インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

カルシウムイメージングアプローチにより、覚醒しているハエの脳内で味覚誘発反応を記録し、ラベルに溶液を塗布することができます。 Drosophila melanogaster の一次味覚反応が例として使用されていますが、このプロトコルは下流のニューロンや他の種の研究にも適応できます。

約20年間、 in vivo カルシウムイメージングは、ショウジョウバエのモデル生物である ショウジョウバエの味覚刺激に対する細胞応答を測定するための効果的な方法でした。この方法論の主な強みは、麻酔を必要とせずに、覚醒した動物の味覚誘発性神経反応を記録できることです。このアプローチでは、バイナリ発現系(Gal4-UASなど)を使用して、関心のある特定のニューロンでカルシウムインジケーターGCaMPを発現します。このプロトコルは、GCaMPを発現するハエをラベルをしっかりと配置してマウントする手順を説明しており、溶液をラベルに塗布しながら脳内の蛍光を共焦点顕微鏡でミリ秒の分解能で記録し、すべてのラベル味覚を刺激します。提供された例は、 D. melanogasterの一次味覚受容体ニューロンにおけるカルシウム応答に焦点を当てています。しかし、このアプローチは、 ショウジョウバエや他の 昆虫種の脳内の他の関心のあるニューロンから記録するように適応させることができます。このイメージング法により、研究者は、個々のニューロンからの活動電位を定量化する電気生理学的先端記録を補完し、ラベラム全体の味覚ニューロンのグループからの集団的なカルシウム応答を同時に記録することができます。ここで概説した in vivo カルシウムイメージング技術は、ケモセンセーションの分子および細胞メカニズムの解明、一次味覚ニューロンにおけるユニークな時間応答パターンの同定、味覚調節のメカニズムの調査、および下流回路における味覚処理の探索に役立っています。

ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)は、このモデル生物で利用可能な強力な遺伝子研究ツールで有名です。これらのツールは、標的細胞内の特定の遺伝子を容易に操作する能力を提供し、視覚や化学感覚^1,2,3などの基本的な神経回路の探索に理想的です。Gustationは、接触式化学感覚を通じて、動物の摂食、交配、繁殖、そして最終的には生存と適応度に関与する行動を調節する重要な神経経路です4,5,6,7,8,9。この重要な化学感覚情報がどのようにコード化され、伝達されるかを理解するには、味覚刺激によって活性化される回路内のニューロンの活動を説明する必要があります。

D. melanogasterでは、外部味覚受容体ニューロン(GRN)が前脚、口吻、および翼^10,11に位置している。吻の端にあるラベルには、センシラと呼ばれる毛のような構造が含まれており、サイズに基づいて形態によってマッピングできます:長い(Lタイプ)、中間(Iタイプ)、および短い(Sタイプ)¹⁰。ほとんどのGRNはこの感覚器官に集中しており、各センシラには2〜4種類のGRNが含まれているため、各味覚モダリティはラベル12,13,14,15全体に広がっています。電気生理学的チップ記録は、単一のセンシラ¹⁶でGRNから来る活動電位を定量化するために使用できますが、in vivoでは、カルシウムイメージングを使用して、全ラベル^14,17にわたって特定のタイプのGRNの活性を分離できます。この同じカルシウムイメージング技術は、下流の味覚回路^18、19、20における神経応答を研究するためにも使用することができる。カルシウムイメージングには、Gal4-UAS 21,22,23などのバイナリ発現システムが必要であり、細胞特異的な転写活性化因子を含むドライバーラインをエフェクターラインに交差させて、目的のニューロンでGCaMPを発現させる必要があります。細胞内のカルシウムレベルが上昇すると、これらの遺伝的にコードされたカルシウム指標は蛍光強度が増加するため、蛍光レベルはニューロン活動の変化と相関する^24,25。

ここでは、カルシウムイメージングを用いて、in vivoで味覚刺激に対する神経応答を観察する方法について説明する。この方法の全体的な目標は、ラベラのGRNのみを刺激して、覚めているハエの脳における味覚誘発性神経応答を定量化することです。この方法を使用して、D. melanogasterのラベルの主要なGRNに応答を記録する例が示され、このアプローチを使用する利点と課題について説明します。この調製物は、実験者が共焦点顕微鏡下で固定化されたハエラベルにテイスタント溶液を適用し、感覚器官全体が溶液に浸されたときの神経応答を記録できるようにするために開発されました。ここで述べるin vivoカルシウムイメージングアプローチは、新規のtastant-receptor相互作用^8,14,26,27、GRN応答の時間的詳細^27,28、GRN調節の分子機構^29,30、および下流回路^8,18,19,20の味覚処理を明らかにするために使用できる^。28,31.

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 成人血リンパ様(AHL)溶液の調製

1. 108 mMのNaCl、5 mMのKCl、4 mMのNaHCO₃、1 mMのNaH₂PO₄、5 mMのHEPES、および15 mMのリボースを含むストック溶液を調製します。
   注:リボースは、脳内の栄養レベルを変えることなく浸透圧を維持するための非エネルギー糖として使用されます。
2. この溶液のpHを7.5に調整してから、4°Cでろ過および保存してください。 pHを調整した後、AHLの浸透圧を確認し、調製物間の一貫性を確保します。
3. 1 MのCaCl₂ と1 MのMgCl₂を別々に調製し、ろ過し、室温で保存します。
4. メインのAHLストックのアリコートを調製するには、少量のカルシウムとマグネシウムを加えて、最終濃度が2 mMのカルシウムと8.2 mMのマグネシウムになります。このAHLは、実験のために室温に持ち込んだ小さなアリコートを使用して、4°Cで保存し、最大1か月間使用できます。

2. イメージングチャンバーへのハエの取り付け

1. ハエをマウントする前に、砥石を使用して歯科用ワックスの先端を小さな先のとがったカップに研ぎます(図1D)。尖らせた先端をワックスャーに取り付け、電源を入れて予熱します。熱設定はチップの種類と長さによって異なります:接触時にワックスが溶けたままになる最低温度が必要です(この例では50.5°Cが機能します)。
   注:デンタルワックスの端にワイヤーを巻き付けて、代わりに鋭利な金属チップを固定することができます。
2. 1〜5匹のハエに優しく麻酔をかけます(施設で承認されたプロトコルに従います)。CO₂ または寒さに長時間さらされると行動に影響を与える可能性があるため、麻酔への曝露時間を最小限に抑えます。CO₂の場合、解剖顕微鏡下で5 L / minの速度で99.9%のCO₂ の連続的で均一な流れを提供するフライパッドを使用します。
3. 解剖ハサミを使用して、大腿骨/脛骨関節の中脚と後肢、転子の前脚を切断することにより、脚の一部を取り除きます。鈍い鉗子を使用して、ハエを操作します。足根をトリミングすると、足根の感覚やカバーガラスや味覚刺激装置の蹴りを防ぐことができます。
4. 鈍い鉗子を使用して翼でハエを拾い上げ、頭部がイメージングチャンバーの標的子宮頸部スロットより上にくるようにフライを配置しますが、体は下にあります。フライを右または左に完全に開始すると便利です。はさみと鈍い鉗子の鈍い面を使用して、頭と胸部を同時にスロットにそっと押し込みます。
5. スロットにしっかりと入ったら、フライをスロットの背面に押し込み、フライがチャンバーの正面を向くようにゆっくりと位置を変えます。頭を胸部との位置合わせから大きくずらして回転させないでください。
6. 必要な数のフライに対して繰り返します(このイメージングチャンバーは最大5匹のフライを取り付けることができます)。
7. つまようじの先にマニキュアの小さな液滴を集め、薄いコートを塗ってフライの頭をイメージングチャンバーに固定します。
   注:マニキュアを塗る正確な領域は、脳のどの部分が画像化されているかによって異なります。SEZやその他の下内側領域を画像化する場合は、マニキュアをフライヘッドの上部にたっぷりと塗ることができますが、上内側領域を画像化するには、マニキュアを頭頂部に最小限に塗布し、目の近くに横方向に追加して、この領域を解剖用にクリアにすることができます。このプロトコルは、嗅覚を伴わない味覚刺激のみに最適化されていますが、マニキュアの揮発性物質が懸念される場合は、フライヘッドを固定するための代替方法としてワックスまたはUV接着剤を使用してください。

3.テングを伸ばした位置でワックスがけします

1. 片手でワックスを手に取り、先端にワックスの小さな液滴を集めます。
2. 一方、セミシャープな鉗子を使用して1つの上顎の触手をつかみ、吻をゆっくりと引き出して完全に伸ばして保持します。
   注:吻のキューティクルをつまむと損傷の可能性が高まるため、上顎の触覚のみをつかむように注意してください。吻が挟まれたり、吻のキューティクルに穴が開いたりした場合は、先に進まないでください。小さなハエのpooterはワックスを塗る間吸引を使用して吻を引き出すために鉗子の代わりとして使用されてもよい。
3. ワックスが流れ始めるまで、ワックスの先端をテングの基部近くのチャンバーに接触させ、その後、テングの基部に接触するように移動します。シャフトの途中までワックスをかけますが、ワックスやワックスでラベルセンシラに触れないようにします。こちら側のワックスは、テングを所定の位置に保持します。感知器がワックスやワックスに触れた場合は、先に進まないでください。
4. 反対側に上記の方法を使用してワックスを塗布し、テング上にワックスの連続した橋を作ります。
5. テングをできるだけまっすぐに完全に伸ばします。必要ならば、吻を動かすことはワックスを再熱し、目的の位置に穏やかに吻を押すことによって行うことができる。
6. 他のフライを同じチャンバーに取り付けるために繰り返します。
7. CO₂ をオフにするか、氷の麻酔からハエを取り除きます。取り付けられたフライを湿度チャンバーに60分間入れて回復させます(濡れた糸くずの出ないワイプが付いた清潔で空のピペットチップボックス)。

4. 脳の関心領域を明らかにするための解剖

1. 湿度チャンバーからハエを取り出します。ハエは明らかに生きていて、腹部、脚、触角を積極的に動かしている必要があります。解剖前に共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡をセットアップします。
2. 解剖中にワックスの潜在的な破損を修復するためにワックスをオンにし、室温のAHLを準備します。
3. 非常に鋭い鉗子を使用して、両方のアンテナをつまんでから、キューティクルをつまんで鋭い鉗子の片側を挿入するための穴を開けます。鉗子をキューティクルの下に走らせて、関心のある脳領域を覆う領域から鉗子を取り除きます。 図1F は、鉗子で除去するキューティクルの領域上のXを示しています。
4. AHL(~100μL)を頭にたっぷりと塗布し、脳が乾燥するのを防ぐためにAHLの薄い層を除くすべてを取り除き、露出した脳をAHLで洗います。
   注:ワックスがいずれかの時点で壊れて修理が必要な場合は、ワックスを再加熱する前に、頭の周りからすべてのAHLを簡単に取り外して、テングを拡張位置に再度固定します。
5. 鋭利な鉗子を使用して、気嚢と脳を覆っている大きな破片を取り除きます。鉗子の先端が見えるようにして、脳を貫通しないようにします。
6. AHLで~3回洗って、小さな破片をすべて取り除きます。
7. 関心のある脳の領域がはっきりと見えるようにします。この例のように食道下ゾーン(SEZ)を具体的に画像化するには、非常に鋭い鉗子でつまんで脳を通過する点の近くの吻の基部で食道を切断し、この部分を取り除いてSEZを露出させます。
   注:食道が取り除かれた後、ハエは溶液を摂取できず、咽頭GRNの活性化は起こりません。
8. 解剖顕微鏡の下で、10 mm x 20 mmのカバースリップをイメージングチャンバーの角度付きスロットに配置します。ワックスを壊さずに吻の基部に載っていることを確認してください。ラベルの先端がカバーガラスに触れないようにしてください。

5. イメージングと味覚刺激

1. 共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡の電源を入れ、画像キャプチャの準備をします。キャピラリーチューブを備えたマイクロマニピュレーターをセットアップし、顕微鏡ステージ上にテイスタントをフライで送るように配置します。
   注:2光子イメージングは、脳組織のより深いニューロンから蛍光を捕捉できます。
2. ~2 μL の水 (または別のネガティブコントロール) をキャピラリーチューブにロードします。
   顕微鏡ステージ上の刺激装置。
3. 解剖されたフライを見つけ、10倍の空気浸漬明視野を使用してラベルに焦点を合わせます。このビューの下のラベルにキャピラリーを合わせます。フライのラベルに向けられた追加のカメラを含めて、キャピラリーとフライの位置合わせを複数の角度から見ることができます。
   注:アライメント中にすべてのlabellar sensillaが溶液で刺激されていることを確認してください。刺激装置またはラベルの位置がこれに対して十分に垂直でない場合は、それに応じて調整してください。キャピラリーを引っ張って砥石でやすりで削り、ラベルの周りにしっかりとフィットさせることができます。
4. キャピラリーをラベルの真正面に配置し、近づけますが触れないようにします。
5. 対象の脳領域が中央に配置されるようにステージを動かし、高倍率の水浸対物レンズ(この例では40倍)に切り替えます。
6. 脳の上に約200μLのAHLを加えて、対物レンズに接触させて浸漬させます。気泡があれば取り除きます。
7. 明視野を使用して焦点を向け、z平面内を慎重に移動して、除去されたキューティクルの端を見つけ、関心のある脳領域を中央に配置します。
8. 488 nmレーザー出力に切り替えて、対象領域のGCaMP発現を見つけます。
   注:ドライバーラインと使用するGCaMPのバージョンによっては、個々の調製の信号対雑音比を増幅するために初期最適化が必要になる場合があります。RFPの共発現は、ベースラインGCaMP蛍光が低いニューロンに役立ちます。
9. タイムラプス画像コレクションを準備します。速度は顕微鏡やGCaMP信号によって異なりますが、~100ミリ秒ごとに少なくとも1枚の画像を撮影するのが最適です。
   注:時間の経過とともに単一のZ面の蛍光を捕捉すると、捕捉速度が最適化され、詳細なカルシウム動態が得られます。各時点で複数のZ平面で撮影された画像スタックは、キャプチャ速度を遅くする可能性がありますが、組織の異なる深さにある神経突起全体の応答を記録します。
10. ベースライン蛍光を少なくとも5秒間収集した後、刺激装置を手動で動かして、毛細血管が特定の時間(この例では5秒)ラベルを覆うようにし、その後、刺激を除去して必要なだけ捕捉します。
11. AHLを取り外し、10倍明視野に戻って、カバーガラス、刺激装置、およびラベルが同じ位置にあることを確認します。
    注:刺激装置がラベルとうまく位置合わせされていない場合、または回転しすぎている場合は、ラベルが移動したり、キャピラリーがイメージングチャンバーに当たったりして、ワックスが壊れてAHLから漏れる可能性があります。
12. イメージングチャンバーを取り外します。糸くずの出ないワイプを使用して最初の溶液を取り出し、ピペットを水で洗い流します。次に、次のテイスタントを~2μLをキャピラリーチューブにピペットで移します。
13. イメージングチャンバーをステージに戻し、この溶液について手順5.4〜5.12を繰り返します。
    注:ほとんどのテイスタントの高い表面張力は、フライラベルに留まることから残留化学物質を示しています。ただし、テイスタントが飽和度が高いか粘性が高い場合は、ラベル上を水を数回動かして、次の刺激の前に感覚器官を洗うことができます。
14. このフライに必要な数の解決策を繰り返します。
15. 手順3に戻り、次のフライをイメージングする準備をします。

6. 画像解析

1. 画像処理ソフトウェアで解析する画像スタックを開きます。必要に応じて、GCaMP 信号の外側の領域を使用してバックグラウンド減算を実行します。
2. フリーハンドまたはシェイプツールを使用して定量化する投影の周囲に狭い関心領域(ROI)を選択し、スタック内のすべての画像に選択が適用されることを確認します。
3. このROIの経時的な蛍光測定値のリストを生成し、それをスプレッドシートにエクスポートしてさらに処理します。ImageJ(FIJI)の プロットZ軸プロファイル を使用するか、選択した画像処理ソフトウェアの同様の機能を使用します。
4. スプレッドシートで、ステップ 5.10 のベースライン記録中に連続する 10 個のタイムポイントを代表的なベースラインとして選択します。平均と標準偏差を計算します。
5. ΔF/F をパーセンテージで求めるには、各時点の ((F - 平均ベースライン F)/ベースライン平均 F)*100) を計算します。ΔF/F を Z スコアとして取得するには、各時点の ((F - 平均ベースライン F)/標準偏差ベースライン F) を計算します。
6. 刺激中の蛍光のピーク変化を計算するには、蛍光が最も高い連続する3つのポイントを選択し、平均を計算します。
7. 各画像スタックに対して、刺激とフライを横切って繰り返します。
   注:これらの手順は、特定の顕微鏡、信号品質、および推奨される画像解析ソフトウェアに基づいて、必要に応じて調整してください。

図1は、この調製に使用したイメージングチャンバー(図1A、B)とワッシャーチップ(図1D)の詳細を示しています。図1はまた、ハエをマウントするための手順(図1C)、テングを所定の位置にワックスで固定(図1E)、関心のある脳領域を解剖(図1F)、および脳内の蛍光を記録しながらテイスタントでラベルを刺激する手順の主なステップを示しています(図1G)。Drosophila melanogasterの初代味覚受容体ニューロン(GRN)における味覚誘発反応を定量化するために、Gr64f-Gal4のUAS-GCaMP6f駆動発現を用いて、ラベル14,27,30,32,33,34,35のすべての糖感知GRNでカルシウム指標を遺伝的に発現させることが可能.これらの実験では、40 fps sCMOSカメラを搭載した正立蛍光顕微鏡、10倍および40倍対物レンズ、スピニングディスク共焦点、ダイクロイック488エミッター、488 nm固体レーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用しました。40倍対物レンズをAHLに浸し、SEZ脳領域を中心に配置して、これらのラベラGRNの軸索終末にベースラインGCaMPシグナルを特定しました(図2A)。蛍光画像は、ベースライン時(刺激なし)、味覚刺激の5秒間(刺激器がラベル上を移動)、および刺激後、蛍光がベースラインに戻るまで100ミリ秒ごとに取得されました(図2A、B)。水はネガティブコントロールとして、1 Mスクロースはポジティブコントロールとして使用されました。蛍光の相対的な変化は、13匹のハエについてΔF/F(zスコア)として計算され、味覚刺激中のカルシウム応答の動態を示すために経時的にプロットされました(図2B)。ピークΔF/F(zスコア)をプロットし、統計的な比較に使用して、これらの細胞のショ糖応答が水中よりも有意に高いことを示しました(図2C)。この手法は、「甘い」GRNがショ糖の発症時に強いピークを持ち、刺激期間中にいくらかの崩壊を伴って高いままであることを表しています。

比較のために、このプロトコルは、ラベル14,17,28,34,36上のすべての「苦い」GRNでUAS-GCaMP6fを特異的に発現する、異なるドライバーGr66a-Gal4のハエで繰り返されました。同様に、これらのGRNの軸索終末はSEZに位置していました:投影パターンが糖感知GRNとは異なることに注意してください(図2D)。蛍光は、ポジティブコントロールとして使用した100 mMカフェインを除いて、以前と同様に捕捉および分析しました。11匹のハエから平均化された曲線は、カフェイン刺激の開始とともに強いピークを示すが、特定の苦味刺激28で起こることが知られている刺激除去を伴う小さな「オフ」反応もある²⁸(図2E)。この方法では、「オン」と「オフ」の両方の応答を定量化して、味覚誘発反応の時間的パターンを特徴づけることができる^27,28。ここでは、「オン」のピークのみを定量化して、カフェインに対する反応が水よりも有意に強いことを示しました(図 2F)。図2の実験は再現性が高く、プロトコルが適切に機能していることを確認するために使用できます。

図1: ショウジョウバエ の脳における味覚誘発反応のイメージングのためのプロトコル図。 (A)一度に最大5匹のハエを取り付けるために使用されるカスタムイメージングチャンバーの上面図。(B)ハエが取り付けられているイメージングチャンバーの詳細で、 D.melanogasterの子宮頸部に快適にフィットする測定値。(C)足根をトリミングする場所(左上)と、鉗子を使用してフライをイメージングチャンバーの子宮頸部スロットに取り付ける方法(左下)を示すグラフィック。イメージングチャンバー内の正しい位置に取り付けられたハエの写真(右)。(D)ワックスチップの写真(左)、砥石を使用して標準チップを変更するときにターゲットとするおおよその形状とサイズを示すために先端の写真を拡大しました(右)。(E)鉗子を使用してテングを所定の位置にワックスするグラフィックイラスト(左)、適切にワックスを塗ったラベルムが取り付けられたハエの写真(右)。(F)AHLの関心領域と適用の脳領域の解剖を表すグラフィックイラスト(左)、SEZまたはSMPの脳領域を標的とするときに除去するキューティクルの領域の周りに点線の円を持つハエの写真。Xは、解剖のためにつまむキューティクルの領域を示します(右)。(G)グラフィックと写真は、マウント/解剖されたハエの位置、AHLの水浸対物レンズ、テングにテイスタントを施した刺激装置、およびこれらのソリューション間のバリアを形成するカバースリップを示しています。側面図は縮小表示 (左) し、上面図は 10x 対物レンズの下 (右) に表示しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:味覚刺激に対するラベルGRNのカルシウム応答の例(A)ベースライン時および1 Mスクロースに対するピーク応答中のGr64f>GCaMP6fのフライにおけるGCaMP蛍光のレベルを示す画像スタックから静止画をキャプチャしたもので、スケールバー= 20 μm。点線は、分析の ROI を示します。(B)n = 14匹のハエのカルシウム反応曲線は、ΔF/F(zスコア)として計算され、水(ネガティブコントロール)と1Mスクロース(ポジティブコントロール)を組み合わせて動力学を示します。曲線の下の黒い線は、刺激がラベルを超えていることを示します。(C)統計的比較のためにプロットされた各フライのピークΔF/F(zスコア)。対応のあるt検定、****p<0.0001。(D)ベースライン時および100 mMカフェインに対するピーク応答中のGr66a>GCaMP6fを使用したフライのGCaMP蛍光レベルを示すビデオから静止画をキャプチャし、スケールバー= 20 μm。点線は、分析の ROI を示します。(E)ΔF/F(zスコア)として計算され、水(ネガティブコントロール)と100 mMカフェイン(ポジティブコントロール)を組み合わせたn = 11ハエのカルシウム反応曲線は、動力学を示すために:小さな「オフ」反応に注目してください、曲線の下の黒い線は刺激がラベルを超えていることを示します。(F)統計的比較のためにプロットされた各フライのピークΔF/F(zスコア)。対応のあるt検定、****p < 0.0001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルの最も困難な側面の1つは、ラベルにワックスを塗って標的解剖を行うために必要なマイクロマニピュレーションの器用さです。この感覚器官全体で各感覚を均等に刺激し、関心のある脳領域を視覚化するためには、ラベルを固定するための追加のステップが必要です。ここで使用するカスタムイメージングチャンバーは 、D. melanogaster用に最適化されていますが、チャンバーの仕様とワックスがけアプローチは、他の昆虫用に変更する必要があるかもしれません。このプロトコルは、他の ショウジョウバエに ほとんど変更を加えずに適用できますが、ミツバチや蚊など、Brachycera亜目の他のメンバーは、唇の手掌と頭の形態の違いを説明するために、取り付けと解剖の手順を変更する必要がある場合があります。テイスタントデリバリーのためのマイクロマニピュレーターのアライメントも困難な場合があり、最適化のために特定の顕微鏡ステージでの初期テストが必要です。刺激中にワックスが壊れると、漏れが発生し、AHLと毛細血管のテイスタントが接触する可能性があります。毛細血管を引っ張り、砥石でヤスリで削り、ラベルにより近づけると、テイスタントとAHLが接触するのを防ぐことができます。漏れや過度の脳の動きを伴うハエは除外する必要があります。可能であれば、ワックスがけや解剖によってラベルとラベル神経が損傷を受けないように、常に各動物にポジティブコントロールを含めてください。ここに示されている「甘い」および「苦い」例は、頑健な対照実験として推奨されます。

ここで説明するin vivoカルシウムイメージングアプローチは、味覚受容体と味覚回路を同定するために、D. melanogasterの一次味覚ニューロン、高次ニューロン、およびSEZ全体における味覚誘発応答を定量化するために使用されています8,14,17,18,19,20,27,28,30,31^{、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、43、44、45、46、47、48}。このモデル生物の広範な用途は、容易に利用できるGal4およびsplit-Gal4ドライバーによるものです。したがって、遺伝子組み換え昆虫が特定の対象ニューロンでGCaMPを発現させる必要があることが、このアプローチの制限要因の1つです。幸いなことに、遺伝子編集技術の進歩により、これはモデル生物以外の昆虫でも利用しやすくなりつつあり、最近では、カルシウムイメージングを用いた味覚誘発応答が、害虫 のDrosophila suzukii⁴⁹ や媒介蚊⁵⁰に対して報告されている。すべてのカルシウムイメージングと同様に、目的のニューロンに対しては、S/N比の初期最適化が必要な場合があります。信号は、より明るいバージョンのGCaMPを使用し、GCaMPの2つのコピーを表現することで強化できます。標的ニューロンでRFPを共発現させることは、ベースラインで標的ニューロンを視覚化するのに役立ち、脈動する傾向がある領域の脳の動きを制御するのに役立ちます。

このプロトコルは、足根と触角を取り除き、上顎の触手をワックスで覆い、咽頭のGRNが刺激されないように摂取を制限することにより、ラベルから化学感覚を分離するように特別に設計されています。ただし、このプロトコルの調整は、足根骨または咽頭のGRNからの化学感覚を含めるように行うことができます。足根が無傷のままである場合、脚を単独で刺激するか、毛細血管の端にテイスタント溶液の大きな泡を作成することにより、ラベルに加えて刺激することができます。足根が無傷のままの場合、ハエがカバースリップを蹴って動かす可能性があります。したがって、基部近くの足根にワックスを塗ることは、不要な動きを防ぐのに役立つと考えることができます。現在の例は、咽頭GRN刺激を避け、SEZ内のラベル突起をよりよく視覚化するために食道を切断するステップを含むが、この同じ調製は、食道をそのままにして外側の咽頭突起をイメージングすることにより、咽頭GRN応答を定量化するために以前に適応されていた³⁶。この従来のアプリケーションは、ハエが自由に消費して咽頭GRNを刺激する食欲的な糖刺激を使用していましたが、ハエは苦い咽頭GRNを活性化するための嫌悪刺激を容易に消費しないため、このアプローチの1つの制限があります。さらに、 ショウジョウバエ¹¹ の翼に位置するGRNの応答は、このアプローチでは容易に研究できないという制限があります。

ここで述べるin vivoカルシウムイメージングは、高次味覚誘発応答^{を研究する}ための標準的な方法となっている^{8,18,19,20,28},^現在、ハエのテイスタントに対する一次ラベラGRN応答を定量化するための他のいくつかのアプローチがある。ここで説明するin vivoカルシウムイメージングアプローチは、脳の軸索終末におけるGCaMPの変化を記録するが、ラベラーGRNにおける細胞体GCaMPの定量化にはex vivoアプローチも使用されている³³。同様に、無傷のハエ⁵¹におけるラベルまたは足根GRNのいずれかの細胞体をイメージングするための別のマウントアプローチが記載されている。電気生理学は、昆虫13,16,32,52,53,54,55,56,57,58,59,60,64,62の一次味覚ニューロンの応答を研究するための一般的で効果的な手法であり続けています^{、63、64、65}。これは、遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを必要とせず、ニューロン活動のより直接的な定量化です。ただし、一度に記録できるセンシラは1つのセンシラからの応答のみですが、カルシウムイメージングはGRNの全集団から同時に記録できます。カルシウムイメージングアプローチは、特定の刺激^27,28に対するGRNの「オン」および「オフ」応答のユニークな時間的ダイナミクスを発見するために使用されましたが、D. melanogasterの味覚感知器の基底からの電気生理学的記録の最近の進歩により、活動電位⁵³のレベルで「オフ」応答を定量化できるようになりました.興味深いことに、空腹による一次GRN感受性の調節はカルシウムイメージングによって検出されましたが、電気生理学では活動電位のレベルでは検出されませんでした²⁹、それでも電気生理学的先端記録とカルシウムイメージングの両方が食事によるGRN感度の変化を捉えることができます^30,66。したがって、電気生理学は、味覚リガンドと受容体を同定し、さまざまな要因が一次味覚受容体ニューロンの感度をどのように調節するかを理解するために、カルシウムイメージングに対する重要で補完的なアプローチであり続けています。

著者には利益相反はなく、開示するものもありません。

フライストックについてはBloomington Drosophila Stock Center、カスタムイメージングチャンバーの製作に協力してくださったUniversity of Vermont IMF Labsに感謝いたします。また、グラフィックイラストの作成に携わったBioRenderと、これらのグラフィックのデザインに貢献したKayla Audetteにも感謝します。この研究は、バーモント大学と全米科学財団の賞番号2332375からの新しいラボスタートアップ資金によって支援されました。 図 1 のグラフィックスは、www.BioRender.com を使用して生成されました。