempo. Para obter ΔF/F como um escore z, calcule ((F - média da linha de base F)/desvio padrão da linha de base F) para cada ponto de tempo.
6. Para calcular a mudança de pico na fluorescência durante a estimulação, selecione 3 pontos consecutivos com a fluorescência mais alta e calcule a média.
7. Repita para cada pilha de imagens entre estímulos e moscas.
   NOTA: Adapte essas etapas conforme necessário com base no microscópio específico, na qualidade do sinal e no software de análise de imagem preferido.

A Figura 1 fornece detalhes da câmara de imagem (Figura 1A, B) e da ponta da cera (Figura 1D) usada nesta preparação. A Figura 1 também ilustra as principais etapas do procedimento para montar moscas (Figura 1C), encerar a tromba no lugar (Figura 1E), dissecar sobre a região cerebral de interesse (Figura 1F) e estimular o labelo com um saborizante enquanto registra a fluorescência no cérebro (Figura 1G). Para quantificar as respostas induzidas pelo paladar em neurônios receptores gustativos primários (GRNs) de moscas Drosophila melanogaster com expressão motriz Gr64f-Gal4 de UAS-GCaMP6f foram produzidas para obter o indicador de cálcio geneticamente expresso em todos os GRNs "doces" sensíveis ao açúcar do labelo 14,27,30,32,33,34,35. Para esses experimentos, foi utilizado um microscópio confocal com os seguintes componentes: microscópio fluorescente vertical com câmera sCMOS de 40 fps, objetivas de 10x e 40x, disco giratório confocal, emissores dicróicos de 488 e lasers de estado sólido de 488 nm. A objetiva de 40x foi imersa em AHL e centrada na região cerebral da SEZ para localizar o sinal GCaMP basal nos terminais axônicos desses GRNs labelares (Figura 2A). Uma imagem de fluorescência foi capturada a cada 100 ms durante a linha de base (sem estimulação), durante 5 s de estimulação do paladar (estimulador movido sobre o labelo) e após a estimulação até que a fluorescência retornasse à linha de base (Figura 2A, B). A água foi usada como controle negativo e a sacarose 1 M foi usada como controle positivo. A mudança relativa na fluorescência foi calculada como ΔF / F (escore z) para 13 moscas e plotada ao longo do tempo para mostrar a cinética das respostas de cálcio durante a estimulação do paladar (Figura 2B). O pico ΔF / F (escore z) foi plotado e usado para comparações estatísticas para indicar que a resposta da sacarose nessas células é significativamente maior do que na água (Figura 2C). Esta técnica captura que os GRNs "doces" têm um pico forte no início da sacarose que permanece alto com alguma decadência durante o período de estimulação.

Para comparação, este protocolo foi repetido em moscas com um driver diferente, Gr66a-Gal4, expressando UAS-GCaMP6f especificamente em todos os GRNs "amargos" no labelo 14,17,28,34,36. Da mesma forma, os terminais axônicos desses GRNs estavam localizados na SEZ: observe que o padrão de projeção é distinto dos GRNs sensíveis ao açúcar (Figura 2D). A fluorescência foi capturada e analisada como antes, exceto para cafeína 100 mM, que foi usada como controle positivo. A curva média de 11 moscas mostra um forte pico com o início da estimulação da cafeína, mas também há uma pequena resposta "off" com a remoção do estímulo que é conhecida por ocorrer com certos estímulos amargos²⁸ (Figura 2E). Este método permite que as respostas "on" e "off" sejam quantificadas para caracterizar os padrões temporais das respostas induzidas pelo paladar^27,28. Aqui, apenas os picos "ligados" foram quantificados para indicar que a resposta à cafeína é significativamente mais forte do que a água (Figura 2F). Os experimentos na Figura 2 são altamente reproduzíveis e podem ser usados para garantir que o protocolo esteja funcionando corretamente.

Figura 1: Ilustrações de protocolo para imagens de respostas induzidas pelo paladar no cérebro de Drosophila . (A) Vista superior da câmara de imagem personalizada usada para montar até cinco moscas por vez. (B) Detalhes da câmara de imagem onde as moscas são montadas com medições que se encaixam confortavelmente no colo do útero de D. melanogaster. (C) Gráficos indicando onde aparar o tarso (canto superior esquerdo) e como montar a braguilha na fenda do colo do útero da câmara de imagem usando uma pinça (canto inferior esquerdo). Foto de uma mosca montada na posição correta na câmara de imagem (à direita). (D) Foto da ponta da cera (esquerda), foto ampliada da ponta para indicar a forma e o tamanho aproximados do alvo ao usar uma pedra de amolar para modificar a ponta padrão (direita). (E) Ilustração gráfica de encerar a tromba no lugar usando uma pinça (esquerda), foto de uma mosca montada com um labelo devidamente encerado (direita). (F) Ilustração gráfica representando a dissecção sobre a região cerebral de interesse e aplicação de AHL (à esquerda), foto de uma mosca com círculos pontilhados ao redor da área da cutícula a ser removida ao atingir as regiões cerebrais SEZ ou SMP. X indica regiões da cutícula a serem pinçadas para dissecção (direita). (G) Gráficos e fotos indicam a posição da mosca montada/dissecada, a objetiva de imersão em água no AHL, o estimulador com saborizante sobre a tromba e a lamínula formando uma barreira entre essas soluções. A vista lateral diminuiu o zoom (esquerda) e a vista superior estava sob a objetiva de 10x (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de respostas de cálcio de GRNs rotulares a estímulos gustativos. (A) Captura de uma pilha de imagens indicando o nível de fluorescência de GCaMP em uma mosca com Gr64f>GCaMP6f na linha de base e durante o pico de resposta à sacarose 1 M, barra de escala = 20 μm. As linhas pontilhadas indicam o ROI para análise. (B) Curvas de resposta de cálcio para n = 14 moscas calculadas como ΔF/F (escore z) e combinadas para água (controle negativo) e sacarose 1 M (controle positivo) para mostrar cinética; A linha preta sob as curvas indica quando o estímulo está sobre o labelo. (C) Pico ΔF / F (escore z) para cada mosca plotado para comparações estatísticas. Teste t pareado, ****p < 0,0001. (D) Captura de um vídeo indicando o nível de fluorescência de GCaMP em uma mosca com Gr66a>GCaMP6f no início e durante o pico de resposta a 100 mM de cafeína, barra de escala = 20 μm. As linhas pontilhadas indicam o ROI para análise. (E) Curvas de resposta de cálcio para n = 11 moscas calculadas como ΔF / F (escore z) e combinadas para água (controle negativo) e cafeína 100 mM (controle positivo) para mostrar cinética: observe a pequena resposta "desligada", a linha preta sob as curvas indica quando o estímulo está sobre o labelo. (F) Pico ΔF/F (escore z) para cada mosca plotado para comparações estatísticas. Teste t pareado, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um dos aspectos mais desafiadores deste protocolo é a destreza de micromanipulação necessária para encerar o labelo e realizar as dissecções direcionadas. Uma etapa adicional para proteger o labelo é necessária para estimular cada sensillum uniformemente neste órgão sensorial e visualizar as regiões cerebrais de interesse. A câmara de imagem personalizada usada aqui é otimizada para D. melanogaster, mas as especificações da câmara e a abordagem de depilação podem precisar ser modificadas para outros insetos. Este protocolo pode ser aplicado a outros drosofilídeos com pouca modificação, mas outros membros da subordem Brachycera, como abelhas e mosquitos, podem exigir alterações nas etapas de montagem e dissecção para levar em conta as diferenças no palpo labial e na morfologia da cabeça. O alinhamento do micromanipulador para a entrega do saborizante também pode ser desafiador e requer testes iniciais com o estágio específico do microscópio para otimização. Se a cera for quebrada durante a estimulação, isso pode resultar em vazamentos em que o AHL e o saborizante no capilar entram em contato. Puxar os capilares e lixá-los com uma pedra de amolar para se encaixar mais de perto no labelo pode ajudar a evitar que o saborizante e o AHL entrem em contato. Moscas com vazamentos ou movimento cerebral excessivo devem ser excluídas. Quando possível, sempre inclua um controle positivo para cada animal para garantir que o labelo e os nervos labelares não sejam danificados pela depilação ou dissecção. Os exemplos "doce" e "amargo" mostrados aqui são recomendados como experimentos de controle robustos.

A abordagem de imagem de cálcio in vivo descrita aqui foi usada para quantificar as respostas induzidas pelo paladar em neurônios gustativos primários, neurônios de ordem superior e toda a SEZ em D. melanogaster para identificar receptores e circuitos gustativos ^{8,14,17,18,19,20,27,28,30,31,} 34,35,36,37,38,39,40,41^,
42,43,44,45,46,47,48. As aplicações generalizadas neste organismo modelo são devidas aos drivers Gal4 e split-Gal4 prontamente disponíveis; assim, a necessidade de insetos geneticamente modificados obterem GCaMP expresso em neurônios específicos de interesse é um fator limitante para essa abordagem. Felizmente, com os avanços na tecnologia de edição de genes, isso está se tornando mais acessível para insetos além dos organismos modelo, e respostas induzidas pelo sabor usando imagens de cálcio foram recentemente relatadas para a praga Drosophila suzukii⁴⁹ e para mosquitos portadores de vetores⁵⁰. Como acontece com todas as imagens de cálcio, alguma otimização inicial de sinal-ruído pode ser necessária para os neurônios-alvo de interesse. Os sinais podem ser aprimorados usando versões mais brilhantes do GCaMP e expressando duas cópias do GCaMP. A co-expressão de RFP em neurônios-alvo pode ajudar a visualizar os neurônios-alvo na linha de base e pode servir como um controle para o movimento cerebral em regiões que têm propensão a pulsar.

Este protocolo foi projetado especificamente para isolar a quimiossensação do labelo, removendo o tarso e as antenas, encerando sobre os palpos maxilares e limitando a ingestão para que nenhum GRNs faríngeo seja estimulado. No entanto, ajustes nesse protocolo podem ser feitos para incluir quimiossensação de GRNs tarsais ou faríngeas. Se os tarsos forem deixados intactos, as pernas podem ser estimuladas sozinhas ou além do labelo, criando uma grande bolha de solução gustante no final do capilar. Existe o potencial de uma mosca chutar e mover a lamínula se os tarsos forem deixados intactos; Portanto, encerar o tarso perto da base pode ser considerado para ajudar a evitar movimentos indesejados. O exemplo atual inclui a etapa de corte do esôfago para evitar a estimulação faríngea do GRN e para melhor visualizar as projeções labelares na SEZ, mas essa mesma preparação foi previamente adaptada para quantificar as respostas do GRN faríngeo, deixando o esôfago intacto e visualizando as projeções laterais da faringe³⁶. Esta aplicação anterior usava um estímulo apetitivo de açúcar, que as moscas consumiam livremente para estimular os GRNs faríngeos, mas as moscas não consumiam prontamente um estímulo aversivo para ativar os GRNs amargos da faringe, o que é uma limitação dessa abordagem. Uma limitação adicional é que as respostas de GRNs localizadas nas asas de Drosophila¹¹ não podem ser prontamente estudadas com essa abordagem.

Embora a imagem de cálcio in vivo descrita aqui tenha se tornado o método padrão para estudar respostas induzidas pelo sabor de ordem superior ^{8,18,19,20,28}, existem atualmente várias outras abordagens para quantificar as respostas GRN rotulares primárias a saborizantes em moscas. A abordagem de imagem de cálcio in vivo descrita aqui registra alterações de GCaMP nos terminais axônicos no cérebro, mas uma abordagem ex vivo também foi usada para quantificar GCaMP do corpo celular em GRNs labelares³³. Da mesma forma, outra abordagem de montagem foi descrita para imagens dos corpos celulares de GRNs labelares ou tarsais em moscas intactas⁵¹. A eletrofisiologia continua a ser uma técnica popular e eficaz para estudar as respostas dos neurônios gustativos primários em insetos 13,16,32,52,53,54,55,56,57,58,59,60,64,62^,63,64,65. Isso não requer a necessidade de sensores de cálcio geneticamente codificados e é uma quantificação mais direta da atividade neuronal. No entanto, as respostas de apenas uma sensila podem ser registradas por vez, enquanto a imagem de cálcio pode registrar uma população completa de GRNs simultaneamente. A abordagem de imagem de cálcio foi usada para descobrir a dinâmica temporal única das respostas "on" e "off" em GRNs com certos estímulos^27,28, mas um avanço recente nos registros eletrofisiológicos da base da sensila gustativa em D. melanogaster agora permite que as respostas "off" sejam quantificadas no nível dos potenciais de ação⁵³. Curiosamente, a modulação da sensibilidade primária do GRN pela fome foi detectada por meio de imagens de cálcio, mas não no nível dos potenciais de ação com eletrofisiologia²⁹, mas tanto os registros eletrofisiológicos das pontas quanto as imagens de cálcio podem capturar uma mudança na sensibilidade do GRN com a dieta^30,66. Assim, a eletrofisiologia continua sendo uma abordagem importante e complementar à imagem de cálcio para identificar ligantes e receptores gustativos e para entender como vários fatores modulam a sensibilidade dos neurônios receptores gustativos primários.

Os autores não têm conflitos de interesse e nada a divulgar.

Gostaríamos de agradecer ao Bloomington Drosophila Stock Center pelos estoques de moscas e ao IMF Labs da Universidade de Vermont por sua ajuda na fabricação das câmaras de imagem personalizadas. Também gostaríamos de agradecer à BioRender pela criação de ilustrações gráficas e a Kayla Audette por contribuir para o design desses gráficos. Este trabalho foi apoiado por novos fundos iniciais de laboratório da Universidade de Vermont e do prêmio número 2332375 da National Science Foundation. Os gráficos da Figura 1 foram gerados com www.BioRender.com.