في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للاستجابات العصبية الناجمة عن التذوق في ذبابة الفاكهة البالغة

يتيح نهج تصوير الكالسيوم تسجيل الاستجابات التي يسببها الذوق في أدمغة الذباب المستيقظ أثناء تطبيق محلول على الملصق. تستخدم الاستجابات الذوقية الأولية في ذبابة الفاكهة السوداء كمثال ، ولكن يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة الخلايا العصبية النهائية أو الأنواع الأخرى.

منذ ما يقرب من عقدين من الزمن ، كان تصوير الكالسيوم في الجسم الحي طريقة فعالة لقياس الاستجابات الخلوية لمنبهات التذوق في الكائن الحي النموذجي لذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة السوداء. تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لهذه المنهجية في قدرتها على تسجيل الاستجابات العصبية الناجمة عن التذوق في المستيقظة دون الحاجة إلى التخدير. يستخدم هذا النهج أنظمة التعبير الثنائي (على سبيل المثال ، Gal4-UAS) للتعبير عن مؤشر الكالسيوم GCaMP في خلايا عصبية محددة ذات أهمية. يصف هذا البروتوكول إجراء يتم فيه تركيب الذباب الذي يعبر عن GCaMP مع وضع الملصق بشكل آمن ، مما يتيح تسجيل التألق في الدماغ بدقة مللي ثانية تحت مجهر متحد البؤر بينما يتم تطبيق محلول على الملصق ، مما يحفز جميع حساسيات طعم الملصق. تركز الأمثلة المقدمة على استجابات الكالسيوم في الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية الأولية ل D. melanogaster. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا النهج للتسجيل من الخلايا العصبية الأخرى ذات الأهمية داخل دماغ ذبابة الفيليد أو أنواع الحشرات الأخرى. تمكن طريقة التصوير هذه الباحثين من تسجيل استجابات الكالسيوم الجماعية في وقت واحد من مجموعات الخلايا العصبية الذوقية عبر الملصق ، مكملة تسجيلات الأطراف الفيزيولوجية الكهربية التي تحدد إمكانات العمل من الخلايا العصبية الفردية. كانت تقنية تصوير الكالسيوم في الجسم الحي الموضحة هنا مفيدة في الكشف عن الآليات الجزيئية والخلوية للتحسس الكيميائي ، وتحديد أنماط الاستجابة الزمنية الفريدة في الخلايا العصبية للتذوق الأولية ، والتحقيق في آليات تعديل التذوق ، واستكشاف معالجة الذوق في الدوائر النهائية.

ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة السوداء ، يتم الاحتفال بها لأدوات البحث الجيني القوية المتوفرة في هذا الكائن الحي النموذجي. توفر هذه الأدوات القدرة على معالجة جينات معينة بسهولة في الخلايا المستهدفة ، مما يجعلها مثالية لاستكشاف الدوائر العصبية الأساسية مثل الرؤية والحساسية الكيميائية^1،2،3. يعد التصديق ، من خلال التحس الكيميائي التلامس ، مسارا عصبيا رئيسيا ينظم السلوكيات التي تنطوي عليها التغذية والتزاوج والتكاثر ، وفي النهاية بقاء ولياقتها^{4،5،6،7،8،9}. يتطلب فهم كيفية ترميز هذه المعلومات الحسية الكيميائية المهمة ونقلها وصف نشاط الخلايا العصبية في الدوائر التي يتم تنشيطها بواسطة محفزات التذوق.

في D. melanogaster ، توجد الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية الخارجية (GRNs) على الأرجل الأمامية والخرطوم والأجنحة^10،11. يحتوي الملصق ، في نهاية خرطوم ، على هياكل تشبه الشعر تسمى sensilla والتي يمكن تعيينها من خلال مورفولوجيتها بناء على الحجم: طويل (من النوع L) ، متوسط (من النوع I) ، وقصير (النوع S) ¹⁰. تتركز معظم GRNs على هذا العضو الحسي ، حيث تحتوي كل حسية على 2-4 أنواع مختلفة من GRNs بحيث تنتشر كل طريقة تذوق عبر الملصق^{12،13،14،15}. بينما يمكن استخدام تسجيلات الأطراف الفيزيولوجية الكهربية لتحديد إمكانات الفعل القادمة من GRNs في حس^{واحد 16} ، في الجسم الحي ، يمكن استخدام تصوير الكالسيوم لعزل نشاط نوع معين من GRN عبر العلامة^{الكاملة 14،17}. يمكن أيضا استخدام تقنية تصوير الكالسيوم نفسها لدراسة الاستجابات العصبية في دوائر التذوق^{النهائية 18،19،20}. يتطلب تصوير الكالسيوم أنظمة تعبير ثنائية ، مثل Gal4-UAS^21،22،23 ، وعبور خط تشغيل يحتوي على منشطات نسخ خاصة بالخلية إلى خط مستجيب للحصول على تعبير عن GCaMP في الخلايا العصبية ذات الأهمية. عندما ترتفع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، تزداد مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في شدة التألق بحيث يرتبط مستوى التألق بالتغيرات في نشاط الخلايا العصبية^24،25.

هنا ، يتم وصف طريقة لاستخدام تصوير الكالسيوم لمراقبة الاستجابات العصبية لمنبهات التذوق في الجسم الحي. الهدف العام من هذه الطريقة هو تحفيز GRNs فقط لتحديد الاستجابات العصبية التي يسببها الذوق في أدمغة الذباب المستيقظ. يتم تقديم أمثلة لاستخدام هذه الطريقة لتسجيل الاستجابات في GRNs الأولية للعلامة في D. melanogaster ، وتناقش فوائد وتحديات استخدام هذا النهج. تم تطوير هذا المستحضر للسماح للمجربين بالقدرة على تطبيق محلول طمس على علامة ذبابة ثابتة أثناء وجوده تحت مجهر متحد البؤر لتسجيل الاستجابات العصبية عندما يكون العضو الحسي بأكمله مغمورا في محلول ، والذي يحدث في البيئات الطبيعية. يمكن استخدام نهج تصوير الكالسيوم في الجسم الحي الموصوف هنا للكشف عن تفاعلات مستقبلات الطعم^{الجديدة 8،14،26،27} ، والتفاصيل الزمنية لاستجابات GRN^27،28 ، والآليات الجزيئية لتعديل GRN^29،30 ، ومعالجة الذوق في الدوائر النهائية^{8،18،19،20 ، 28،31}.

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير محلول شبيه بالهيموليمف للبالغين (AHL)

1. تحضير محلول مخزون يحتوي على 108 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 4 ملي من هيدروكسيد الصوديوم₃ ، و 1 ملي مولار من هيدروهيدرات_{الصوديوم 2}PO₄ ، و 5 ملي مولار من HEPES ، و 15 ملي مولار من الريبوز.
   ملاحظة: يستخدم الريبوز كسكر غير نشط للحفاظ على الأسمولية دون تغيير مستويات المغذيات في الدماغ.
2. اضبط درجة الحموضة لهذا المحلول على 7.5 قبل التصفية والتخزين عند 4 درجات مئوية. تحقق من أسمولية AHL بعد ضبط الرقم الهيدروجيني لضمان الاتساق عبر المستحضرات.
3. قم بإعداد مخزونات منفصلة من 1 متر من CaCl₂ و 1 M من MgCl₂ ، وقم بتصفيتها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
4. لتحضير حصة من مخزون AHL الرئيسي ، أضف كمية صغيرة من الكالسيوم والمغنيسيوم للحصول على تركيزات نهائية تبلغ 2 ملي مولار من الكالسيوم و 8.2 ملي مولار من المغنيسيوم. يمكن تخزين AHL هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدامه لمدة تصل إلى شهر واحد ، باستخدام حصص صغيرة يتم إحضارها إلى درجة حرارة الغرفة للتجارب.

2. تصاعد الذباب على غرفة التصوير

1. قبل تركيب الذباب ، شحذ طرف شمع الأسنان في كوب صغير مدبب باستخدام حجر شحذ (الشكل 1 د). اربط الطرف الحاد بالشمع وقم بتشغيله للتسخين المسبق. تعتمد إعدادات الحرارة على نوع الطرف وطوله: هناك حاجة إلى درجة حرارة دنيا تسمح للشمع بالبقاء ذائبا عند التلامس (50.5 درجة مئوية تعمل في هذا المثال).
   ملاحظة: يمكن لف سلك حول نهاية جهاز شمع الأسنان لتثبيت طرف معدني حاد كبديل.
2. تخدير 1-5 ذباب بلطف (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). قلل من وقت التعرض للتخدير ، حيث يمكن أن تؤثر فترات التعرض للفترة طويلة لثاني أكسيد_{الكربون 2 أو} البرد على السلوك. بالنسبة لثاني أكسيد الكربون₂ ، استخدم وسادة ذبابة توفر تدفقا مستمرا ومتساويا بنسبة 99.9٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ بمعدل 5 لتر / دقيقة تحت مجهر التشريح.
3. استخدم مقص التشريح لإزالة أجزاء من الساقين عن طريق قطع الساقين الوسطى والخلفية عند مفصل الفخذ / الظنبوب والساقين الأماميتين عند المدور. استخدم ملقطا غير حاد للمساعدة في التلاعب بالذبابة. سيمنع تقليم الترسي الإحساس بالرصغ وركل الغطاء أو محفز التذوق.
4. التقط الذبابة من الأجنحة باستخدام ملقط حاد لوضع الذبابة بحيث يكون الرأس فوق فتحة عنق الرحم المستهدفة في غرفة التصوير ، لكن الجسم أدناه. من المفيد أن تبدأ الذبابة بالكامل إلى اليمين أو اليسار. باستخدام الجانب الحاد من المقص والملقط غير الحاد ، ادفع الرأس والصدر برفق في وقت واحد في الفتحة.
5. بمجرد الدخول إلى الفتحة بشكل آمن ، ادفع الذبابة إلى الجزء الخلفي من الفتحة وأعد وضعها برفق بحيث تواجه الذبابة مقدمة الغرفة. تجنب تدوير الرأس بعيدا جدا عن محاذاة الصدر.
6. كرر ذلك لأكبر عدد ممكن من الذباب حسب الحاجة (يمكن لغرفة التصوير هذه تركيب ما يصل إلى 5 ذباب).
7. اجمع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر في نهاية عود الأسنان وقم بتطبيق طبقة رقيقة لتثبيت رأس الذبابة في غرفة التصوير.
   ملاحظة: تعتمد المنطقة الدقيقة لتطبيق طلاء الأظافر على أي جزء من الدماغ يتم تصويره. في حالة تصوير المنطقة الاقتصادية الخاصة (كما هو موضح هنا) أو غيرها من المناطق الإنسية السفلية ، يمكن تطبيق طلاء الأظافر بسخاء على الجزء العلوي من رأس الذبابة ، ولكن لتصوير المناطق الإنسية العليا ، يمكن تطبيق طلاء الأظافر بأقل قدر ممكن على الجزء العلوي من الرأس وإضافته بشكل جانبي بالقرب من العينين لترك هذه المنطقة خالية للتشريح. تم تحسين هذا البروتوكول لتحفيز التذوق فقط بدون شم، ولكن إذا كانت المواد المتطايرة في طلاء الأظافر مصدر قلق، فاستخدم الشمع أو غراء الأشعة فوق البنفسجية كطرق بديلة لتأمين رأس الذبابة.

3. إزالة الشعر بالشمع في وضع ممتد

1. التقط الشمع بيد واحدة واجمع قطرة صغيرة من الشمع على الحافة.
2. من ناحية أخرى ، استخدم ملقطا شبه حاد للاستيلاء على ملامسة الفك العلوي وسحب خرطوم برفق وإمساكه في امتداد كامل.
   ملاحظة: احرص على الإمساك باللمس الفكي العلوي فقط لأن الضغط على بشرة على خرطوم يزيد من احتمالية التلف. لا تتابع إذا كان خرطوم مضغوطا أو تم ثقب بشرة الخطوم. يمكن استخدام طائر ذبابة صغير كبديل للملقط لسحب خرطوم باستخدام الشفط أثناء تطبيق الشمع.
3. المس طرف الشمع إلى الغرفة بالقرب من قاعدة خرطوم حتى يبدأ الشمع في التدفق ، ثم تحرك للتلامس مع قاعدة خرطوم. قم بالشمع في منتصف الطريق أسفل العمود ، لكن تجنب لمس حساسيات الملصق بالشمع أو الشمع. الشمع الموجود على هذا الجانب سيثبت خرطوم في مكانه. لا تتابع إذا تم لمس الشمع أو الشمع في أي وقت.
4. ضع الشمع بالطريقة المذكورة أعلاه للجانب الآخر ، مما يجعل جسرا مستمرا من الشمع فوق خرطوم.
5. قم بتمديد خرطوم بالكامل بشكل مستقيم قدر الإمكان. إذا لزم الأمر ، يمكن تحريك خرطوم عن طريق إعادة تسخين الشمع ودفع خرطوم برفق إلى الموضع المطلوب.
6. كرر ذلك لتركيب الذباب الآخر في نفس الغرفة.
7. قم بإيقاف تشغيل ثاني أكسيد الكربون₂ أو إزالة الذباب من التخدير على الجليد. ضع الذباب المركب في حجرة الرطوبة لمدة 60 دقيقة للتعافي (صندوق طرف ماصة نظيف وفارغ مع مناديل مبللة وخالية من النسالة).

4. تشريح للكشف عن منطقة الدماغ التي تهمك

1. قم بإزالة الذباب من غرفة الرطوبة. يجب أن يكون الذباب على قيد الحياة بشكل واضح ، ويحرك بنشاط بطنه وساقيه وهوائياته. قم بإعداد المجهر متحد البؤر أو المجهر ثنائي الفوتون قبل التشريح.
2. قم بتشغيل الشمع لإصلاح الفواصل المحتملة في الشمع أثناء التشريح وإعداد درجة حرارة الغرفة AHL.
3. باستخدام ملقط حاد جدا ، اضغط على كلا الهوائيين ، ثم اضغط على البشرة لتوفير ثقب لإدخال جانب واحد من الملقط الحاد. مرر الملقط أسفل البشرة لإزالتها من المنطقة التي تغطي منطقة الدماغ التي تهمك. يشير الشكل 1F إلى X فوق مناطق البشرة لاستهدافها بالملقط للإزالة.
4. اغسل الدماغ المكشوف في AHL عن طريق تطبيق AHL بسخاء (~ 100 ميكرولتر) على الرأس ثم إزالة كل طبقة رقيقة من AHL لمنع الدماغ من الجفاف.
   ملاحظة: إذا انكسر الشمع في أي وقت ويحتاج إلى إصلاح ، فقم بإزالة كل AHL لفترة وجيزة من حول الرأس قبل إعادة تسخين الشمع لإعادة تأمين خرطوم في الوضع الممتد.
5. باستخدام ملقط حاد، قم بإزالة الأكياس الهوائية وأي حطام كبير يغطي الدماغ. تجنب اختراق الدماغ عن طريق إبقاء أطراف الملقط مرئية.
6. يغسل باستخدام AHL ~ 3 مرات لإزالة جميع الحطام الصغير.
7. تأكد من أن منطقة الدماغ التي تهمك مرئية بوضوح. لتصوير المنطقة تحت المريء (SEZ) على وجه التحديد كما في هذا المثال ، قم بقص المريء في القاعدة بالقرب من خرطوم وبالقرب من النقطة التي يمر فيها عبر الدماغ عن طريق الضغط باستخدام ملقط حاد جدا وإزالة هذه القطعة لفضح المنطقة الاقتصادية الخاصة.
   ملاحظة: لا يمكن للذباب تناول المحاليل بعد إزالة المريء ، ولا يمكن أن يحدث تنشيط GRN البلعومي.
8. تحت مجهر التشريح ، ضع زلة الغطاء مقاس 10 مم × 20 مم في الفتحة الزاوية لغرفة التصوير. تأكد من أنه يقع في قاعدة خرطوم دون كسر الشمع. يجب ألا يلمس طرف الملصق الغطاء.

5. التصوير وتحفيز التذوق

1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر أو المجهر ثنائي الفوتون وكن مستعدا لالتقاط الصور. قم بإعداد معالج دقيق بأنبوب شعري يتم وضعه لتوصيل المذاق إلى الذبابة أثناء وجودها على مرحلة المجهر.
   ملاحظة: يمكن للتصوير ثنائي الفوتون التقاط التألق من الخلايا العصبية العميقة في أنسجة الدماغ.
2. قم بتحميل ~ 2 ميكرولتر من الماء (أو عنصر تحكم سلبي آخر) في الأنبوب الشعري للأنبوب الشعري
   محفز على مرحلة المجهر.
3. ابحث عن الذبابة المقطوعة وركز على الملصق باستخدام المجال الساطع للغمر في الهواء 10x. قم بمحاذاة الشعيرات الدموية مع التسمية تحت طريقة العرض هذه. يمكن تضمين كاميرات إضافية موجهة إلى علامة الذبابة لعرض محاذاة الشعيرات الدموية مع الذبابة من زوايا متعددة.
   ملاحظة: تأكد من تحفيز جميع حساسات الملصق بالمحلول أثناء المحاذاة ؛ إذا لم يكن موضع المحفز أو الملصق عموديا بدرجة كافية لهذا الغرض ، فاضبطه وفقا لذلك. يمكن سحب الشعيرات الدموية ورفعها بحجر شحذ لتوفير ملاءمة أكثر إحكاما حول الملصق.
4. اترك الشعيرات الدموية في وضع الملصق مباشرة ، وأغلقها ولكن لا تلمسها.
5. حرك المرحلة بحيث تتمركز منطقة الدماغ محل الاهتمام وقم بالتبديل إلى هدف تكبير أعلى وغمر الماء (40x مستخدم في هذا المثال).
6. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من AHL أعلى الدماغ للاتصال بهدف الغمر. قم بإزالة أي فقاعات.
7. قم بتوجيه التركيز باستخدام المجال الساطع للتحرك بعناية في المستوى z للعثور على حافة البشرة التي تمت إزالتها وتوسيط منطقة الدماغ التي تهمك.
8. قم بالتبديل إلى طاقة ليزر 488 نانومتر للعثور على تعبير GCaMP في مجال الاهتمام.
   ملاحظة: اعتمادا على خط التشغيل وإصدار GCaMP المستخدم ، قد تكون هناك حاجة إلى بعض التحسين الأولي لتضخيم الإشارة إلى ضوضاء للاستعدادات الفردية. يمكن أن يكون التعبير المشترك عن RFP مفيدا للخلايا العصبية ذات التألق الأساسي المنخفض GCaMP.
9. قم بإعداد مجموعة صور بفاصل زمني. ستعتمد السرعة على المجهر المحدد وإشارة GCaMP ، ولكن التقاط صورة واحدة على الأقل كل ~ 100 مللي ثانية هو الأمثل.
   ملاحظة: سيؤدي التقاط مستوى Z واحد من التألق بمرور الوقت إلى تحسين سرعة الالتقاط لتوفير حركية مفصلة للكالسيوم. قد تؤدي مكدسات الصور الملتقطة في مستويات Z متعددة في كل نقطة زمنية إلى إبطاء معدلات الالتقاط ، ولكنها ستسجل الاستجابات عبر الخلايا العصبية الموجودة على أعماق مختلفة في الأنسجة.
10. بعد جمع ما لا يقل عن 5 ثوان من مضان خط الأساس ، حرك المحفز يدويا بحيث يغطي الشعيرات الدموية الملصق لفترة زمنية محددة (5 ثوان في هذا المثال) ، ثم قم بإزالة المنبه والتقاطه طالما رغبت في ذلك.
11. قم بإزالة AHL والعودة إلى المجال الساطع 10x للتأكد من أن الغطاء والمحفز والملصق لا يزالان في نفس الموضع.
    ملاحظة: إذا لم يكن المحفز محاذاة جيدا مع الملصق أو تم تدويره بعيدا جدا ، فيمكن تحريك الملصق ، أو يمكن أن تصطدم الشعيرات الدموية بغرفة التصوير ، مما قد يؤدي إلى كسر الشمع وخلق تسرب من AHL.
12. قم بإزالة غرفة التصوير. استخدم منديلا خاليا من النسالة لإزالة المحلول الأول وغسل الماصة بالماء. ثم ، قم بإدخال الماصة ~ 2 ميكرولتر من الطعم التالي في الأنبوب الشعري.
13. حرك غرفة التصوير مرة أخرى إلى المسرح وكرر الخطوات 5.4-5.12 لهذا الحل.
    ملاحظة: يؤدي التوتر السطحي العالي لمعظم أنواع الطعمات إلى وجود مواد كيميائية متبقية من البقاء على ملصق الذبابة. ومع ذلك ، إذا كانت المذقات شديدة التشبع أو لزجة ، فيمكن تحريك الماء فوق الملصق عدة مرات لغسل العضو الحسي قبل المنبه التالي.
14. كرر للحصول على العديد من الحلول حسب الرغبة لهذه الذبابة.
15. ارجع إلى الخطوة 3 لإعداد الذبابة التالية للتصوير.

6. تحليل الصور

1. افتح مكدس الصور المراد تحليله في برنامج معالجة الصور. إذا لزم الأمر، قم بإجراء طرح في الخلفية باستخدام منطقة خارج إشارة GCaMP.
2. حدد منطقة اهتمام ضيقة (ROI) حول الإسقاطات المراد قياسها كميا باستخدام أداة اليد الحرة أو الشكل وتأكد من تطبيق التحديد على جميع الصور الموجودة في المكدس.
3. قم بإنشاء قائمة بقراءات التألق بمرور الوقت لعائد الاستثمار هذا وقم بتصديره إلى جدول بيانات لمزيد من المعالجة. استخدم ملف تعريف المحور Z في ImageJ (FIJI) أو وظيفة مماثلة في برنامج معالجة الصور المفضل.
4. في جدول البيانات، حدد 10 نقاط زمنية متتالية أثناء تسجيل الخط الأساسي في الخطوة 5.10 كخط أساس تمثيلي. احسب المتوسط والانحراف المعياري.
5. للحصول على ΔF / F كنسبة مئوية ، احسب ((F - متوسط خط الأساس F) / متوسط خط الأساس F) * 100) لكل نقطة زمنية. للحصول على ΔF / F كدرجة z ، احسب ((F - متوسط خط الأساس F) / خط الأساس للانحراف المعياري F) لكل نقطة زمنية.
6. لحساب ذروة التغيير في التألق أثناء التحفيز ، حدد 3 نقاط متتالية بأعلى مضان واحسب المتوسط.
7. كرر لكل مجموعة صور عبر المحفزات والذباب.
   ملاحظة: قم بتكييف هذه الخطوات حسب الحاجة بناء على المجهر المحدد وجودة الإشارة وبرنامج تحليل الصور المفضل.

يوفر الشكل 1 تفاصيل غرفة التصوير (الشكل 1 أ ، ب) وطرف الشمع (الشكل 1 د) المستخدم في هذا المستحضر. يوضح الشكل 1 أيضا الخطوات الرئيسية لإجراء تركيب الذباب (الشكل 1 ج) ، وإزالة الخرطوم بالشمع في مكانه (الشكل 1 ه) ، وتشريح منطقة الدماغ محل الاهتمام (الشكل 1F) ، وتحفيز الملصق باستانت أثناء تسجيل التألق في الدماغ (الشكل 1 ز). لتحديد الاستجابات التي يسببها الذوق في الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية الأولية (GRNs) ذبابة الفاكهة السوداء الذباب مع Gr64f-Gal4 ، تم إنتاج تعبير القيادة ل UAS-GCaMP6f للحصول على مؤشر الكالسيوم المعبر عنه وراثيا في جميع GRNs "الحلوة" المستشعرة للسكر من الملصق^{14،27،30،32،33،34،35}. في هذه التجارب ، تم استخدام مجهر متحد البؤر بالمكونات التالية: مجهر فلوري عمودي مع كاميرا sCMOS 40 إطارا في الثانية ، وأهداف 10x و 40x ، وقرص دوارة ، وبواعث ثنائية اللون 488 ، وليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر. تم غمر هدف 40x في AHL وتركز على منطقة دماغ المنطقة الاقتصادية الخاصة لتحديد إشارة GCaMP الأساسية في المحطات المحورية لهذه GRNs (الشكل 2 أ). تم التقاط صورة مضان كل 100 مللي ثانية أثناء خط الأساس (بدون تحفيز) ، وخلال 5 ثوان من تحفيز التذوق (تحرك المحفز فوق الملصق) ، وبعد التحفيز حتى عاد التألق إلى خط الأساس (الشكل 2 أ ، ب). تم استخدام الماء كعنصر تحكم سلبي ، وتم استخدام 1 م من السكروز كعنصر تحكم إيجابي. تم حساب التغيير النسبي في التألق على أنه ΔF / F (درجة z) ل 13 ذبابة وتم رسمه بمرور الوقت لإظهار حركية استجابات الكالسيوم أثناء تحفيز التذوق (الشكل 2 ب). تم رسم ذروة ΔF / F (درجة z) واستخدامها للمقارنات الإحصائية للإشارة إلى أن استجابة السكروز في هذه الخلايا أعلى بكثير من الماء (الشكل 2 ج). تلتقط هذه التقنية أن GRNs "الحلوة" لها ذروة قوية عند ظهور السكروز والتي تظل مرتفعة مع بعض التسوس خلال فترة التحفيز.

للمقارنة ، تم تكرار هذا البروتوكول في الذباب بسائق مختلف ، Gr66a-Gal4 ، معبرا عن UAS-GCaMP6f على وجه التحديد في جميع GRNs "المريرة" على الملصق^{14،17،28،34،36}. وبالمثل ، كانت المحطات المحورية لهذه GRNs موجودة في المنطقة الاقتصادية الخاصة: لاحظ أن نمط الإسقاط يختلف عن GRNs المستشعرة للسكر (الشكل 2 د). تم التقاط التألق وتحليله كما كان من قبل ، باستثناء 100 ملي مولار من الكافيين ، والذي تم استخدامه كعنصر تحكم إيجابي. يظهر المنحنى الذي تم قياسه من 11 ذبابا ذروة قوية مع بداية تحفيز الكافيين ، ولكن هناك أيضا استجابة "إيقاف" صغيرة مع إزالة المنبه المعروف أنه يحدث مع بعض المحفزات المريرة²⁸ (الشكل 2 ه). تسمح هذه الطريقة بقياس الاستجابات "التشغيل" و "الإيقافية" لتوصيف الأنماط الزمنية للاستجابات التي يسببها الذوق^27،28. هنا ، تم تحديد القمم "على" فقط للإشارة إلى أن الاستجابة للكافيين أقوى بكثير من الماء (الشكل 2F). التجارب الواردة في الشكل 2 قابلة للتكرار بدرجة كبيرة ويمكن استخدامها لضمان عمل البروتوكول بشكل صحيح.

الشكل 1: الرسوم التوضيحية للبروتوكول لتصوير الاستجابات التي يسببها الذوق في ذبابة الفاكهة الدماغ. (أ) منظر علوي لغرفة التصوير المخصصة المستخدمة لتركيب ما يصل إلى خمسة ذباب في المرة الواحدة. (ب) تفاصيل غرفة التصوير حيث يتم تركيب الذباب بقياسات تناسب بشكل مريح عنق الرحم ل D. melanogaster. (ج) رسومات تشير إلى مكان قص رسغ الرغ (أعلى اليسار) وكيفية تركيب الذبابة في فتحة عنق الرحم في غرفة التصوير باستخدام ملقط (أسفل اليسار). صورة لذبابة مثبتة في الموضع الصحيح في غرفة التصوير (يمين). (د) صورة لطرف الشمع (يسار) ، صورة مكبرة للطرف للإشارة إلى الشكل والحجم التقريبيين المطلوب استهدافهما عند استخدام حجر شحذ لتعديل الطرف القياسي (يمين). (ه) رسم توضيحي لإزالة البطلوم بالشمع في مكانه باستخدام ملقط (يسار) ، صورة لذبابة مثبتة بعلامة مشمعة بشكل صحيح (يمين). (و) رسم توضيحي يمثل تشريح منطقة الدماغ ذات الاهتمام وتطبيق AHL (يسار) ، صورة لذبابة ذات دوائر منقطة حول منطقة البشرة لإزالتها عند استهداف مناطق الدماغ SEZ أو SMP. يشير X إلى مناطق من البشرة التي يجب قرصها من أجل التشريح (يمين). (ز) تشير الرسومات والصور إلى موضع الذبابة المركبة / التشريح ، وهدف الغمر في الماء في AHL ، والمحفز الذي يحتوي على خرطوم ، والغطاء الذي يشكل حاجزا بين هذه المحاليل. تم تصغير المنظر الجانبي (يسار) ، وكان المنظر العلوي أسفل هدف 10x (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مثال على استجابات الكالسيوم ل GRNs الملصقات لمنبهات التذوق. (أ) لا يزال يلتقط من مكدس صور يشير إلى مستوى مضان GCaMP في ذبابة مع Gr64f >GCaMP6f عند خط الأساس وأثناء ذروة الاستجابة ل 1 M سكروز ، شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الخطوط المنقطة إلى عائد الاستثمار للتحليل. (ب) منحنيات استجابة الكالسيوم ل n = 14 ذبابة محسوبة على أنها ΔF / F (درجة z) ومجتمعة للماء (التحكم السلبي) و 1 M السكروز (التحكم الإيجابي) لإظهار الحركية. يشير الخط الأسود أسفل المنحنيات إلى الوقت الذي يكون فيه الحافز فوق الملصق. (ج) ذروة ΔF / F (درجة z) لكل ذبابة مرسومة للمقارنات الإحصائية. اختبار t المزدوج ، **** ص < 0.0001. (د) لا يزال يلتقط من مقطع فيديو يشير إلى مستوى مضان GCaMP في ذبابة مع Gr66a>GCaMP6f عند خط الأساس وأثناء ذروة الاستجابة ل 100 ملي مولار من الكافيين ، شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الخطوط المنقطة إلى عائد الاستثمار للتحليل. (ه) منحنيات استجابة الكالسيوم ل n = 11 ذبابة محسوبة على أنها ΔF / F (درجة z) ومجتمعة للماء (التحكم السلبي) و 100 ملي مولار من الكافيين (التحكم الإيجابي) لإظهار الحركية: لاحظ استجابة "إيقاف" صغيرة ، يشير الخط الأسود أسفل المنحنيات إلى متى يكون المنبه فوق الملصق. (و) ذروة ΔF / F (درجة z) لكل ذبابة مرسومة للمقارنات الإحصائية. اختبار t المزدوج ، **** ص < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أحد أكثر الجوانب تحديا في هذا البروتوكول هو براعة المعالجة الدقيقة اللازمة لإزالة الشمع وإجراء التشريح المستهدف. خطوة إضافية لتأمين الملصق ضرورية لتحفيز كل حس بالتساوي عبر هذا العضو الحسي وتصور مناطق الدماغ ذات الأهمية. تم تحسين غرفة التصوير المخصصة المستخدمة هنا ل D. melanogaster ، ولكن قد تحتاج مواصفات الغرفة وطريقة إزالة الشعر بالشمع إلى التعديل للحشرات الأخرى. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على ذبابة الشوكة الأخرى مع القليل من التعديل ، ولكن الأعضاء الآخرين في الرتبة الفرعية Brachycera ، مثل النحل والبعوض ، قد يحتاجون إلى تغييرات في خطوات التركيب والتشريح لحساب الاختلافات في ملامسة الشفرين ومورفولوجيا الرأس. يمكن أن تكون محاذاة المعالج الدقيق لتسليم الأذينة صعبة أيضا وتتطلب اختبارا أوليا مع مرحلة المجهر المحددة للتحسين. إذا تم كسر الشمع أثناء التحفيز ، فقد يؤدي ذلك إلى حدوث تسريبات حيث يتلامس AHL و tastant في الشعيرات الدموية. يمكن أن يساعد سحب الشعيرات الدموية وحفظها بحجر شحذ لتلائم الملصق بشكل وثيق على منع التاستانت و AHL من الاتصال. يجب استبعاد الذباب الذي يعاني من أي تسرب أو حركة مفرطة للدماغ. عندما يكون ذلك ممكنا ، قم دائما بتضمين تحكم إيجابي لكل لضمان عدم تلف أعصاب الملصق والملصق من إزالة الشعر بالشمع أو التشريح. يوصى باستخدام الأمثلة "الحلوة" و "المريرة" الموضحة هنا كتجارب تحكم قوية.

تم استخدام نهج تصوير الكالسيوم في الجسم الحي الموصوف هنا لتحديد الاستجابات التي يسببها الذوق في الخلايا العصبية للتذوق الأولية ، والخلايا العصبية ذات الترتيب الأعلى ، والمنطقة الاقتصادية الخاصة بأكملها في D. melanogaster لتحديد المستقبلات والدوائر الذوقية^{8،14،17،18،19،20،27،28،30،31 ،34،35،36،37،38،39،40،41 ،
42،43،44،45،46،47،48}. ترجع التطبيقات الواسعة النطاق في هذا الكائن الحي النموذجي إلى برامج تشغيل Gal4 و split-Gal4 المتوفرة بسهولة. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى الحشرات المعدلة وراثيا للحصول على GCaMP المعبر عنها في خلايا عصبية محددة ذات أهمية هي أحد العوامل المقيدة لهذا النهج. لحسن الحظ ، مع التقدم في تكنولوجيا تحرير الجينات ، أصبح هذا أكثر سهولة للحشرات خارج الكائنات الحية النموذجية ، وقد تم الإبلاغ مؤخرا عن الاستجابات الناجمة عن الذوق باستخدام تصوير الكالسيوم للآفة ذبابة الفاكهة سوزوكي⁴⁹ والبعوض الحامل^{للنواقل 50}. كما هو الحال مع جميع صور الكالسيوم ، قد يكون بعض التحسين الأولي للإشارة إلى ضوضاء ضروريا للخلايا العصبية المستهدفة ذات الأهمية. يمكن تحسين الإشارات باستخدام إصدارات أكثر إشراقا من GCaMP وعن طريق التعبير عن نسختين من GCaMP. يمكن أن يساعد التعبير المشترك عن RFP في الخلايا العصبية المستهدفة في تصور الخلايا العصبية المستهدفة عند خط الأساس ويمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم في حركة الدماغ في المناطق التي لديها ميل إلى النبض.

تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا لعزل التحسس الكيميائي عن الملصق عن طريق إزالة الرسغ والهوائيات ، وإزالة الشعر بالشمع فوق ملامسة الفك العلوي ، والحد من الابتلاع بحيث لا يتم تحفيز GRNs البلعومي. ومع ذلك ، يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول لتشمل التحسس الكيميائي من GRNs الرصغي أو البلعومي. إذا تركت الرسغ سليمة ، فيمكن تحفيز الساقين بمفردها أو بالإضافة إلى الملصق عن طريق إنشاء فقاعة كبيرة من محلول الطعم في نهاية الشعيرات الدموية. هناك احتمال أن تركل الذبابة وتتحرك الغطاء إذا تركت الترسي سليمة. لذلك ، يمكن اعتبار إزالة القصغ بالشمع بالقرب من القاعدة للمساعدة في منع الحركات غير المرغوب فيها. يتضمن المثال الحالي خطوة قطع المريء لتجنب تحفيز GRN البلعومي وتصور إسقاطات الملصقات بشكل أفضل في المنطقة الاقتصادية الخاصة ، ولكن تم تكييف هذا المستحضر نفسه مسبقا لتحديد استجابات GRN البلعومية عن طريق ترك المريء سليما وتصوير إسقاطات البلعوم الجانبية³⁶. استخدم هذا التطبيق السابق محفزا للسكر فاتح للشهية ، والذي يستهلكه الذباب بحرية لتحفيز GRNs البلعومي ، لكن الذباب لن يستهلك بسهولة حافزا مكروها لتنشيط GRNs البلعومي المر ، وهو أحد قيود هذا النهج. هناك قيود إضافية تتمثل في أن استجابات GRNs الموجودة في أجنحة ذبابة الفاكهة¹¹ لا يمكن دراستها بسهولة باستخدام هذا النهج.

في حين أن تصوير الكالسيوم في الجسم الحي الموصوف هنا أصبح الطريقة القياسية لدراسة الاستجابات المستحثة عن الذوق ذات الترتيب^{الأعلى 8،18،19،20،28} ، إلا أن هناك حاليا العديد من الأساليب الأخرى لقياس استجابات GRN الأولية للمذاق في الذباب. يسجل نهج تصوير الكالسيوم الموصوف هنا تغيرات GCaMP في أطراف المحور العصبي في الدماغ ، ولكن تم أيضا استخدام نهج خارج الجسم الحي لتحديد جسم الخلية GCaMP في الملصق^{GRNs 33}. وبالمثل ، تم وصف نهج تركيب آخر لتصوير أجسام الخلايا إما من GRNs أو الرصغي في الذباب السليم⁵¹. لا تزال الفيزيولوجيا الكهربية تقنية شائعة وفعالة لدراسة استجابات الخلايا العصبية للتذوق الأولية في الحشرات^{13،16،32،52،53،54،55،56،57،58،59،60،64،6263،64،65}. هذا لا يتطلب الحاجة إلى مستشعرات الكالسيوم المشفرة وراثيا وهو قياس كمي مباشر أكثر للنشاط العصبي. ومع ذلك ، يمكن تسجيل الاستجابات من حسية واحدة فقط في كل مرة بينما يمكن تسجيل تصوير الكالسيوم من مجموعة كاملة من GRNs في وقت واحد. تم استخدام نهج تصوير الكالسيوم لاكتشاف الديناميكيات الزمنية الفريدة للاستجابات "التشغيل" و "الإيقافية" في GRNs مع محفزات معينة^27،28 ، ولكن التقدم الأخير في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية من قاعدة حسية التذوق في D. melanogaster يسمح الآن بقياس الاستجابات "المتوقفة" على مستوى إمكانات الفعل⁵³. ومن المثير للاهتمام ، أن تعديل حساسية GRN الأولية عن طريق الجوع تم اكتشافه عن طريق تصوير الكالسيوم ولكن ليس على مستوى إمكانات العمل مع الفيزيولوجيا الكهربية²⁹ ، ومع ذلك يمكن لكل من تسجيلات الأطراف الفيزيولوجية الكهربية وتصوير الكالسيوم التقاط تغيير في حساسية GRN مع النظام الغذائي^30،66. وبالتالي ، يظل الفيزيولوجيا الكهربية نهجا مهما وتكميليا لتصوير الكالسيوم لتحديد روابط التذوق والمستقبلات ولفهم كيفية تعديل العوامل المختلفة لحساسية الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية الأولية.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح ولا شيء للإفصاح عنه.

نود أن نشكر مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة للأسهم ومختبرات صندوق النقد الدولي بجامعة فيرمونت على مساعدتهم في تصنيع غرف التصوير المخصصة. نود أيضا أن نتوجه بتقدير BioRender لإنشاء الرسوم التوضيحية الرسومية و Kayla Audette للمساهمة في تصميم هذه الرسومات. تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء تشغيل المختبرات الجديدة من جامعة فيرمونت وجائزة المؤسسة الوطنية للعلوم رقم 2332375. تم إنشاء الرسومات في الشكل 1 باستخدام www.BioRender.com.