Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Ein Calcium-Imaging-Ansatz ermöglicht die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten Reaktionen im Gehirn wacher Fliegen, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird. Primäre gustatorische Reaktionen in Drosophila melanogaster werden als Beispiel verwendet, aber dieses Protokoll kann angepasst werden, um nachgeschaltete Neuronen oder andere Spezies zu untersuchen.

Seit fast zwei Jahrzehnten ist die In-vivo-Calcium-Bildgebung eine effektive Methode zur Messung der zellulären Reaktionen auf Geschmacksreize im Modellorganismus der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster. Eine wesentliche Stärke dieser Methodik ist ihre Fähigkeit, geschmacksinduzierte neuronale Reaktionen bei wachen Tieren aufzuzeichnen, ohne dass eine Anästhesie erforderlich ist. Dieser Ansatz verwendet binäre Expressionssysteme (z. B. Gal4-UAS), um den Kalziumindikator GCaMP in bestimmten Neuronen von Interesse zu exprimieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, bei dem Fliegen, die GCaMP exprimieren, mit dem Labellum fest positioniert werden, so dass die Fluoreszenz im Gehirn mit Millisekundenauflösung unter einem konfokalen Mikroskop aufgezeichnet werden kann, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird, die alle Label-Geschmackssensillen stimuliert. Die bereitgestellten Beispiele konzentrieren sich auf Kalziumreaktionen in primären gustatorischen Rezeptorneuronen von D. melanogaster. Dieser Ansatz kann jedoch so angepasst werden, dass er von anderen Neuronen im Gehirn von Drosophiliden oder anderen Insektenarten aufzeichnet. Dieses bildgebende Verfahren ermöglicht es den Forschern, gleichzeitig kollektive Kalziumreaktionen von Gruppen gustatorischer Neuronen über das Lablum hinweg aufzuzeichnen, und ergänzt damit elektrophysiologische Spitzenaufzeichnungen, die Aktionspotentiale von einzelnen Neuronen quantifizieren. Die hier skizzierte In-vivo-Calcium-Bildgebungstechnik hat maßgeblich dazu beigetragen, molekulare und zelluläre Mechanismen der Chemoempfindung aufzudecken, einzigartige zeitliche Reaktionsmuster in primären Geschmacksneuronen zu identifizieren, Mechanismen der gustatorischen Modulation zu untersuchen und die Geschmacksverarbeitung in nachgeschalteten Schaltkreisen zu erforschen.

Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird für die leistungsfähigen genetischen Forschungswerkzeuge gefeiert, die in diesem Modellorganismus zur Verfügung stehen. Diese Werkzeuge bieten die Möglichkeit, spezifische Gene in Zielzellen leicht zu manipulieren, was sie ideal für die Erforschung grundlegender neuronaler Schaltkreise wie Sehen und Chemoempfindung macht ^1,2,3. Die Trunkenheit ist durch die Kontaktchemoempfindung ein wichtiger neuronaler Signalweg, der Verhaltensweisen reguliert, die an der Fütterung, Paarung, Fortpflanzung und letztendlich am Überleben und an der Fitness von Tieren beteiligt sind 4,5,6,7,8,9. Um zu verstehen, wie diese wichtige chemosensorische Information kodiert und übertragen wird, muss die Aktivität der Neuronen in den Schaltkreisen beschrieben werden, die durch Geschmacksreize aktiviert werden.

Bei D. melanogaster befinden sich externe gustatorische Rezeptor-Neuronen (GRNs) an den Vorderbeinen, am Rüssel und an den Flügeln^10,11. Das Labellum am Ende des Rüssels enthält haarähnliche Strukturen, die als Sensillen bezeichnet werden und anhand ihrer Morphologie anhand ihrer Größe kartiert werden können: lang (L-Typ), intermediär (I-Typ) und kurz (S-Typ)¹⁰. Die meisten GRNs konzentrieren sich auf dieses Sinnesorgan, wobei jede Sensilla 2-4 verschiedene Arten von GRNs enthält, so dass jede Geschmacksmodalität über das Labellum 12,13,14,15 verteilt ist. Während elektrophysiologische Spitzenaufzeichnungen verwendet werden können, um Aktionspotentiale zu quantifizieren, die von GRN in einer einzigen Sensilla¹⁶ ausgehen, kann in vivo die Calcium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität eines spezifischen GRN-Typs über das gesamte Labellum^14,17 zu isolieren. Dieselbe Kalzium-Bildgebungstechnik kann auch verwendet werden, um neuronale Reaktionen in nachgeschalteten Geschmacksschaltkreisen zu untersuchen 18,19,20. Die Kalzium-Bildgebung erfordert binäre Expressionssysteme wie Gal4-UAS 21,22,23 und das Kreuzen einer Treiberlinie mit zellspezifischen Transkriptionsaktivatoren zu einer Effektorlinie, um die Expression eines GCaMP in den interessierenden Neuronen zu erhalten. Wenn der intrazelluläre Kalziumspiegel ansteigt, nehmen diese genetisch kodierten Kalziumindikatoren in der Fluoreszenzintensität zu, so dass das Fluoreszenzniveau mit Veränderungen der neuronalen Aktivität korreliert ist^24,25.

Hier wird eine Methode zur Verwendung von Calcium-Imaging beschrieben, um neuronale Reaktionen auf Geschmacksreize in vivo zu beobachten. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, nur die Labellar-GRNs zu stimulieren, um geschmacksinduzierte neuronale Reaktionen im Gehirn von wachen Fliegen zu quantifizieren. Es werden Beispiele für die Verwendung dieser Methode zur Aufzeichnung von Reaktionen in den primären GRNs des Labellums in D. melanogaster gegeben, und die Vorteile und Herausforderungen dieses Ansatzes werden diskutiert. Dieses Präparat wurde entwickelt, um Experimentatoren die Möglichkeit zu geben, eine schmackhafte Lösung auf eine immobilisierte Fliegenlabellum aufzutragen, während sie sich unter einem konfokalen Mikroskop befinden, um neuronale Reaktionen aufzuzeichnen, wenn das gesamte Sinnesorgan in eine Lösung eingetaucht wird, was in natürlichen Umgebungen vorkommt. Der hier beschriebene In-vivo-Calcium-Imaging-Ansatz kann verwendet werden, um neuartige Geschmacks-Rezeptor-Wechselwirkungen ^8,14,26,27, zeitliche Details der GRN-Antworten^27,28, molekulare Mechanismen der GRN-Modulation^29,30 und Geschmacksverarbeitung in nachgeschalteten Schaltkreisen 8,18,19,20 aufzudecken^{. 28,31}.

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung einer hämolymphähnlichen (AHL) Lösung für Erwachsene

1. Bereiten Sie eine Stammlösung vor, die 108 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES und 15 mM Ribose enthält.
   HINWEIS: Ribose wird als nicht-energetischer Zucker verwendet, um die Osmolarität aufrechtzuerhalten, ohne den Nährstoffgehalt im Gehirn zu verändern.
2. Stellen Sie den pH-Wert dieser Lösung auf 7,5 ein, bevor Sie sie filtrieren und bei 4 °C lagern. Überprüfen Sie die Osmolarität der AHL, nachdem Sie den pH-Wert angepasst haben, um die Konsistenz aller Präparate sicherzustellen.
3. Getrennte Brühen von 1 M CaCl₂ und 1 M MgCl₂ vorbereiten, filtrieren und bei Raumtemperatur lagern.
4. Um ein Aliquot des AHL-Hauptbestands herzustellen, fügen Sie ein kleines Volumen des Calciums und Magnesiums hinzu, um Endkonzentrationen von 2 mM Calcium und 8,2 mM Magnesium zu erhalten. Dieser AHL kann bei 4 °C gelagert und bis zu einem Monat lang verwendet werden, wobei kleine Aliquots verwendet werden, die für Experimente auf Raumtemperatur gebracht werden.

2. Anbringen von Fliegen an der Bildgebungskammer

1. Bevor Sie Fliegen montieren, schärfen Sie die Spitze eines Dentalwachsers mit einem Schleifstein zu einem kleinen, spitzen Becher (Abbildung 1D). Befestigen Sie die geschärfte Spitze am Wachser und schalten Sie ihn zum Vorheizen ein. Die Temperatureinstellungen hängen von der Art und Länge der Spitze ab: Es wird eine Mindesttemperatur benötigt, die es dem Wachs ermöglicht, bei Kontakt geschmolzen zu bleiben (in diesem Beispiel funktionieren 50,5 °C).
   HINWEIS: Um das Ende des Dentalwachsers kann ein Draht gewickelt werden, um alternativ eine geschärfte Metallspitze anzubringen.
2. Betäuben Sie 1-5 Fliegen sanft (nach institutionell anerkannten Protokollen). Minimieren Sie die Expositionszeit bei der Anästhesie, da längere Zeiträume der Exposition gegenüber CO₂ oder Kälte das Verhalten beeinträchtigen können. Verwenden Sie für CO₂ ein Fliegenkissen, das unter einem Dissektionsmikroskop einen kontinuierlichen, gleichmäßigen Fluss von 99,9 % CO_{2 bei} einer Geschwindigkeit von 5 l/min bietet.
3. Verwenden Sie eine Präparierschere, um Teile der Beine zu entfernen, indem Sie die Mittel- und Hinterbeine am Femur-/Tibiagelenk und die Vorderbeine am Trochanter durchschneiden. Verwende eine stumpfe Pinzette, um die Fliege zu manipulieren. Das Trimmen der Tarsen verhindert das Gefühl der Fußwurzel und das Treten des Deckglases oder des Geschmacksstimulators.
4. Heben Sie die Fliege mit einer stumpfen Pinzette an den Flügeln auf, um die Fliege so zu positionieren, dass sich der Kopf über dem anvisierten Gebärmutterhalsschlitz der Bildgebungskammer befindet, der Körper jedoch darunter. Hilfreich ist es, die Fliege ganz nach rechts oder links zu starten. Schieben Sie mit der stumpfen Seite der Schere und der stumpfen Pinzette den Kopf und den Thorax gleichzeitig vorsichtig in den Schlitz.
5. Sobald Sie sich sicher im Schlitz befinden, schieben Sie die Fliege an die Rückseite des Schlitzes und positionieren Sie sie vorsichtig neu, sodass die Fliege zur Vorderseite der Kammer zeigt. Vermeiden Sie es, den Kopf zu weit aus der Ausrichtung zum Brustkorb zu drehen.
6. Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Fliegen wie nötig (diese Bildgebungskammer kann bis zu 5 Fliegen aufnehmen).
7. Sammeln Sie ein kleines Tröpfchen Nagellack auf das Ende eines Zahnstochers und tragen Sie eine dünne Schicht auf, um den Kopf der Fliege in der Bildgebungskammer zu befestigen.
   HINWEIS: Der genaue Bereich, auf den der Nagellack aufgetragen wird, hängt davon ab, welcher Teil des Gehirns abgebildet wird. Bei der Bildgebung der SWZ (wie hier gezeigt) oder anderer unterer medialer Regionen kann Nagellack großzügig auf die Oberseite des Fliegenkopfes aufgetragen werden, aber um überlegene mediale Regionen abzubilden, kann Nagellack minimal auf die Oberseite des Kopfes aufgetragen und seitlich in der Nähe der Augen hinzugefügt werden, um diesen Bereich für die Dissektion frei zu lassen. Dieses Protokoll ist nur für die Geschmacksstimulation ohne Geruchssinn optimiert, aber wenn flüchtige Bestandteile des Nagellacks ein Problem darstellen, verwenden Sie Wachs oder UV-Kleber als alternative Methoden zur Sicherung des Fliegenkopfes.

3. Wachsen des Rüssels in gestreckter Position

1. Nimm den Wachser mit einer Hand an und sammle ein kleines Tröpfchen Wachs auf der Spitze.
2. Auf der anderen Seite greifst du mit einer halbscharfen Pinzette nach einer Oberkieferpalpe und ziehst den Rüssel vorsichtig heraus und hältst ihn in voller Streckung.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, nur die Oberkieferpalpe zu greifen, da das Einklemmen der Nagelhaut am Rüssel das Risiko einer Beschädigung erhöht. Fahren Sie nicht fort, wenn der Rüssel eingeklemmt oder die Nasenhaut punktiert ist. Eine kleine Fliegenzange kann als Alternative zur Pinzette verwendet werden, um den Rüssel beim Auftragen des Wachses durch Saugen herauszuziehen.
3. Berühre die Spitze des Wachsers mit der Kammer in der Nähe der Basis des Rüssels, bis das Wachs zu fließen beginnt, und bewege dich dann, um Kontakt mit der Basis des Rüssels aufzunehmen. Wachse auf halber Höhe des Schaftes, aber vermeide es, die Labellar-Sensillen mit dem Wachs oder Wachser zu berühren. Das Wachs auf dieser Seite hält den Rüssel an Ort und Stelle. Fahren Sie nicht fort, wenn die Sensillen zu irgendeinem Zeitpunkt mit dem Wachs oder Wachser in Berührung kommen.
4. Tragen Sie das Wachs mit der oben beschriebenen Methode für die andere Seite auf und machen Sie eine durchgehende Wachsbrücke über den Rüssel.
5. Schieben Sie den Rüssel so gerade wie möglich vollständig aus. Bei Bedarf kann der Rüssel bewegt werden, indem das Wachs erneut erhitzt und der Rüssel vorsichtig in die gewünschte Position gedrückt wird.
6. Wiederholen Sie den Vorgang für andere Fliegen, die in derselben Kammer montiert werden sollen.
7. Schalten Sie CO_{2 aus} oder entfernen Sie Fliegen aus der Eisanästhesie. Legen Sie die montierten Fliegen für 60 Minuten in eine Feuchtigkeitskammer, damit sie sich erholen können (sauberer, leerer Pipettenspitzenkasten mit nassen, fusselfreien Tüchern).

4. Dissektion, um die interessierende Gehirnregion freizulegen

1. Entfernen Sie die Fliegen aus der Feuchtigkeitskammer. Fliegen müssen eindeutig lebendig sein und ihren Hinterleib, ihre Beine und Fühler aktiv bewegen. Richten Sie das Konfokal- oder Zwei-Photonen-Mikroskop vor der Dissektion ein.
2. Schalten Sie das Wachsmittel ein, um mögliche Brüche im Wachs während der Dissektion zu reparieren und AHL bei Raumtemperatur vorzubereiten.
3. Kneifen Sie mit einer sehr scharfen Pinzette beide Antennen ab und kneifen Sie dann die Nagelhaut zusammen, um ein Loch für eine Seite der scharfen Pinzette zu schaffen. Führen Sie die Pinzette unter die Nagelhaut, um sie aus der Region zu entfernen, die den interessierenden Hirnbereich bedeckt. Abbildung 1F zeigt ein X über Bereichen der Nagelhaut, die mit der Pinzette zur Entfernung anvisiert werden sollen.
4. Waschen Sie das exponierte Gehirn in AHL, indem Sie großzügig AHL (~100 μL) auf den Kopf auftragen und dann alle bis auf eine dünne Schicht AHL entfernen, um ein Austrocknen des Gehirns zu verhindern.
   HINWEIS: Wenn das Wachs an irgendeiner Stelle bricht und repariert werden muss, entfernen Sie kurz alle AHL um den Kopf herum, bevor Sie das Wachs erneut erhitzen, um den Rüssel wieder in der ausgestreckten Position zu sichern.
5. Entferne mit einer scharfen Pinzette Luftsäcke und alle großen Ablagerungen, die das Gehirn bedecken. Vermeiden Sie es, in das Gehirn einzudringen, indem Sie die Spitzen der Pinzette sichtbar halten.
6. Waschen Sie ~3 Mal mit AHL, um alle kleinen Ablagerungen zu entfernen.
7. Stellen Sie sicher, dass die interessierende Gehirnregion deutlich sichtbar ist. Um die subösophageale Zone (SEZ) wie in diesem Beispiel spezifisch abzubilden, schneiden Sie die Speiseröhre an der Basis in der Nähe des Rüssels und in der Nähe des Punktes, an dem er durch das Gehirn geht, indem Sie mit einer sehr scharfen Pinzette kneifen und dieses Stück entfernen, um die SWZ freizulegen.
   HINWEIS: Fliegen können nach der Entfernung der Speiseröhre keine Lösungen aufnehmen, und es kann keine pharyngeale GRN-Aktivierung auftreten.
8. Positionieren Sie unter dem Präpariermikroskop das 10 mm x 20 mm große Deckglas in den abgewinkelten Schlitz der Bildgebungskammer. Stellen Sie sicher, dass es an der Basis des Rüssels aufliegt, ohne das Wachs zu brechen. Die Spitze des Labellums darf das Deckglas nicht berühren.

5. Bildgebung und Geschmacksstimulation

1. Schalten Sie das Konfokal- oder Zwei-Photonen-Mikroskop ein und seien Sie bereit für die Bildaufnahme. Richten Sie einen Mikromanipulator mit einem Kapillarrohr ein, das so positioniert ist, dass die Geschmacksstoffe an die Fliege abgegeben werden, während sie sich auf dem Mikroskoptisch befindet.
   HINWEIS: Die Zwei-Photonen-Bildgebung kann Fluoreszenz von Neuronen erfassen, die sich tiefer im Hirngewebe befinden.
2. Laden Sie ~2 μL Wasser (oder eine andere Negativkontrolle) in das Kapillarrohr des
   Stimulator auf dem Mikroskoptisch.
3. Finde die präparierte Fliege und fokussiere dich mit dem 10-fachen Luftimmersions-Hellfeld auf das Labellum. Richten Sie die Kapillare in dieser Ansicht mit der Labellum aus. Zusätzliche Kameras, die auf das Labellum der Fliege gerichtet sind, können eingebaut werden, um die Ausrichtung der Kapillare mit der Fliege aus mehreren Blickwinkeln zu betrachten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Labellarsensillen während der Ausrichtung mit der Lösung stimuliert werden. Wenn die Position des Stimulators oder Labellums dafür nicht senkrecht genug ist, passen Sie dies entsprechend an. Die Kapillaren können mit einem Schleifstein gezogen und abgefeilt werden, um einen festeren Sitz um die Labellum zu gewährleisten.
4. Lassen Sie die Kapillare direkt vor dem Labellum in der Nähe, aber berühren Sie sie nicht.
5. Bewegen Sie den Tisch so, dass die interessierende Gehirnregion zentriert ist, und wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv mit höherer Vergrößerung (in diesem Beispiel 40x).
6. Geben Sie ca. 200 μl AHL auf das Gehirn, um Kontakt mit dem Objektiv für die Immersion herzustellen. Entfernen Sie alle Blasen.
7. Richten Sie den Fokus mit dem Hellfeld aus, um sich vorsichtig in der Z-Ebene zu bewegen, um den Rand der Nagelhaut zu finden, der entfernt wurde, und zentrieren Sie die gewünschte Gehirnregion.
8. Schalten Sie auf 488 nm Laserleistung um, um die GCaMP-Expression im interessierenden Bereich zu finden.
   HINWEIS: Abhängig von der Treiberleitung und der verwendeten Version von GCaMP kann eine anfängliche Optimierung erforderlich sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis für einzelne Präparate zu verstärken. Die Co-Expression von RFP kann für Neuronen mit niedriger GCaMP-Fluoreszenz zu Studienbeginn hilfreich sein.
9. Bereiten Sie eine Zeitraffer-Bildersammlung vor. Die Geschwindigkeit hängt vom jeweiligen Mikroskop und GCaMP-Signal ab, aber die Aufnahme von mindestens einem Bild alle ~100 ms ist optimal.
   HINWEIS: Die Erfassung einer einzelnen Z-Ebene der Fluoreszenz über die Zeit optimiert die Einfanggeschwindigkeit, um eine detaillierte Kalziumkinetik zu liefern. Bildstapel, die zu jedem Zeitpunkt in mehreren Z-Ebenen aufgenommen wurden, können die Erfassungsraten verlangsamen, zeichnen jedoch Reaktionen über Neuriten hinweg auf, die sich in unterschiedlichen Tiefen im Gewebe befinden.
10. Nachdem Sie mindestens 5 s Ausgangsfluoreszenz gesammelt haben, bewegen Sie den Stimulator manuell so, dass die Kapillare das Labellum für eine bestimmte Zeit (in diesem Beispiel 5 s) bedeckt, entfernen Sie dann den Stimulus und fangen Sie ihn so lange wie gewünscht ein.
11. Entfernen Sie das AHL und kehren Sie zum 10-fachen Hellfeld zurück, um sicherzustellen, dass sich Deckglas, Stimulator und Labellum noch in derselben Position befinden.
    HINWEIS: Wenn der Stimulator nicht gut mit dem Labellum ausgerichtet ist oder zu weit gedreht wird, kann das Labellum bewegt werden, oder die Kapillare kann auf die Bildgebungskammer treffen, wodurch das Wachs möglicherweise bricht und ein Leck aus dem AHL entsteht.
12. Entfernen Sie die Bildgebungskammer. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die erste Lösung zu entfernen, und spülen Sie die Pipette mit Wasser aus. Pipettieren Sie dann ~2 μl des nächsten Geschmacks in das Kapillarröhrchen.
13. Schieben Sie die Bildgebungskammer zurück auf den Tisch und wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.12 für diese Lösung.
    HINWEIS: Die hohe Oberflächenspannung der meisten Geschmacksstoffe weist darauf hin, dass Chemikalienreste auf der Fly-Folie verbleiben. Sind die Geschmacksstoffe jedoch stark gesättigt oder zähflüssig, kann Wasser mehrmals über die Labellum bewegt werden, um das Sinnesorgan vor dem nächsten Reiz zu waschen.
14. Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Lösungen, wie für diese Fliege gewünscht sind.
15. Kehren Sie zu Schritt 3 zurück, um den nächsten Flug für die Bildgebung vorzubereiten.

6. Bildanalyse

1. Öffnen Sie den Bildstapel, der in einer Bildverarbeitungssoftware analysiert werden soll. Führen Sie bei Bedarf eine Hintergrundsubtraktion mit einer Region außerhalb des GCaMP-Signals durch.
2. Wählen Sie mit dem Freihand- oder Formwerkzeug einen engen Interessenbereich (ROI) um die zu quantifizierenden Projektionen aus und stellen Sie sicher, dass die Auswahl auf alle Bilder im Stapel angewendet wird.
3. Generieren Sie eine Liste der Fluoreszenzmesswerte im Zeitverlauf für diesen ROI und exportieren Sie sie zur weiteren Verarbeitung in eine Tabelle. Verwenden Sie das Diagramm des Z-Achsen-Profils in ImageJ (FIJI) oder eine ähnliche Funktion in der Bildverarbeitungssoftware Ihrer Wahl.
4. Wählen Sie in der Tabelle 10 aufeinanderfolgende Zeitpunkte während der Baseline-Aufzeichnung in Schritt 5.10 als repräsentative Baseline aus. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung.
5. Um ΔF/F als Prozentsatz zu erhalten, berechnen Sie ((F - Mittelwert F)/Mittelwert F)*100) für jeden Zeitpunkt. Um ΔF/F als Z-Wert zu erhalten, berechnen Sie ((F - mittlere Basislinie F)/Standardabweichung Basislinie F) für jeden Zeitpunkt.
6. Um die Peakänderung der Fluoreszenz während der Stimulation zu berechnen, wählen Sie 3 aufeinanderfolgende Punkte mit der höchsten Fluoreszenz aus und berechnen Sie den Mittelwert.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Bildstapel über Stimuli und Fliegen hinweg.
   HINWEIS: Passen Sie diese Schritte je nach Mikroskop, Signalqualität und bevorzugter Bildanalysesoftware nach Bedarf an.

Abbildung 1 zeigt Details zur Bildgebungskammer (Abbildung 1A,B) und zur Wachserspitze (Abbildung 1D), die in dieser Vorbereitung verwendet wurden. Abbildung 1 veranschaulicht auch die Hauptschritte des Verfahrens zum Montieren von Fliegen (Abbildung 1C), zum Wachsen des Rüssels an Ort und Stelle (Abbildung 1E), zum Präparieren über der interessierenden Gehirnregion (Abbildung 1F) und zum Stimulieren des Labellums mit einem Schmackmittel bei gleichzeitiger Aufzeichnung der Fluoreszenz im Gehirn (Abbildung 1G). Um geschmacksinduzierte Reaktionen in primären gustatorischen Rezeptorneuronen (GRNs) von Drosophila melanogaster zu quantifizieren, wurden Fliegen mit Gr64f-Gal4 hergestellt, die die Expression von UAS-GCaMP6f antreiben, um den Kalziumindikator genetisch in allen zuckerempfindlichen "süßen" GRNs des Labellums 14,27,30,32,33,34,35 exprimieren zu lassen. Für diese Experimente wurde ein konfokales Mikroskop mit folgenden Komponenten verwendet: ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop mit 40 fps sCMOS-Kamera, 10x- und 40x-Objektive, konfokale Spinning-Disk-, dichroitische 488-Emitter und 488-nm-Festkörperlaser. Das 40x-Objektiv wurde in AHL getaucht und auf die SEZ-Gehirnregion zentriert, um das GCaMP-Basissignal in den Axonterminalien dieser Labellar-GRNs zu lokalisieren (Abbildung 2A). Ein Fluoreszenzbild wurde alle 100 ms während der Baseline (keine Stimulation), während 5 s der Geschmacksstimulation (Stimulator bewegte sich über das Labellum) und nach der Stimulation aufgenommen, bis die Fluoreszenz zum Ausgangswert zurückkehrte (Abbildung 2A, B). Wasser wurde als Negativkontrolle verwendet, und 1 M Saccharose wurde als Positivkontrolle verwendet. Die relative Änderung der Fluoreszenz wurde als ΔF/F (z-Score) für 13 Fliegen berechnet und über die Zeit aufgetragen, um die Kinetik der Kalziumreaktionen während der Geschmacksstimulation zu zeigen (Abbildung 2B). Der maximale ΔF/F (z-Score) wurde aufgetragen und für statistische Vergleiche verwendet, um anzuzeigen, dass die Saccharosereaktion in diesen Zellen signifikant höher ist als in Wasser (Abbildung 2C). Diese Technik erfasst, dass "süße" GRNs einen starken Peak nach dem Einsetzen der Saccharose haben, der mit einem gewissen Zerfall über die Stimulationsperiode hoch bleibt.

Zum Vergleich: Dieses Protokoll wurde in Fliegen mit einem anderen Treiber, Gr66a-Gal4, wiederholt, der UAS-GCaMP6f spezifisch in allen "bitteren" GRNs auf dem Labellum 14,17,28,34,36 exprimierte. In ähnlicher Weise befanden sich die Axonterminalien dieser GRNs in der SWZ: Beachten Sie, dass sich das Projektionsmuster von den zuckerempfindlichen GRNs unterscheidet (Abbildung 2D). Die Fluoreszenz wurde wie zuvor erfasst und analysiert, mit Ausnahme von 100 mM Koffein, das als Positivkontrolle verwendet wurde. Die gemittelte Kurve von 11 Fliegen zeigt einen starken Höhepunkt mit dem Einsetzen der Koffeinstimulation, aber es gibt auch eine kleine "Aus"-Reaktion bei der Reizentfernung, von der bekannt ist, dass sie bei bestimmten bitteren Reizen auftritt²⁸ (Abbildung 2E). Diese Methode ermöglicht es, sowohl "An"- als auch "Aus"-Reaktionen zu quantifizieren, um die zeitlichen Muster geschmacksinduzierter Reaktionen zu charakterisieren^27,28. Hier wurden nur die "On"-Peaks quantifiziert, um darauf hinzuweisen, dass die Reaktion auf Koffein signifikant stärker ist als auf Wasser (Abbildung 2F). Die Experimente in Abbildung 2 sind hochgradig reproduzierbar und können verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Protokoll ordnungsgemäß funktioniert.

Abbildung 1: Protokollabbildungen zur Abbildung geschmacksinduzierter Reaktionen im Drosophila-Gehirn . (A) Draufsicht auf die benutzerdefinierte Bildgebungskammer, in der bis zu fünf Fliegen gleichzeitig montiert werden können. (B) Einzelheiten der Bildgebungskammer, in der die Fliegen montiert sind, mit Messungen, die bequem zum Gebärmutterhals von D. melanogaster passen. (C) Grafiken, die zeigen, wo die Tarsen gekürzt werden sollen (oben links) und wie die Fliege mit einer Pinzette in den Gebärmutterhalsschlitz der Bildgebungskammer montiert wird (unten links). Foto einer montierten Fliege in der richtigen Position in der Bildgebungskammer (rechts). (D) Foto der Wachserspitze (links), vergrößertes Foto der Spitze, um die ungefähre Form und Größe anzugeben, die bei der Verwendung eines Schleifsteins zur Änderung der Standardspitze mit einem Schleifstein angestrebt werden soll (rechts). (E) Grafische Illustration des Wachsens des Rüssels mit einer Pinzette (links), Foto einer Fliege mit einer ordnungsgemäß gewachsten Labellum (rechts). (F) Grafische Illustration, die die Dissektion über der interessierenden Hirnregion und die Anwendung von AHL darstellt (links), Foto einer Fliege mit gestrichelten Kreisen um den Bereich der Kutikula, die entfernt werden soll, wenn sie auf die SEZ- oder SMP-Gehirnregionen abzielt. X zeigt die Bereiche der Nagelhaut an, die zum Präparieren zusammengedrückt werden sollen (rechts). (G) Grafiken und Fotos zeigen die Position der montierten/präparierten Fliege, das Wasserimmersionsobjektiv in AHL, den Stimulator mit einem Schmackstoff über dem Rüssel und das Deckglas, das eine Barriere zwischen diesen Lösungen bildet. Die Seitenansicht wurde verkleinert (links), und die Draufsicht befand sich unter dem 10-fach-Objektiv (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel für die Calciumreaktion von Label-GRNs auf Geschmacksreize. (A) Standbildaufnahmen von einem Bildstapel, die das Niveau der GCaMP-Fluoreszenz in einer Fliege mit Gr64f>GCaMP6f zu Studienbeginn und während der Peakreaktion auf 1 M Saccharose anzeigen, Maßstabsbalken = 20 μm. Die gestrichelten Linien zeigen den ROI für die Analyse an. (B) Calcium-Reaktionskurven für n = 14 Fliegen, berechnet als ΔF/F (z-Score) und kombiniert für Wasser (Negativkontrolle) und 1 M Saccharose (Positivkontrolle), um die Kinetik zu zeigen; Die schwarze Linie unter den Kurven zeigt an, wann sich der Stimulus über dem Labellum befindet. (C) Peak ΔF/F (z-Score) für jede Fliege, die für statistische Vergleiche aufgetragen wird. Gepaarter t-Test, ****p < 0,0001. (D) Standbilder aus einem Video, das den Grad der GCaMP-Fluoreszenz in einer Fliege mit Gr66a>GCaMP6f zu Studienbeginn und während der Spitzenreaktion auf 100 mM Koffein zeigt, Maßstabsbalken = 20 μm. Die gestrichelten Linien zeigen den ROI für die Analyse an. (E) Kalzium-Reaktionskurven für n = 11 Fliegen, berechnet als ΔF/F (z-Score) und kombiniert für Wasser (Negativkontrolle) und 100 mM Koffein (Positivkontrolle), um die Kinetik zu zeigen: Beachten Sie die kleine "Aus"-Reaktion, schwarze Linie unter den Kurven zeigt an, wann der Reiz über dem Labellum ist. (F) Peak ΔF/F (z-Wert) für jede Fliege, aufgetragen für statistische Vergleiche. Gepaarter t-Test, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Einer der schwierigsten Aspekte dieses Protokolls ist die Geschicklichkeit der Mikromanipulation, die erforderlich ist, um das Labellum zu wachsen und die gezielten Dissektionen durchzuführen. Ein zusätzlicher Schritt zur Sicherung des Labellums ist notwendig, um jedes Sensillum gleichmäßig über dieses Sinnesorgan zu stimulieren und die interessierenden Gehirnregionen sichtbar zu machen. Die hier verwendete benutzerdefinierte Bildgebungskammer ist für D. melanogaster optimiert, aber die Spezifikationen der Kammer und der Wachsansatz müssen möglicherweise für andere Insekten geändert werden. Dieses Protokoll kann mit geringen Modifikationen auf andere Drosophiliden angewendet werden, aber andere Mitglieder der Brachycera-Unterordnung, wie Bienen und Mücken, können Änderungen an den Montage- und Präparierschritten erfordern, um Unterschiede in der Labialpalp und der Kopfmorphologie zu berücksichtigen. Die Ausrichtung des Mikromanipulators für die geschmackliche Abgabe kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen und erfordert zur Optimierung eine erste Prüfung mit dem spezifischen Mikroskoptisch. Wenn das Wachs während der Stimulation gebrochen wird, kann es zu Undichtigkeiten kommen, bei denen das AHL und das Geschmäcker in der Kapillare in Kontakt kommen. Das Ziehen der Kapillaren und das Abfeilen mit einem Schleifstein, damit sie besser an die Labellum passen, kann helfen, einen Kontakt zwischen Geschmack und AHL zu verhindern. Fliegen mit Undichtigkeiten oder übermäßiger Gehirnbewegung müssen ausgeschlossen werden. Wenn möglich, sollten Sie immer eine Positivkontrolle für jedes Tier durchführen, um sicherzustellen, dass die Labellum- und Labellarnerven durch das Wachsen oder Sezieren nicht beschädigt werden. Die hier gezeigten "süßen" und "bitteren" Beispiele werden als robuste Kontrollexperimente empfohlen.

Der hier beschriebene In-vivo-Calcium-Imaging-Ansatz wurde verwendet, um geschmacksinduzierte Reaktionen in primären Geschmacksneuronen, Neuronen höherer Ordnung und der gesamten SEZ in D. melanogaster zu quantifizieren, um die gustatorischen Rezeptoren und Schaltkreise ^{8,14,17,18,19,20,27,28,30,31}, 34,35,36,37,38,39,40,41^,
42,43,44,45,46,47,48. Die weit verbreiteten Anwendungen in diesem Modellorganismus sind auf die leicht verfügbaren Gal4- und Split-Gal4-Treiber zurückzuführen; Daher ist die Notwendigkeit genetisch veränderter Insekten, GCaMP in bestimmten Neuronen von Interesse zu exprimieren, ein limitierender Faktor für diesen Ansatz. Glücklicherweise wird dies mit den Fortschritten in der Gen-Editing-Technologie für Insekten jenseits von Modellorganismen zugänglicher, und geschmacksinduzierte Reaktionen mit Kalzium-Bildgebung wurden kürzlich für den Schädling Drosophila suzukii⁴⁹ und für vektorübertragende Mücken⁵⁰ berichtet. Wie bei allen Kalzium-Bildgebungen kann eine anfängliche Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses für die Zielneuronen von Interesse erforderlich sein. Signale können durch die Verwendung hellerer Versionen von GCaMP und durch die Expression von zwei Kopien von GCaMP verbessert werden. Die Co-Expression von RFP in Zielneuronen kann helfen, die Zielneuronen zu Beginn zu visualisieren und kann als Kontrolle für die Gehirnbewegung in Regionen dienen, die eine Neigung zum Pulsieren haben.

Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um die Chemoempfindung aus dem Labellum zu isolieren, indem die Tarsen und Antennen entfernt, über die Oberkieferpalpen gewachst und die Einnahme so begrenzt wird, dass keine pharyngealen GRNs stimuliert werden. Es können jedoch Anpassungen an diesem Protokoll vorgenommen werden, um die Chemoempfindung durch tarsale oder pharyngeale GRNs einzubeziehen. Wenn die Tarsen intakt bleiben, können die Beine allein oder zusätzlich zur Labellum stimuliert werden, indem am Ende der Kapillare eine große Blase aus schmackhafter Lösung entsteht. Es besteht die Möglichkeit, dass eine Fliege das Deckglas tritt und bewegt, wenn die Tarsen intakt bleiben. Daher kann das Wachsen der Tarsen in der Nähe der Basis in Betracht gezogen werden, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden. Das aktuelle Beispiel beinhaltet den Schritt des Durchtrennens der Speiseröhre, um eine pharyngeale GRN-Stimulation zu vermeiden und die Labellarprojektionen in der SWZ besser sichtbar zu machen, aber dasselbe Präparat wurde zuvor angepasst, um pharyngeale GRN-Reaktionen zu quantifizieren, indem der Ösophagus intakt gelassen und laterale pharyngeale Projektionen abgebildet wurden³⁶. In dieser vorherigen Anwendung wurde ein appetitiver Zuckerstimulus verwendet, den Fliegen frei konsumieren, um pharyngeale GRNs zu stimulieren, aber Fliegen werden nicht ohne weiteres einen aversiven Stimulus konsumieren, um bittere pharyngeale GRNs zu aktivieren, was eine Einschränkung dieses Ansatzes darstellt. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Reaktionen von GRNs, die sich in den Flügeln von Drosophila¹¹ befinden, mit diesem Ansatz nicht ohne weiteres untersucht werden können.

Während die hier beschriebene In-vivo-Calcium-Bildgebung zur Standardmethode für die Untersuchung von geschmacksinduzierten Reaktionen höherer Ordnung geworden ist 8,18,19,20,28, gibt es derzeit mehrere andere Ansätze zur Quantifizierung der primären Labellar-GRN-Reaktionen auf Geschmacksstoffe in Fliegen. Der hier beschriebene In-vivo-Calcium-Bildgebungsansatz zeichnet GCaMP-Veränderungen in den Axonterminalien im Gehirn auf, aber ein ex vivo-Ansatz wurde auch verwendet, um GCaMP im Zellkörper in Labellar-GRNs zu quantifizieren ³³. In ähnlicher Weise wurde ein anderer Ansatz zur Abbildung der Zellkörper von Labellar- oder Tarsal-GRNs bei intakten Fliegen beschrieben⁵¹. Die Elektrophysiologie ist nach wie vor eine beliebte und effektive Technik zur Untersuchung der Reaktionen der primären Geschmacksneuronen bei Insekten 13,16,32,52,53,54,55,56,57,58,59,60,64,62 ^,63,64,65. Dies erfordert keine genetisch kodierten Kalziumsensoren und ist eine direktere Quantifizierung der neuronalen Aktivität. Es können jedoch jeweils nur Reaktionen von nur einer Sensilla aufgezeichnet werden, während die Kalziumbildgebung gleichzeitig von einer vollständigen Population von GRNs aufgezeichnet werden kann. Der Calcium-Imaging-Ansatz wurde verwendet, um die einzigartige zeitliche Dynamik von "An"- und "Aus"-Reaktionen in GRNs mit bestimmten Reizen zu entdecken^27,28, aber ein kürzlicher Fortschritt bei elektrophysiologischen Aufzeichnungen von der Basis der Geschmackssensillen in D. melanogaster ermöglicht nun die Quantifizierung von "Aus"-Reaktionen auf der Ebene der Aktionspotentiale⁵³. Interessanterweise wurde die Modulation der primären GRN-Empfindlichkeit durch Hunger mittels Kalziumbildgebung nachgewiesen, jedoch nicht auf der Ebene der Aktionspotentiale mit der Elektrophysiologie²⁹, dennoch können sowohl elektrophysiologische Spitzenaufzeichnungen als auch Kalziumbildgebung eine Veränderung der GRN-Empfindlichkeit mit der Ernährung erfassen^30,66. Daher bleibt die Elektrophysiologie ein wichtiger, komplementärer Ansatz zur Kalziumbildgebung, um Geschmacksliganden und -rezeptoren zu identifizieren und um zu verstehen, wie verschiedene Faktoren die Empfindlichkeit von primären Geschmacksrezeptorneuronen modulieren.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte und nichts offenzulegen.

Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegenstöcke und den IMF Labs der University of Vermont für ihre Hilfe bei der Herstellung der maßgeschneiderten Bildgebungskammern. Wir möchten uns auch bei BioRender für die Erstellung von grafischen Illustrationen und bei Kayla Audette für die Mitarbeit am Design dieser Grafiken bedanken. Diese Arbeit wurde durch neue Labor-Startup-Fonds der University of Vermont und den Preis der National Science Foundation mit der Nummer 2332375 unterstützt. Die Grafiken in Abbildung 1 wurden mit www.BioRender.com generiert.