생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

칼슘 이미징 접근법은 용액이 라벨에 적용되는 동안 깨어 있는 파리의 뇌에서 미각 유도 반응을 기록할 수 있습니다. Drosophila melanogaster 의 1차 미각 반응이 예로 사용되지만 이 프로토콜은 다운스트림 뉴런 또는 다른 종을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

거의 20년 동안 생체 내 칼슘 이미징은 초파리 모델 유기체인 Drosophila melanogaster의 미각 자극에 대한 세포 반응을 측정하는 효과적인 방법이었습니다. 이 방법론의 주요 강점은 마취 없이 깨어 있는 동물에서 미각에 의한 신경 반응을 기록하는 능력입니다. 이 접근법은 이진 발현 시스템(예: Gal4-UAS)을 사용하여 관심 있는 특정 뉴런에서 칼슘 지표 GCaMP를 발현합니다. 이 프로토콜은 GCaMP를 발현하는 파리를 라벨럼이 단단히 배치된 상태로 장착하여 용액을 라벨럼에 적용하는 동안 컨포칼 현미경에서 뇌의 형광을 밀리초 해상도로 기록하여 모든 라벨라 미각 센실라를 자극하는 절차를 설명합니다. 제공된 예는 D. melanogaster의 1차 미각 수용체 뉴런의 칼슘 반응에 초점을 맞췄습니다. 그러나 이 접근 방식은 초파리류 또는 다른 곤충 종의 뇌 내 관심 있는 다른 뉴런에서 기록하도록 조정할 수 있습니다. 이 이미징 방법을 통해 연구자들은 라벨 전체에 걸쳐 미각 뉴런 그룹의 집단 칼슘 반응을 동시에 기록하여 개별 뉴런의 활동 전위를 정량화하는 전기생리학적 팁 기록을 보완할 수 있습니다. 여기에 설명된 생체 내 칼슘 이미징 기술은 화학 감각의 분자 및 세포 메커니즘을 밝히고, 1차 미각 뉴런에서 고유한 시간 반응 패턴을 식별하고, 미각 조절 메커니즘을 조사하고, 다운스트림 회로에서 미각 처리를 탐구하는 데 중요한 역할을 했습니다.

초파리(Drosophila melanogaster)는 이 모델 유기체에서 사용할 수 있는 강력한 유전자 연구 도구로 유명합니다. 이러한 도구는 표적 세포의 특정 유전자를 쉽게 조작할 수 있는 기능을 제공하므로 시각 및 화학 감각과 같은 기본 신경 회로를 탐색하는 데 이상적입니다 ^1,2,3. 접촉 화학감각을 통한 구스테이션은 먹이, 짝짓기, 번식, 그리고 궁극적으로 동물의 생존과 적응과 관련된 행동을 조절하는 핵심 신경 경로입니다 4,5,6,7,8,9. 이 중요한 화학감각 정보가 어떻게 인코딩되고 전달되는지 이해하려면 미각 자극에 의해 활성화되는 회로의 뉴런 활동을 설명해야 합니다.

D. melanogaster에서 외부 미각 수용체 뉴런(GRN)은 앞다리, 및 날개^10,11에 있습니다. 주둥이의 끝에 있는 표지는 크기에 따라 형태학적으로 매핑할 수 있는 sensilla라고 하는 머리카락과 같은 구조를 포함합니다: 긴 (L-형), 중간 (I-형) 및 짧은 (S-형)¹⁰. 대부분의 GRN은 이 감각 기관에 집중되어 있으며, 각 감각은 2-4가지 유형의 GRN을 포함하고 있으므로 각 미각 양식은 라벨 ^12,13,14,15에 퍼져 있습니다. 전기생리학적 팁 기록은 단일 sensilla¹⁶에서 GRN에서 오는 활동 전위를 정량화하는 데 사용할 수 있지만, 생체 내에서 칼슘 이미징은 전체 라벨^14,17에 걸쳐 특정 유형의 GRN의 활성을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 동일한 칼슘 이미징 기술은 다운스트림 미각 회로의 신경 반응을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다 18,19,20. 칼슘 이미징은 Gal4-UAS 21,22,23과 같은 이진 발현 시스템을 필요로 하며, 관심 뉴런에서 GCaMP의 발현을 얻기 위해 세포 특이적 전사 활성인자를 포함하는 드라이버 라인을 이펙터 라인으로 교차해야 합니다. 세포 내 칼슘 수치가 상승하면 이러한 유전적으로 암호화된 칼슘 지표는 형광 강도를 증가시켜 형광 수준이 뉴런 활동의 변화와 상관관계가 있습니다^24,25.

여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 생체 내에서 미각 자극에 대한 신경 반응을 관찰하는 방법이 설명됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 깨어 있는 파리의 뇌에서 미각 유도 신경 반응을 정량화하기 위해 labellar GRN만 자극하는 것입니다. 이 방법을 사용하여 D. melanogaster에서 labellum의 1차 GRN에 반응을 기록하는 예가 제공되며 이 접근 방식을 사용할 때의 이점과 과제에 대해 설명합니다. 이 제제는 실험자가 컨포칼 현미경 아래에서 고정된 파리 라벨럼에 타스탄트 용액을 적용하여 전체 감각 기관이 자연 환경에서 발생하는 용액에 잠겼을 때 신경 반응을 기록할 수 있는 기능을 제공하기 위해 개발되었습니다. 여기에 설명된 생체 내 칼슘 이미징 접근법은 새로운 타스타탄트-수용체 상호 작용 ^8,14,26,27, GRN 반응 ^27,28의 시간적 세부 사항, GRN 조절의 분자 메커니즘^29,30 및 다운스트림 회로에서의 미각 처리 ^{8,18,19,20, 28,31}.

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 성인 혈림프와 같은(AHL) 용액의 제조

1. 108mM의 NaCl, 5mM의 KCl, 4mM의 NaHCO₃, 1mM의 NaH2PO4, 5mM의HEPE 및 15mM의 리보스를 포함하는 원액을 준비합니다.
   참고: 리보오스는 뇌의 영양 수치를 변경하지 않고 삼투압을 유지하기 위해 비에너지 설탕으로 사용됩니다.
2. 4°C에서 여과 및 보관하기 전에 이 용액의 pH를 7.5로 조정하십시오. pH를 조정한 후 AHL의 삼투압을 확인하여 제제 전반에 걸쳐 일관성을 확인하십시오.
3. 1M의 CaCl₂ 와 1M의 MgCl₂를 별도로 준비하고 여과하여 실온에서 보관합니다.
4. 주요 AHL 스톡의 부분 표본을 준비하려면 소량의 칼슘과 마그네슘을 첨가하여 2mM의 칼슘과 8.2mM의 마그네슘의 최종 농도를 얻습니다. 이 AHL은 4°C에서 보관할 수 있으며 실험을 위해 실온으로 가져온 소량의 분취액을 사용하여 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.

2. 이미징 챔버에 파리를 장착합니다.

1. 파리를 장착하기 전에 숫돌을 사용하여 치과용 왁서의 끝을 작고 뾰족한 컵으로 깎습니다(그림 1D). 뾰족한 팁을 왁서에 부착하고 전원을 켜서 예열합니다. 열 설정은 팁의 유형과 길이에 따라 다릅니다: 왁스가 접촉 시 녹은 상태를 유지할 수 있는 최소 온도가 필요합니다(이 예에서는 50.5°C가 작동함).
   알림: 치과용 왁서의 끝 부분에 와이어를 감아 대안으로 날카로운 금속 팁을 부착할 수 있습니다.
2. 1-5마리의 파리를 부드럽게 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). CO₂ 또는 추위에 장기간 노출되면 행동에 영향을 줄 수 있으므로 마취 노출 시간을 최소화하십시오. CO₂의 경우 해부 현미경에서 99.9L/분의 속도로 2% CO₅ 의 연속적이고 균일한 흐름을 제공하는 플라이 패드를 사용합니다.
3. 해부 가위를 사용하여 대퇴골/경골 관절의 중간 다리와 뒷다리를 절단하고 전자골에서 앞다리를 절단하여 다리의 일부를 제거합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 파리를 조작하는 데 도움을 줍니다. 타르시를 다듬으면 족근 감각과 커버슬립 또는 미각 자극제가 발길질되는 것을 방지할 수 있습니다.
4. 뭉툭한 집게를 사용하여 날개로 파리를 집어 머리는 이미징 챔버의 대상 자궁 경부 슬롯 위에 있지만 몸통은 아래에 있도록 파리를 배치합니다. 플라이를 오른쪽이나 왼쪽으로 완전히 시작하는 것이 도움이 됩니다. 가위의 뭉툭한 면과 뭉툭한 집게를 사용하여 머리와 흉부를 동시에 슬롯에 부드럽게 밀어 넣습니다.
5. 슬롯 내부에 단단히 고정되면 플라이를 슬롯 뒤쪽으로 밀고 플라이가 챔버 앞쪽을 향하도록 부드럽게 위치를 변경합니다. 머리를 흉부와 정렬되지 않도록 너무 많이 회전하지 마십시오.
6. 필요한 만큼 파리에 대해 반복합니다(이 이미징 챔버는 최대 5마리의 파리를 장착할 수 있음).
7. 이쑤시개 끝에 매니큐어를 한 방울 떨어뜨리고 파리의 머리를 이미징 챔버에 고정하기 위해 얇게 코팅합니다.
   참고: 매니큐어를 바르는 정확한 영역은 뇌의 어느 부분이 영상화되는지에 따라 다릅니다. SEZ(그림 참조) 또는 기타 하부 내측 영역을 이미징하는 경우 매니큐어를 플라이 헤드 상단에 넉넉하게 적용할 수 있지만, 우수한 내측 영역을 이미징하기 위해 매니큐어를 머리 상단에 최소한으로 바르고 눈 근처에 측면으로 추가하여 이 영역을 해부할 수 있도록 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 후각 없이 미각 자극에만 최적화되어 있지만 매니큐어 휘발성 물질이 우려되는 경우 플라이 헤드를 고정하기 위한 대체 방법으로 왁스 또는 UV 접착제를 사용하십시오.

3. 확장된 위치에서 주둥이를 왁싱하기

1. 한 손으로 왁서를 집어 들고 끝에 작은 왁스 방울을 모으십시오.
2. 반면에 반쯤 날카로운 집게를 사용하여 한쪽 상악 손바닥을 잡고 코를 부드럽게 당겨서 완전히 펴십시오.
   알림: 주둥이의 큐티클을 꼬집으면 손상 가능성이 높아지므로 상악 손바닥만 잡도록 주의하십시오. 주둥이가 끼거나 표피에 구멍이 뚫린 경우 진행하지 마십시오. 왁스를 바르는 동안 흡입을 사용하여 주둥이를 빼내기 위해 집게 대신 작은 파리 똥을 사용할 수 있습니다.
3. 왁스가 흐르기 시작할 때까지 왁서의 끝을 바닥 근처의 챔버에 대고 코의 바닥과 접촉하도록 움직입니다. 샤프트 중간에 왁스를 바르되 왁스 또는 왁서로 labellar sensillae를 만지지 마십시오. 이쪽의 왁스는 주둥이를 제자리에 고정합니다. 센실라가 왁스나 왁서에 닿은 경우 언제든지 진행하지 마십시오.
4. 반대쪽에는 위의 방법을 사용하여 왁스를 바르고 위에 왁스를 연속적으로 다리를 만듭니다.
5. 주둥이를 가능한 한 똑바로 펴십시오. 필요한 경우 왁스를 다시 가열하고 주둥이를 원하는 위치로 부드럽게 밀어 주둥이를 이동할 수 있습니다.
6. 다른 파리가 같은 챔버에 장착되도록 반복합니다.
7. CO₂ 를 끄거나 얼음 마취에서 파리를 제거하십시오. 회복을 위해 장착된 플라이를 습도 챔버에 60분 동안 놓습니다(보푸라기가 없는 젖은 물티슈가 있는 깨끗하고 빈 피펫 팁 상자).

4. 관심 있는 뇌 영역을 드러내기 위한 해부

1. 습도 챔버에서 파리를 제거하십시오. 파리는 분명히 살아 있어야 하며 복부, 다리 및 더듬이를 적극적으로 움직여야 합니다. 해부 전에 컨포칼 또는 이광자 현미경을 설정합니다.
2. 왁서를 켜서 해부 중 왁스의 잠재적인 파손을 수리하고 실온 AHL을 준비합니다.
3. 매우 날카로운 집게를 사용하여 양쪽 더듬이를 집은 다음 큐티클을 꼬집어 날카로운 집게의 한쪽을 삽입할 구멍을 만듭니다. 큐티클 아래에 있는 집게를 움직여 관심 있는 뇌 영역을 덮고 있는 영역에서 큐티클을 제거합니다. 그림 1F 는 제거할 집게로 표적으로 삼을 큐티클 영역에 대한 X를 나타냅니다.
4. AHL(~100μL)을 머리에 넉넉하게 바르고 얇은 AHL 층을 제외한 모든 AHL을 제거하여 뇌가 건조해지는 것을 방지하여 노출된 뇌를 AHL로 씻어냅니다.
   알림: 왁스가 어느 지점에서든 파손되어 수리해야 하는 경우 왁스를 다시 가열하기 전에 머리 주위의 모든 AHL을 잠시 제거하여 주둥이를 확장된 위치에 다시 고정하십시오.
5. 날카로운 집게를 사용하여 공기 주머니와 뇌를 덮고 있는 큰 파편을 제거합니다. 집게의 끝을 보이게 하여 뇌를 관통하지 않도록 하십시오.
6. AHL로 ~3회 세척하여 작은 이물질을 모두 제거합니다.
7. 관심 있는 뇌 영역이 명확하게 보이는지 확인합니다. 이 예에서와 같이 식도하 영역(SEZ)을 구체적으로 이미지화하려면 매우 날카로운 집게로 꼬집어 식도를 제거하여 근처의 기저부와 뇌를 통과하는 지점 근처에서 식도를 절단하고 이 조각을 제거하여 SEZ를 노출시킵니다.
   참고: 파리는 식도를 제거한 후 용액을 섭취할 수 없으며 인두 GRN 활성화가 발생할 수 없습니다.
8. 해부 현미경 아래에서 10mm x 20mm 커버슬립을 이미징 챔버의 각진 슬롯에 배치합니다. 왁스를 깨뜨리지 않고 바닥에 놓이는지 확인하십시오. 라벨의 끝이 커버슬립에 닿지 않아야 합니다.

5. 이미징 및 미각 자극

1. 컨포칼 또는 이광자 현미경을 켜고 이미지 캡처를 준비합니다. 현미경 스테이지에 있는 동안 파리에게 tastant를 전달할 수 있도록 배치된 모세관 튜브가 있는 micromanipulator를 설정합니다.
   참고: 이광자 이미징은 뇌 조직의 더 깊은 곳에 있는 뉴런에서 형광을 캡처할 수 있습니다.
2. ~2 μL의 물(또는 다른 음의 대조군)을 모세관에 로드합니다.
   현미경 스테이지의 자극기.
3. 절개된 파리를 찾고 10x 공기 침수 명시야를 사용하여 labellum에 초점을 맞춥니다. 캐필러리를 이 보기 아래의 labellum에 맞춥니다. 파리의 labellum을 가리키는 추가 카메라를 포함하여 여러 각도에서 모세관과 파리의 정렬을 볼 수 있습니다.
   알림: 정렬하는 동안 모든 labellar sensilla가 용액으로 자극되고 있는지 확인하십시오. 자극기 또는 라벨의 위치가 이를 위해 충분히 수직이 아닌 경우 그에 따라 조정하십시오. 모세 혈관은 labellum 주위에 더 단단히 맞도록 숫돌로 당겨 줄 놓을 수 있습니다.
4. 모세관을 labellum 바로 앞에 두고 가까이 두되 닿지 않도록 합니다.
5. 뇌의 관심 영역이 중앙에 오도록 스테이지를 이동하고 더 높은 배율의 물 침수 목표(이 예에서는 40배 사용)로 전환합니다.
6. 뇌 상단에 약 200μL의 AHL을 추가하여 침수 대상과 접촉합니다. 거품을 제거합니다.
7. 명시야를 사용하여 z-평면에서 조심스럽게 움직여 제거된 큐티클의 가장자리를 찾고 관심 있는 뇌 영역을 중앙에 배치합니다.
8. 488nm 레이저 출력으로 전환하여 관심 영역에서 GCaMP 발현을 찾습니다.
   알림: 드라이버 라인과 사용된 GCaMP 버전에 따라 개별 준비를 위한 신호 대 잡음을 증폭하기 위해 일부 초기 최적화가 필요할 수 있습니다. RFP를 함께 발현하면 기준선이 낮은 GCaMP 형광을 가진 뉴런에 도움이 될 수 있습니다.
9. 타임랩스 이미지 컬렉션을 준비합니다. 속도는 특정 현미경 및 GCaMP 신호에 따라 다르지만 ~100ms마다 하나 이상의 이미지를 캡처하는 것이 최적입니다.
   참고: 시간이 지남에 따라 형광의 단일 Z-평면을 캡처하면 캡처 속도가 최적화되어 자세한 칼슘 역학을 제공할 수 있습니다. 각 시점에서 여러 Z 평면에서 촬영한 이미지 스택은 캡처 속도가 느려질 수 있지만 조직의 서로 다른 깊이에 있는 신경돌기에 대한 반응을 기록합니다.
10. 최소 5초의 기준선 형광을 수집한 후 모세관이 특정 시간(이 예에서는 5초) 동안 라벨을 덮도록 자극기를 수동으로 이동한 다음 자극을 제거하고 원하는 만큼 오랫동안 캡처합니다.
11. AHL을 제거하고 10x 명시야로 돌아가 커버슬립, 자극기 및 라벨이 여전히 같은 위치에 있는지 확인합니다.
    참고: 자극기가 labellum과 잘 정렬되지 않거나 너무 많이 회전하면 labellum이 이동하거나 모세관이 이미징 챔버에 부딪혀 왁스가 파손되고 AHL에서 누출이 발생할 수 있습니다.
12. 이미징 챔버를 제거합니다. 보푸라기가 없는 천을 사용하여 첫 번째 용액을 제거하고 피펫을 물로 씻어냅니다. 그런 다음 다음 맛의 ~2 μL를 모세관에 피펫팅합니다.
13. 이미징 챔버를 다시 스테이지로 이동하고 이 용액에 대해 5.4-5.12단계를 반복합니다.
    알림: 대부분의 tastants의 높은 표면 장력은 플라이 라벨에 머무르는 잔류 화학 물질을 나타냅니다. 그러나 타스탄트가 포화도가 높거나 점성이 있는 경우 다음 자극 전에 감각 기관을 씻기 위해 물을 라벨 위로 여러 번 이동할 수 있습니다.
14. 이 플라이에 대해 원하는 만큼 솔루션에 대해 반복합니다.
15. 3단계로 돌아가 이미징을 위한 다음 플라이를 준비합니다.

6. 이미지 분석

1. 이미지 처리 소프트웨어에서 분석할 이미지 스택을 엽니다. 필요한 경우 GCaMP 신호 외부의 영역을 사용하여 배경 빼기를 수행합니다.
2. 자유형 또는 형상 도구를 사용하여 정량화할 투영 주변의 조밀한 관심 영역(ROI)을 선택하고 선택 영역이 스택의 모든 이미지에 적용되었는지 확인합니다.
3. 이 ROI에 대한 시간 경과에 따른 형광 판독값 목록을 생성하고 추가 처리를 위해 스프레드시트로 내보냅니다. ImageJ(FIJI)의 플롯 Z축 프로파일 또는 선택한 이미지 처리 소프트웨어에서 유사한 기능을 사용합니다.
4. 스프레드시트에서 5.10단계의 기준선 기록 중 10개의 연속 시점을 대표 기준선으로 선택합니다. 평균과 표준 편차를 계산합니다.
5. ΔF/F를 백분율로 얻으려면 각 시점에 대해 ((F - 평균 기준선 F)/기준선 평균 F)*100)을 계산합니다. ΔF/F를 z-점수로 얻으려면 각 시점에 대해 ((F - 평균 기준선 F)/표준 편차 기준선 F)를 계산합니다.
6. 자극 중 형광의 피크 변화를 계산하려면 형광이 가장 높은 연속 점 3개를 선택하고 평균을 계산합니다.
7. 자극과 파리에 걸쳐 쌓인 각 이미지에 대해 반복합니다.
   참고: 특정 현미경, 신호 품질 및 선호하는 이미지 분석 소프트웨어에 따라 필요에 따라 이러한 단계를 조정하십시오.

그림 1은 이 준비에 사용된 이미징 챔버(그림 1A, B) 및 왁서 팁(그림 1D)에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그림 1은 또한 파리를 장착하고(그림 1C), 주둥이를 제자리에 왁스칠하고(그림 1E), 뇌의 관심 영역을 절개하고(그림 1F), 뇌의 형광을 기록하면서 꼬리표를 자극하는 절차(그림 1G)의 주요 단계를 보여줍니다. Gr64f-Gal4를 가진 Drosophila melanogaster 파리의 1차 미각 수용체 뉴런(GRN)에서 미각 유도 반응을 정량화하기 위해 UAS-GCaMP6f의 발현을 유도하는 Gr64f-Gal4를 사용하여 라벨 14,27,30,32,33,34,35의 모든 설탕 감지 "달콤한" GRN에서 유전적으로 발현되는 칼슘 지시약을 얻기 위해 생성되었습니다.. 이러한 실험을 위해 40fps sCMOS 카메라, 10x 및 40x 대물렌즈, 회전 디스크 컨포칼, 다이크로익 488 이미터 및 488nm 고체 레이저가 있는 정립 형광 현미경과 같은 구성 요소가 있는 컨포칼 현미경이 사용되었습니다. 40x 대물렌즈는 AHL에 담그고 SEZ 뇌 영역을 중심으로 하여 이러한 labellar GRN의 축삭 말단에서 기준선 GCaMP 신호를 찾았습니다(그림 2A). 기준선 동안(자극 없음), 5초의 미각 자극(자극제가 라벨 위로 이동) 동안, 자극 후 형광이 기준선으로 돌아올 때까지 100ms마다 형광 이미지를 캡처했습니다(그림 2A, B). 물은 음성 대조군으로 사용되었고, 1M 자당은 양성 대조군으로 사용되었다. 형광의 상대적 변화는 13마리의 파리에 대해 ΔF/F(z-score)로 계산되었으며 미각 자극 중 칼슘 반응의 동역학을 보여주기 위해 시간 경과에 따라 플롯되었습니다(그림 2B). 피크 ΔF/F(z-score)를 표시하고 통계적 비교에 사용하여 이러한 세포의 자당 반응이 물보다 유의하게 높다는 것을 나타냅니다(그림 2C). 이 기술은 "달콤한" GRN이 자당 시작 시 강한 피크를 가지며 자극 기간 동안 약간의 감소와 함께 높게 유지된다는 것을 포착합니다.

비교를 위해, 이 프로토콜은 다른 드라이버인 Gr66a-Gal4가 있는 파리에서 반복되었으며, UAS-GCaMP6f를 레이블 14,17,28,34,36의 모든 "쓴" GRN에서 특이적으로 표현했습니다. 유사하게, 이러한 GRN의 축삭 말단은 SEZ에 위치했습니다: 투영 패턴이 설탕 감지 GRN과 구별된다는 점에 주목하십시오(그림 2D). 양성 대조군으로 사용된 100mM 카페인을 제외하고는 이전과 같이 형광을 포착하고 분석했습니다. 11마리의 파리에서 평균한 곡선은 카페인 자극이 시작될 때 강한 피크를 보여주지만, 특정 쓴 자극에서 발생하는 것으로 알려진 자극 제거에 대한 작은 "오프" 반응도 있습니다²⁸ (그림 2E). 이 방법을 사용하면 "켜짐" 및 "꺼짐" 반응을 모두 정량화하여 미각 유도 반응의 시간적 패턴을 특성화할 수 있습니다^27,28. 여기서는 카페인에 대한 반응이 물보다 훨씬 더 강하다는 것을 나타내기 위해 "켜짐" 피크만 정량화되었습니다(그림 2F). 그림 2의 실험은 재현성이 높으며 프로토콜이 제대로 작동하는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1: 초파리 뇌에서 미각 유도 반응을 이미징하기 위한 프로토콜 그림. (A) 한 번에 최대 5마리의 파리를 장착하는 데 사용되는 맞춤형 이미징 챔버의 평면도. (B) 파리가 장착된 이미징 챔버의 세부 사항에는 D. melanogaster의 자궁경부에 편안하게 맞는 측정값이 포함되어 있습니다. (C) tarsi를 트리밍할 위치(왼쪽 상단)와 집게를 사용하여 이미징 챔버의 자궁 경부 슬롯에 파리를 장착하는 방법(왼쪽 하단)을 나타내는 그래픽. 이미징 챔버의 올바른 위치에 장착된 파리의 사진(오른쪽). (D) 왁서 팁 사진(왼쪽), 숫돌을 사용하여 표준 팁을 수정할 때 대상으로 할 대략적인 모양과 크기를 나타내는 팁의 확대/축소 사진(오른쪽). (E) 집게를 사용하여 주둥이를 왁싱하는 그래픽 그림(왼쪽), 적절하게 왁스를 칠한 라벨럼이 장착된 파리 사진(오른쪽). (F) AHL의 관심 영역 및 적용 영역에 대한 해부를 나타내는 그래픽 그림(왼쪽), SEZ 또는 SMP 뇌 영역을 표적으로 할 때 제거할 큐티클 영역 주위에 점선 원이 있는 파리 사진. X는 해부를 위해 꼬집어야 할 큐티클 영역을 나타냅니다(오른쪽). (G) 그래픽과 사진은 장착/해부된 파리의 위치, AHL의 침수 대물렌즈, 위에 타구가 있는 자극기, 이러한 용액 사이에 장벽을 형성하는 커버슬립을 나타냅니다. 측면 뷰는 축소되었고(왼쪽), 상단 뷰는 10x 대물렌즈 아래에 있었습니다(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 미각 자극에 대한 labellar GRN의 칼슘 반응의 예. (A) 기준선에서 Gr64f>GCaMP6f 를 사용한 플라이의 GCaMP 형광 수준을 나타내는 이미지 스택에서 여전히 캡처, 1M 자당에 대한 피크 반응 동안, 스케일 바 = 20μm. 점선은 분석을 위한 ROI를 나타냅니다. (B) n = 14마리의 파리에 대한 칼슘 반응 곡선은 ΔF/F(z-점수)로 계산되고 물(음성 대조군) 및 1M 자당(양성 대조군)에 대해 결합되어 역학을 보여줍니다. 곡선 아래의 검은색 선은 자극이 labellum 위에 있을 때를 나타냅니다. (C) 통계적 비교를 위해 표시된 각 플라이에 대한 피크 ΔF/F(z-점수). 쌍체 t-검정, ****p < 0.0001. (D) Gr66a>GCaMP6f 를 베이스라인에서 사용하고 100mM 카페인에 대한 최대 반응 동안 플라이의 GCaMP 형광 수준을 나타내는 비디오에서 캡처한 이미지, 스케일 바 = 20μm. 점선은 분석을 위한 ROI를 나타냅니다. (E) n = 11마리의 파리에 대한 칼슘 반응 곡선은 ΔF/F(z-점수)로 계산되고 물(음성 대조군) 및 100mM 카페인(양성 대조군)에 대해 결합되어 역학을 보여줍니다: 작은 "꺼짐" 반응에 주목하십시오. 곡선 아래의 검은색 선은 자극이 레이블 위에 있을 때를 나타냅니다. (F) 통계적 비교를 위해 표시된 각 플라이에 대한 피크 ΔF/F(z-점수). 쌍체 t-검정, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 라벨럼에 왁스를 바르고 표적 해부를 수행하는 데 필요한 미세 조작 민첩성입니다. 이 감각 기관 전체에 걸쳐 각 감각을 고르게 자극하고 관심 있는 뇌 영역을 시각화하기 위해 라벨을 고정하기 위한 추가 단계가 필요합니다. 여기에 사용된 맞춤형 이미징 챔버는 D. melanogaster에 최적화되어 있지만 챔버의 사양과 왁싱 접근 방식은 다른 곤충에 대해 수정해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 거의 수정하지 않고 다른 초파리류 에 적용할 수 있지만, 꿀벌 및 모기와 같은 Brachycera 하위 목의 다른 구성원은 순 손바닥과 머리 형태의 차이를 설명하기 위해 장착 및 해부 단계를 변경해야 할 수 있습니다. tastant 전달을 위한 micromanipulator의 정렬도 어려울 수 있으며 최적화를 위해 특정 현미경 스테이지를 사용한 초기 테스트가 필요합니다. 자극 중에 왁스가 파손되면 모세혈관의 AHL과 tastant가 접촉하는 누출이 발생할 수 있습니다. 모세혈관을 당겨 라벨럼에 더 밀접하게 맞도록 숫돌로 정리하면 tastant와 AHL이 접촉하는 것을 방지할 수 있습니다. 누출 또는 과도한 뇌 움직임이 있는 파리는 제외해야 합니다. 가능하면 왁싱 또는 박리로 인해 labellum 및 labellar 신경이 손상되지 않도록 항상 각 동물에 대한 positive control을 포함하십시오. 여기에 표시된 "달콤한" 및 "쓴맛"의 예는 강력한 대조 실험으로 권장됩니다.

여기에 설명된 생체 내 칼슘 이미징 접근법은 미각 수용체 및 회로를 식별하기 위해 D. melanogaster의 1차 미각 뉴런, 고차 뉴런 및 전체 SEZ에서 미각 유도 반응을 정량화하는 데 사용되었습니다 ^{8,14,17,18,19,20,20,27,28,30,31,} 34,35,36,37,38,39,40,41^,
42,43,44,45,46,47,48입니다. 이 모델 유기체의 광범위한 응용 프로그램은 쉽게 구할 수 있는 Gal4 및 split-Gal4 드라이버 때문입니다. 따라서, 유전적으로 변형된 곤충이 관심 있는 특정 뉴런에서 GCaMP를 발현해야 할 필요성은 이 접근법의 한 가지 제한 요인입니다. 다행히도 유전자 편집 기술의 발전으로 모델 유기체를 넘어 곤충에서도 이에 더 쉽게 접근할 수 있게 되었으며, 최근에는 해충 초파리 스즈키(Drosophila suzukii)⁴⁹)와 매개체 운반 모기(⁵⁰)에 대해 칼슘 이미징을 사용한 미각 유도 반응이 보고되었습니다. 모든 칼슘 이미징과 마찬가지로, 관심 있는 표적 뉴런에 대해 신호 대 잡음(signal-to-noise)의 일부 초기 최적화가 필요할 수 있습니다. 더 밝은 버전의 GCaMP를 사용하고 GCaMP의 두 복사본을 표현하여 신호를 향상시킬 수 있습니다. 표적 뉴런에서 RFP를 공동 발현하면 기준선에서 표적 뉴런을 시각화하는 데 도움이 될 수 있으며 맥동 경향이 있는 영역에서 뇌 움직임을 제어하는 역할을 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 tarsi와 antennae를 제거하고, 상악 손바닥을 왁싱하고, 인두 GRN이 자극되지 않도록 섭취를 제한하여 labellum에서 화학 감각을 분리하도록 특별히 설계되었습니다. 그러나 이 프로토콜에 대한 조정은 족근 또는 인두 GRN의 화학 감각을 포함하도록 이루어질 수 있습니다. tarsi가 손상되지 않은 상태로 유지되면 모세혈관 끝에 큰 미침 용액 거품을 만들어 다리를 단독으로 또는 labellum 외에 추가로 자극할 수 있습니다. tarsi가 손상되지 않은 경우 파리가 커버슬립을 걷어차고 움직일 가능성이 있습니다. 따라서 바닥 근처에서 tarsi를 왁싱하는 것은 원치 않는 움직임을 방지하는 데 도움이 되는 것으로 간주될 수 있습니다. 현재의 예시는 인두 GRN 자극을 피하고 SEZ에서 라벨 돌기를 더 잘 시각화하기 위해 식도를 절단하는 단계를 포함하지만, 이 동일한 제제는 식도를 온전하게 유지하고 측면 인두 돌기를 이미징하여 인두 GRN 반응을 정량화하기 위해 이전에 적용되었습니다³⁶. 이 이전 응용 프로그램은 식욕을 돋우는 설탕 자극을 사용했는데, 이는 파리가 인두 GRN을 자극하기 위해 자유롭게 소비하지만 파리는 쓴 인두 GRN을 활성화하기 위해 혐오스러운 자극을 쉽게 소비하지 않으며, 이는 이 접근 방식의 한 가지 제한 사항입니다. 또 다른 한계는 초파리¹¹ 의 날개에 위치한 GRN의 반응을 이 접근법으로 쉽게 연구할 수 없다는 것입니다.

여기에 설명된 생체 내 칼슘 이미징은 고차 미각^{유도 반응을 연구}하기 위한 표준 방법이 되었지만8,18,19,20,28, 현재 파리의 tastant에 대한 1차 라벨 GRN 반응을 정량화하기 위한 몇 가지 다른 접근 방식이 있습니다. 여기에 설명된 생체 내 칼슘 이미징 접근법은 뇌의 축삭 말단에서 GCaMP 변화를 기록하지만, 라벨라 GRN에서 세포체 GCaMP를 정량화하기 위해 생체 외 접근법도 사용되었습니다³³. 유사하게, 온전한 파리에서 labellar 또는 tarsal GRN의 세포체를 이미징하기 위한 또 다른 장착 접근법이 설명되었습니다⁵¹. 전기생리학은 곤충^{13,16,32,52,53,54,55,56,57,58,59,60,64,62}에서 1차 미각 뉴런의 반응을 연구하는 데 널리 사용되고 효과적인 기술입니다.^,63,64,65. 이것은 유전적으로 암호화된 칼슘 센서의 필요성을 필요로 하지 않으며 신경 세포의 활동을 보다 직접적으로 정량화합니다. 그러나 한 번에 하나의 sensilla의 반응만 기록할 수 있는 반면 칼슘 이미징은 전체 GRN 모집단에서 동시에 기록할 수 있습니다. 칼슘 이미징 접근법은 특정 자극에 대한 GRN에서 "켜짐" 및 "꺼짐" 반응의 고유한 시간적 역학을 발견하는 데 사용^{되었지만,} D. melanogaster의 미각 sensilla 기저에서 전기 생리학적 기록의 최근 발전으로 이제 활동 전위 수준에서 "꺼짐" 반응을 정량화할 수 있습니다⁵³. 흥미롭게도, 배고픔에 의한 1차 GRN 민감도의 조절은 칼슘 이미징을 통해 감지되었지만 전기생리학²⁹의 활동 전위 수준에서는 감지되지 않았지만, 전기생리학적 팁 기록과 칼슘 이미징 모두 식단에 따른 GRN 민감도의 변화를 포착할 수 있습니다^30,66. 따라서 전기생리학은 미각 리간드와 수용체를 식별하고 다양한 요인이 1차 미각 수용체 뉴런의 민감도를 조절하는 방법을 이해하기 위한 칼슘 이미징에 대한 중요하고 보완적인 접근 방식으로 남아 있습니다.

저자는 이해 상충이 없으며 공개할 내용이 없습니다.

플라이 스톡을 제공해 주신 Bloomington Drosophila Stock Center와 맞춤형 이미징 챔버 제작에 도움을 주신 University of Vermont IMF Labs에 감사드립니다. 또한 그래픽 일러스트레이션을 제작해 주신 BioRender와 그래픽 디자인에 기여해 주신 Kayla Audette에게도 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 버몬트 대학교(University of Vermont)의 새로운 실험실 창업 기금과 국립과학재단(National Science Foundation) 상 번호 2332375의 지원을 받았습니다. 그림 1 의 그래픽은 www.BioRender.com 로 생성되었습니다.