Monitoramento da progressão do nódulo pulmonar usando microtomografia computadorizada e amostragem de sangue em um modelo de camundongo

Este protocolo descreve um método eficiente, simples e minimamente invasivo para o estudo de nódulos pulmonares. A coleta de sangue da veia submaxilar e a microtomografia computadorizada são usadas como técnicas de investigação.

A microtomografia computadorizada (microtomografia computadorizada) é uma técnica em tempo real, intuitiva, sensível e minimamente invasiva para monitorar alterações de nódulos pulmonares (NP) para câncer de pulmão (CP). A integração da amostragem de sangue da veia submandibular permite a detecção rápida, estável e direta de imagens e alterações do alvo principal durante a progressão da NP para LC. Neste estudo, administramos uma dose de 100 mg/kg de 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona em camundongos A/J para desenvolver um modelo de adenocarcinoma de pulmão. A progressão da doença nos animais experimentais foi então monitorada por meio de coleta de sangue da veia submandibular e ensaio de micro-CT. Os resultados experimentais mostraram a presença de focos nodulares nos pulmões de alguns animais na^10ª semana, com o desenvolvimento de imagens de adenocarcinoma de pulmão tornando-se evidente na^21ª semana. Em conclusão, a micro-CT pode efetivamente observar alterações patológicas nos pulmões de camundongos e, quando combinada com a amostragem de sangue da veia submandibular, pode monitorar dinamicamente as alterações no sangue, proteínas e alvos. Este método fornece uma abordagem altamente específica, simples e sensível para triagem de drogas, testes farmacocinéticos, experimentos toxicológicos e estudos de segurança.

O câncer de pulmão (CP) é uma neoplasia grave originada na mucosa brônquica ou nas glândulas pulmonares. De acordo com estatísticas de 2021, a CL causa aproximadamente dois milhões de mortes em todo o mundo a cada ano, com taxas de incidência e mortalidade em ascensão¹. O diagnóstico e a intervenção precoces na CP contribuem para maiores taxas de cura, redução da mortalidade e menores custos de tratamento. Os nódulos pulmonares (NP) são precursores específicos da CL, caracterizados por sombras sólidas ou subsólidas localizadas, arredondadas e mais densas ≤30 mm de diâmetro nos exames radiológicos, sem evidência de colapso pulmonar, linfonodomegalia mediastinal ou derrame pleural². A National Comprehensive Cancer Network (NCCN) em 2022 categorizou a NP por número, diâmetro e densidade, identificando combinações como um nódulo em vidro fosco isolado de 5 mm no pulmão direito³. No entanto, as diretrizes da NCCN indicam que o risco de malignidade na NP aumenta com o diâmetro e a quantidade dos nódulos. A aplicação generalizada da tomografia computadorizada de baixa dose aumentou drasticamente os diagnósticos de NP, com milhões de novos casos identificados a cada ano⁴.

A combinação de camundongos A/J com 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) é o modelo animal mais comumente usado para câncer de pulmão (CL)^5,6. O uso de micro-CT juntamente com a amostragem de sangue da veia submandibular é uma abordagem eficaz para o monitoramento em tempo real das alterações de nódulos pulmonares (NP) para CP. A indução química de carcinógenos, particularmente em camundongos NNK e A/J, é o método mais prevalente para modelagem de câncer de pulmão e provou ser uma abordagem eficaz para o estabelecimento de carcinoma in situ ^7,8. Este método de modelagem simula com mais precisão a progressão de NP para LC em comparação com o método de inoculação axilar.

Estudos anteriores se concentraram na análise estatística da morfologia do nódulo e na coloração patológica de amostras de tecido pós-eutanásia⁹. No entanto, esses métodos carecem da capacidade de monitoramento em tempo real da progressão dinâmica do NP para o LC¹⁰. A micro-TC, como técnica de imagem não invasiva, fornece dados longitudinais precisos com alta resolução, imagem rápida, baixa dose de radiação e segurança, tornando-a adequada para detectar imagens pulmonares em tempo real^11,12. A amostragem de sangue da veia submandibular é o método mais recente, simples e rápido para obter amostras de sangue de camundongos¹³. Essa técnica não invasiva requer manuseio mínimo de animais e permite uma recuperação rápida, alinhando-se aos princípios 3R que visam reduzir o número de animais usados em pesquisas, minimizar o desconforto e promover o tratamento ético. O volume sanguíneo coletado, aproximadamente 0,2-0,5 mL, é suficiente para monitorar os parâmetros sanguíneos com necessidades moderadas¹⁴.

O uso concomitante de micro-TC e amostragem de sangue da veia submandibular permite a observação dinâmica e em tempo real da progressão de NP para LC em imagens e a detecção em tempo real de alvos-chave na corrente sanguínea¹⁵. Além disso, essa abordagem permite a investigação em tempo real de metabólitos e outros bioquímicos, que, quando combinados com técnicas como cromatografia de alta eficiência, avançam nossa compreensão da CL^16,17.

Neste estudo, camundongos A/J combinados com NNK foram usados para criar um modelo de camundongo com câncer de pulmão in situ. Microtomografias computadorizadas foram realizadas em 4, 10 e 20 semanas após a indução do modelo para capturar imagens pulmonares, enquanto o sangue foi coletado por meio de amostragem de veias submandibulares durante todo o experimento. Este estudo tem como objetivo estabelecer uma base para a pesquisa de NP e LC, combinando amostragem de sangue da veia submandibular com micro-CT.

Em oncologia, a micro-TC é uma ferramenta altamente eficaz para detectar o crescimento tumoral, oferecendo uma técnica de alta resolução para medir as mudanças locais de foco de sombra a qualquer momento durante esses estudos^18,19. No entanto, é essencial reconhecer que a micro-CT sozinha não fornece informações sobre as características do foco de sombra, o estado fisiológico do animal ou os níveis dos principais fatores biológicos. Portanto, a amostragem da veia submandibular foi utilizada como método complementar neste estudo.

Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu e foram conduzidos de acordo com as leis e padrões éticos relevantes para pesquisa com animais (número da revisão: 2024035). Camundongos fêmeas endogâmicos A/JGpt (7-8 semanas de idade) foram mantidos a uma temperatura de 20-24 °C com umidade relativa de 40%-70%. Eles receberam ração animal padrão e água purificada ad libitum durante um ciclo claro-escuro de 12 horas. Antes do experimento, cada animal foi aclimatado a esse ambiente por 7 dias. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Reagentes e preparação animal

1. Produtos químicos e reagentes
   1. Dissolva o NNK em solução salina para formar uma mistura master de 10 mg / mL²⁰. Administre uma única injeção intraperitoneal de 0,2 mL com uma concentração de 100 mg / kg ao grupo NNK, fornecendo um volume igual de solução salina normal ao grupo em branco.
      NOTA: Siga Jang et ^al.21 para determinar o momento da microtomografia computadorizada e da coleta de sangue.
2. Coleta de sangue
   NOTA: Para garantir a saúde dos camundongos, limite a coleta de sangue a não mais que 0,2 mL de cada vez e aguarde uma semana para a recuperação. Devido à abundância de cabelos na região submentoniana, tome cuidado para evitar a contaminação da amostra de sangue pelos cabelos durante a coleta.
   1. Remova os pelos faciais do animal no dia anterior ao experimento usando um barbeador apropriado.
   2. Segure a pele na parte posterior da cabeça do mouse firmemente com a mão esquerda para evitar qualquer movimento e manter a cabeça do mouse em uma posição fixa.
   3. Insira a agulha de coleta de sangue rapidamente na artéria submaxilar a partir da área mandibular atrás da órbita ocular oblíqua. Mantenha a agulha no lugar por pelo menos 3 s para permitir o fluxo sanguíneo ideal. Colete 50-200 μL de sangue.
   4. Colete o sangue em um tubo de EDTA. Use um cotonete para aplicar uma leve pressão na pele para parar o sangramento. Assim que o sangramento parar, solte o mouse e observe-o por 30 s.
   5. Agite suavemente o tubo de ensaio para garantir que o sangue esteja completamente misturado com o coagulante.
   6. Para exames de sangue de rotina, coloque o sangue coletado no instrumento de teste de rotina de sangue veterinário, pressione o botão de coleta e permita que o instrumento colete o sangue. Registre os resultados exibidos. Descarte qualquer sangue restante com segurança.

2. Imagem in vivo por micro-CT

NOTA: Sempre remova objetos de metal, como brincos, do animal de teste antes de usar a microtomografia computadorizada. Objetos de metal podem causar artefatos graves na imagem. Micro-CT emite uma certa quantidade de radiação; garantir que outros resultados experimentais não sejam afetados.

1. Inicie a unidade, inicie o software micro-CT e execute a calibração e o aquecimento da sonda. Use a base de ferramentas específica do mouse para digitalizar.
2. Crie um novo banco de dados e nomeie-o para essa verificação ou conecte-o a um banco de dados existente.
3. Modifique os parâmetros na janela de configuração do software. Defina o filtro de raios X para Cu0,06 + Al0,5, com uma tensão de 70 kV, uma corrente de 80 μA, um campo de visão de 36 mm × 36 mm, varredura rotacional de 360° e um tempo de varredura de 4 min²².
4. Anestesie os camundongos com isoflurano a 3% antes de escanear²³ (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Abra o micro-CT viewtela e prenda os mouses na base de ferramentas com fita adesiva. Mantenha a anestesia continuamente usando uma sonda nasogástrica colocada dentro do instrumento de micro-CT na base de ferramentas.
5. Guie cuidadosamente o animal para dentro do aparelho e monitore sua posição em tempo real. Use os botões apropriados para ajustar a posição do mouse, garantindo que seu peito esteja totalmente visível dentro do campo de visão.
6. Gire a base de ferramentas 90° para posicionar o mouse. Use os botões para ajustar a posição do mouse, garantindo que a região pulmonar esteja localizada centralmente dentro do campo de visão. Em seguida, retorne a base da ferramenta à sua posição original.
7. Para iniciar a verificação, selecione o botão Digitalizar . Permita que o sistema conclua a verificação sem interrupção e evite abrir a tela de visualização durante o processo. Observe os cortes transaxial, coronal e sagital da reconstrução através do software.
8. Avalie a qualidade da imagem imediatamente após a digitalização. Se aparecerem artefactos ou imagens desfocadas, repita o procedimento de digitalização.
9. Remova os ratos do aparelho e monitore sua saúde para garantir que estejam em condições estáveis antes de devolvê-los às gaiolas.
10. No final do experimento, remova a fita adesiva da base da ferramenta e limpe a cama. Salve os dados e desligue o instrumento.
11. Transfira os ratos de volta para suas gaiolas suavemente para minimizar o estresse. Certifique-se de que as gaiolas estejam limpas e tenham roupas de cama adequadas.
12. Monitore os camundongos quanto a sinais de recuperação da anestesia. Observe seu comportamento, mobilidade e apetite. Forneça comida e água conforme necessário.
13. Mantenha um ambiente quente para os camundongos para evitar hipotermia após a anestesia. Use almofadas de aquecimento ou cobertores, se necessário.
14. Realize verificações diárias de saúde para a próxima semana. Procure sinais de angústia, comportamento incomum ou quaisquer lesões. Documente as observações de cada rato.
15. Se algum rato mostrar sinais de doença ou angústia, consulte um veterinário para intervenção e cuidados adequados.
16. Certifique-se de que os ratos retornem às suas condições normais de alojamento depois de estarem totalmente recuperados e estáveis.

3. Tratamento e análise de dados

1. Use estatísticas e software gráfico como uma ferramenta valiosa para análise de dados e criação de tabelas para apresentar resultados.
2. Abra o software. Selecione gráficos XY na tabela de dados recém-criada, insira os dados semanais para os grupos NNK e controle e gere um gráfico exibindo as mudanças no peso dos camundongos.
3. Abra o software novamente, selecione o diagrama de contingência na tabela de dados recém-criada, insira os dados de rotina de sangue para o grupo NNK e o grupo de controle e gere um ícone.
4. Selecione as opções de análise no software. Analise os dados gerais usando ANOVA unidirecional, seguida de verificação dos dados por meio da implementação de um teste t. Marque diferenças significativas.
5. Salve os dados micro-CT no formato SimpleViewer ou DICOM. Abra o software SimpleViewer e observe os dados de imagem sob a orientação de um médico de imagem profissional. Rotule os nódulos e quantifique o volume da sombra usando as ferramentas de medição fornecidas.

Este estudo demonstrou a construção de um modelo estável de câncer de pulmão usando NNK em combinação com camundongos A/J. O desenho experimental é ilustrado na Figura 1. O objetivo foi observar o processo em tempo real da transição de nódulos pulmonares (NP) para câncer de pulmão (LC) em pulmões de camundongos, utilizando micro-TC e amostragem de sangue de veias submandibulares. Assim, a microtomografia computadorizada e a coleta de sangue dos pulmões do camundongo foram realizadas na quarta, décima e vigésima semanas.

Os resultados experimentais mostraram que a abordagem de modelagem de NNK em conjunto com camundongos A/J imitou efetivamente o processo patológico de PN para LC. Em primeiro lugar, pode-se afirmar que o ensaio utilizado neste estudo não impactou significativamente o bem-estar dos animais experimentais. Conforme ilustrado na Figura 2, os pesos corporais dos animais experimentais durante o período de alimentação de 20 semanas não exibiram diferenças notáveis em comparação com o grupo controle. Em segundo lugar, os resultados dos exames de sangue de rotina realizados em amostras retiradas dos animais experimentais revelaram um aumento significativo no número de leucócitos e plaquetas no grupo modelo, enquanto o número de hemácias e hemoglobina permaneceu inalterado (Figura 3). Isso indica que o processo de transformação de NP em LC também está associado a um aumento gradual da inflamação crônica. É importante ressaltar que tanto a microtomografia computadorizada quanto a amostragem de sangue da veia submandibular não danificaram a função hematopoiética dos animais experimentais, consistente com os achados de vários estudos anteriores. Além disso, a observação cuidadosa do comportamento, condição da pelagem, respiração, dieta e ingestão de água dos animais experimentais ao longo do estudo não revelou anormalidades.

Após a administração inicial de NNK aos animais experimentais, realizamos microtomografia computadorizada dos pulmões no primeiro dia da quarta, décima e vigésima semanas²⁴. Os resultados indicaram que, em comparação com o grupo controle, a textura pulmonar do grupo modelo exibiu um espessamento gradual. Na^10ª semana, a formação de focos nodulares minúsculos foi observável e, na^20ª semana, os nódulos se desenvolveram em focos de sombra discerníveis. À luz desses achados, pode-se postular que a formação de focos de sombra nos pulmões está associada à inflamação crônica induzida por NNK²⁵. No entanto, como este estudo foi desenhado para observar o desenvolvimento seguro, eficiente e inofensivo de NP para CP sem envolver estudos patológicos em animais, estudos subsequentes devem ser conduzidos de acordo com protocolos experimentais específicos²⁶. A Figura 4 ilustra as alterações na imagem pulmonar observadas em animais experimentais nas semanas 4, 10 e 20.

Figura 1: Desenho experimental para tratamento com NNK em camundongos A/J. Cinco camundongos A/J fêmeas foram injetados com o composto NNK em um único momento, enquanto outros cinco foram injetados com solução salina como controle. Amostras de sangue foram coletadas nas semanas 4, 10 e 20 usando microtomografias computadorizadas dos pulmões de camundongos e coleta de sangue da veia submaxilar. Os dados obtidos foram validados para avaliar a progressão da doença nos camundongos. (A) Visão geral do projeto experimental. (B) Diagrama da amostragem de sangue da artéria submaxilar. (C) Representação esquemática da configuração da imagem de micro-CT, mostrando o camundongo posicionado na cama do animal (azul) e a moldura amarela como visor, que deve cobrir completamente o tecido pulmonar do camundongo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mudanças de peso em camundongos ao longo de 20 semanas. As tendências de peso indicaram que o tratamento com NNK em camundongos A / J não reduziu significativamente o peso corporal. A microtomografia computadorizada e a extração de sangue da veia submaxilar podem causar algum estresse aos camundongos; no entanto, eles se recuperaram rapidamente. Os dados são expressos como média ± EPM, (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Contagem de células sanguíneas ao longo do tempo. O conteúdo de glóbulos brancos, plaquetas, glóbulos vermelhos e hemoglobina foi medido em camundongos nas semanas 4, 10 e 20. Em comparação com o grupo controle, o grupo NNK mostrou uma tendência crescente no número de glóbulos brancos e plaquetas, enquanto os níveis de hemoglobina e glóbulos vermelhos não mudaram significativamente. Esses achados sugerem que o processo de transformação do NP-LC está associado ao aumento da inflamação e que o método de coleta de sangue da veia submaxilar, realizado em intervalos superiores a 4 semanas, não causa infecção ou prejuízo à função hematopoiética em camundongos. (A) Glóbulos brancos. (B) Plaquetas. (C) Glóbulos vermelhos. (D) Hemoglobina. Os dados são expressos como média ± EPM, (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens de micro-tomografia computadorizada de camundongos nas semanas 4, 10 e 20. Os resultados da imagem de micro-CT demonstram que o tratamento com NNK em camundongos A/J simula efetivamente o processo de transformação de PN-LC. Em comparação com o grupo controle, o grupo NNK começou a apresentar características de espessamento e textura alterada nas imagens pulmonares na semana 10. Na semana 20, focos de sombra robustos eram discerníveis dentro do tecido pulmonar. (A) Imagens da semana 4. (B) Imagens da semana 10. (C) Imagens da semana 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

É importante reiterar vários pontos-chave deste estudo. Em primeiro lugar, embora a coleta de sangue da veia submandibular seja um procedimento de lesão relativamente baixa, ela ainda pode resultar em algum grau de dano aos animais. Portanto, é necessário realizar vários procedimentos para reduzir a carga sobre os camundongos e concluir o processo em tempo hábil²⁷. Em segundo lugar, a remoção do cabelo antes da coleta da amostra de sangue garante a pureza da amostra. Em terceiro lugar, é imperativo usar vasos de coleta de sangue apropriados. No presente estudo, vasos de coleta de sangue contendo EDTA foram empregados para exames de sangue de rotina. Se o soro fosse utilizado, seriam necessários vasos especificamente projetados para a coleta de sangue puro²⁸. Quarto, todos os anestésicos têm um certo nível de letalidade; assim, minimizar o tempo de anestesia e imagem pode efetivamente proteger a saúde dos camundongos. Quinto, uma vez que a micro-CT pode observar uma variedade de tecidos e órgãos, as configurações de parâmetros específicos no software de micro-CT usado durante a imagem de NP podem ser referenciadas neste estudo, mas podem não ser aplicáveis a outros tecidos^29,30.

Estudos anteriores estavam mais inclinados a sacrificar animais em momentos fixos e examinar o processo de transformação do nódulo pulmonar por meio de coloração patológica³¹. Essa abordagem resultou em um número considerável de mortes entre os animais experimentais e dificultou o rastreamento em tempo real das alterações pulmonares. Em comparação com as técnicas convencionais, a amostragem de sangue submandibular e a micro-TC oferecem várias vantagens, incluindo danos mínimos, monitoramento em tempo real, operação intuitiva e versatilidade. Neste estudo, a coleta de sangue submandibular foi escolhida como o método preferido para obtenção de amostras de sangue para exames de rotina³². Além disso, o sangue pode ser usado para análises proteômicas, farmacológicas séricas e bioquímicas do sangue.

Da mesma forma, o micro-CT foi empregado neste estudo para observar o crescimento dinâmico de NP em camundongos experimentais sem a necessidade de eutanásia. Essa abordagem facilita uma avaliação mais intuitiva e precisa do efeito inibitório da droga sobre a NP, reduzindo significativamente o número de animais necessários para o experimento, aumentando assim a precisão dos resultados experimentais. Notavelmente, a combinação dessas duas tecnologias permite o rastreamento abrangente dos processos de formação, desenvolvimento e carcinogênese de nódulos em animais experimentais, bem como a localização de alterações em alvos-chave (como o TNF-α)³³. Isso apresenta um conceito único para esta pesquisa sobre NP e até mesmo câncer de pulmão.

No entanto, várias questões requerem uma consideração mais aprofundada para melhorar a qualidade de pesquisas futuras. Dado o longo período experimental necessário para o modelo animal de NNK combinado com camundongos A/J, é imperativo que as primeiras injeções de drogas sejam conduzidas com a máxima precisão³⁴. Em segundo lugar, o método padrão para a produção de adenocarcinoma de pulmão em camundongos envolve NNK em coordenação com camundongos fêmeas A / J, com o mecanismo subjacente ligado ao estradiol. Portanto, é essencial considerar os mecanismos específicos de ação das drogas terapêuticas envolvidas³⁵. Além disso, a micro-CT não foi usada para determinar a natureza dos focos de sombra, necessitando do uso de coloração de hematoxilina e coloração de fluorescência, que ainda requerem a eutanásia dos camundongos para obter amostras de tecido pulmonar. Finalmente, embora a micro-CT tenha a vantagem de baixa exposição à radiação, ela ainda pode causar certos danos ao corpo humano, exigindo evitar a proximidade de pessoal não relacionado³⁶. Para resolver esses problemas, a diferenciação e a rotulagem de vários tecidos, vias aéreas e vasos sanguíneos podem ser alcançadas de forma eficaz por meio da injeção de um agente de contraste na veia da cauda. Além disso, micro-CT combinado com novos medicamentos materiais (por exemplo, nanopartículas) pode ser empregado para um tratamento mais preciso. Finalmente, a tecnologia de micro-TC foi gradualmente integrada à patologia, como histologia espacial e de imagem, para rastrear de forma mais dinâmica as alterações nos nódulos pulmonares^36,37.

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecemos ao Professor Cong Huang, da Escola de Ciências Médicas Básicas, e ao Professor Yan Huang, da Escola de Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, por seu apoio. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Binjie Xu e ao Dr. Pengmei Guo. (Instituto Inovador de Medicina e Farmácia Chinesa, Chengdu
Universidade de Medicina Tradicional Chinesa) por fornecer instrumentos e suporte técnico.