在小鼠模型中使用显微计算机断层扫描和血液采样监测肺结节进展

该协议描述了一种用于研究肺结节的高效、简单和微创方法。颌下静脉采血和 micro-CT 成像用作调查技术。

显微计算机断层扫描 （micro-CT） 是一种实时、直观、灵敏和微创的技术，用于监测从肺结节 （PN） 到肺癌 （LC） 的变化。下颌下静脉采血的整合能够在 PN 到 LC 的进展过程中快速、稳定和直接地检测成像和关键靶标改变。在这项研究中，我们在 A/J 小鼠中施用 100 mg/kg 剂量的 4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮，以开发肺腺癌模型。然后通过下颌下静脉采血和 micro-CT 测定监测实验动物的疾病进展。实验结果显示，到^第 10 周，一些动物的肺部存在结节病灶，到^第 21 周，肺腺癌图像的发展变得明显。综上所述，micro-CT 可以有效观察小鼠肺部的病理变化，结合下颌下静脉采血，可以动态监测血液、蛋白质和靶点的变化。该方法为药物筛选、药代动力学测试、毒理学实验和安全性研究提供了一种高度特异性、简单且灵敏的方法。

肺癌 （LC） 是一种起源于支气管粘膜或肺腺的严重肿瘤。根据 2021 年的统计数据，LC 每年导致全球约 200 万人死亡，发病率和死亡率呈上升^{趋势 1}。LC 的早期诊断和干预有助于提高治愈率、降低死亡率和降低治疗成本。肺结节 （PN） 是 LC 的特异性前体，其特征是放射学检查显示直径为 30 mm 的局部、圆形和更致密的实性或亚实性阴影 ≤，无肺塌陷、纵隔淋巴结肿大或胸腔积液的证据²。美国国家综合癌症网络 （NCCN） 在 2022 年按数量、直径和密度对 PN 进行分类，确定了诸如右肺 5 mm 孤立性磨玻璃结节等组合³。然而，NCCN 指南表明，PN 恶性肿瘤的风险随着结节直径和数量的增加而增加。低剂量计算机断层扫描的广泛应用大大增加了 PN 诊断，每年发现数百万新病例⁴。

A/J 小鼠与 4-（甲基亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮 （NNK） 的组合是肺癌 （LC） 最常用的动物模型^5,6。使用 micro-CT 和下颌下静脉采血是实时监测从肺结节 （PN） 到 LC 的变化的有效方法。化学致癌物诱导，尤其是 NNK 和 A/J 小鼠，是肺癌建模最普遍的方法，已被证明是建立原位癌的有效方法 ^7,8。与腋窝接种方法相比，这种建模方法更准确地模拟了 PN 到 LC 的进展。

以前的研究集中在安乐死后组织样本的结节形态统计分析和病理染色⁹。然而，这些方法缺乏实时监测从 PN 到 LC¹⁰ 的动态进展的能力。显微 CT 作为一种无创成像技术，可提供准确的纵向数据，具有高分辨率、快速成像、低辐射剂量和安全性，使其适用于实时检测肺部图像^11,12。下颌下静脉采血是获取小鼠血液样本的最新、最简单、最快的方法¹³。这种非侵入性技术需要最少的动物处理并允许快速恢复，符合 3R 原则，旨在减少研究中使用的动物数量，最大限度地减少不适并促进道德治疗。采集的血容量约为 0.2-0.5 mL，足以监测中等需求的血液参数¹⁴。

同时使用显微 CT 和下颌下静脉血液采样，可以动态、实时地观察成像中的 PN 到 LC 进展，并实时检测血流中的关键靶标¹⁵。此外，这种方法能够实时研究代谢物和其他生化物质，当与高效色谱等技术相结合时，可以促进我们对 LC^{的理解 16,17}。

在本研究中，使用 A/J 小鼠联合 NNK 创建原位肺癌小鼠模型。在模型诱导后 4 、 10 和 20 周进行 Micro-CT 扫描以捕获肺部图像，同时在整个实验过程中 通过 下颌下静脉取样采集血液。本研究旨在通过将下颌下静脉采血与显微 CT 相结合，为 PN 和 LC 研究奠定基础。

在肿瘤学中，显微 CT 是检测肿瘤生长的高效工具，提供了一种高分辨率技术，可在此类研究期间随时测量局部阴影焦点变化^18,19。然而，必须认识到，单独的显微 CT 并不能提供有关阴影焦点特征、动物生理状态或关键生物因素水平的信息。因此，本研究采用下颌下静脉取样作为补充方法。

本研究中描述的所有动物实验均经成都中医药大学实验动物福利伦理委员会批准，并按照动物研究相关法律和伦理标准进行（综述编号：2024035）。雌性近交 A/JGpt 小鼠 （7-8 周龄） 维持在 20-24 °C 的温度和 40%-70% 的相对湿度下。在整个 12 小时的明暗循环中 ， 它们随意提供标准动物饲料和纯净水。实验前，每只动物都适应了这种环境 7 天。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 试剂和动物制备

1. 化学品和试剂
   1. 将 NNK 溶解在盐水中，形成 10 mg/mL 预混液²⁰.对 NNK 组进行浓度为 100 mg/kg 的 0.2 mL 单次腹膜内注射，同时向空白组提供等体积的生理盐水。
      注意：按照 Jang 等人 ²¹ 确定显微 CT 扫描和采血的时间。
2. 采血
   注意：为确保小鼠的健康，每次将采血限制在不超过 0.2 mL，并等待一周的恢复时间。由于颏下区有大量的毛发，在采集过程中要注意避免血液样本被毛发污染。
   1. 在实验前一天使用合适的剃须刀去除动物的面部毛发。
   2. 用左手牢牢抓住鼠标头部后部的皮肤，以防止任何移动并将鼠标的头部保持在固定位置。
   3. 将采血针从斜眼窝后面的下颌区域迅速插入颌下动脉。将针头保持在原位至少 3 秒，以允许最佳血液流动。收集 50-200 μL 血液。
   4. 将血液收集到 EDTA 管中。使用棉签轻轻按压皮肤以止血。出血停止后，松开鼠标并观察 30 秒。
   5. 轻轻搅动试管，确保血液与凝血剂充分混合。
   6. 对于常规血液检测，将采集的血液放入兽用血液常规检测仪中，按下采集按钮，让仪器采集血液。记录显示的结果。安全地处理任何剩余的血液。

2. 显微 CT 活体 成像

注意： 在使用显微 CT 扫描之前，请务必从测试动物身上取下金属物体，例如耳标。金属对象可能会导致图像中出现严重的伪影。显微 CT 发出一定量的辐射;确保其他实验结果不受影响。

1. 启动设备，启动 micro-CT 软件，然后进行探头校准和预热。使用鼠标专用工具床进行扫描。
2. 创建一个新数据库并为此扫描命名，或将其连接到现有数据库。
3. 在软件设置窗口中修改参数。将 X 射线滤光片 设置为 Cu0.06 + Al0.5， 电压 为 70 kV， 电流 为 80 μA，视 场 为 36 mm × 36 mm，360 ° 旋转扫描， 扫描时间为 4 min²²。
4. 在扫描²³ 之前，用 3% 异氟醚麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。打开 micro-CT 观察屏幕，并用胶带将鼠标固定在工具床上。使用放置在工具床上显微 CT 仪器内的鼻胃管持续保持麻醉。
5. 小心地将动物引导到设备中并实时监测其位置。使用适当的按钮调整鼠标的位置，确保其胸部在视野内完全可见。
6. 将工具床旋转 90° 以定位鼠标。使用按钮调整鼠标的位置，确保肺部区域位于视野的中心。然后，将工具床放回其原始位置。
7. 要启动扫描，请选择 Scan （ 扫描 ） 按钮。让系统不间断地完成扫描，并在此过程中避免打开查看屏幕。通过软件观察重建的经轴、冠状和矢状切片。
8. 扫描后立即评估图像质量。如果出现伪影或模糊图像，请重复扫描过程。
9. 将老鼠从设备中取出并监测它们的健康状况，以确保它们处于稳定的状态，然后再将它们放回笼子。
10. 实验结束时，从工具床上取下胶带，然后清洁床。保存数据并关闭仪器。
11. 轻轻地将小鼠转移回笼子中，以尽量减少压力。确保笼子干净并有合适的垫料。
12. 监测小鼠是否有麻醉恢复的迹象。观察它们的行为、活动能力和食欲。根据需要提供食物和水。
13. 为小鼠保持温暖的环境，以防止麻醉后体温过低。如有必要，使用加热垫或毯子。
14. 执行下周的每日运行状况检查。寻找痛苦、异常行为或任何受伤的迹象。记录每只鼠标的观察结果。
15. 如果任何老鼠出现生病或痛苦的迹象，请咨询兽医以获得适当的干预和护理。
16. 确保小鼠在完全恢复并稳定后恢复到正常的住房状态。

3. 数据处理和分析

1. 使用统计和绘图软件作为数据分析和创建表格以呈现结果的宝贵工具。
2. 打开软件。从新创建的数据表中选择 XY 图 ，输入 NNK 和对照组的每周数据，并生成一个图表，显示小鼠体重的变化。
3. 再次打开软件，从新创建的数据表中选择 列联图 ，输入 NNK 组和对照组的血常规数据，并生成一个图标。
4. 在 软件 中选择 分析 选项。使用单因子方差分析分析总体数据，然后通过实施 t 检验来验证数据。标记显著差异。
5. 将显微 CT 数据保存为 SimpleViewer 格式或 DICOM。打开 SimpleViewer 软件，在专业影像医师的指导下观察影像数据。使用提供的测量工具标记结节并量化阴影体积。

本研究证明了使用 NNK 联合 A/J 小鼠构建稳定的肺癌模型。实验设计如图 1 所示。目的是利用显微 CT 和下颌下静脉采血观察小鼠肺从肺结节 （PN） 向肺癌 （LC） 转变的实时过程。因此，在第 4 周、第 10 周和第 20 周进行小鼠肺部显微 CT 扫描和血液采样。

实验结果表明，NNK 联合 A/J 小鼠的建模方法有效模拟了从 PN 到 LC 的病理过程。首先，可以说本研究中使用的检测方法并没有显着影响实验动物的健康状况。如图 2 所示，与对照组相比，实验动物在 20 周饲喂期间的体重没有表现出显着差异。其次，对实验动物样本进行的常规血液测试结果显示，模型组的白细胞和血小板数量显着增加，而红细胞和血红蛋白的数量保持不变（图 3）。这表明从 PN 到 LC 的转化过程也与慢性炎症的逐渐增加有关。重要的是，显微 CT 扫描和下颌下静脉采血均未损害实验动物的造血功能，这与先前许多研究的结果一致。此外，在整个研究过程中密切观察实验动物的行为、皮毛状况、呼吸、饮食和饮水量，发现没有异常。

在对实验动物进行 NNK 初次给药后，我们在第 4 周、第 10 周和第 20 周的第一天对肺部进行了显微 CT 扫描²⁴。结果表明，与对照组相比，模型组的肺纹理逐渐增厚。到^第 10 周，可观察到微小结节病灶的形成，到^第 20 周，结节已发展为可辨别的影子病灶。鉴于这些发现，可以假设肺部阴影病灶的形成与 NNK²⁵ 诱导的慢性炎症有关。然而，由于本研究旨在观察 PN 向 LC 的安全、高效和无害的发展，而不涉及动物的病理研究，因此后续研究必须按照特定的实验方案进行²⁶。 图 4 说明了在第 4 周、第 10 周和第 20 周时在实验动物中观察到的肺部成像变化。

图 1：A/J 小鼠 NNK 治疗的实验设计。 5 只雌性 A/J 小鼠在单个时间点注射化合物 NNK，而另外 5 只雌性 A/J 小鼠注射生理盐水作为对照。在第 4 周、第 10 周和第 20 周使用小鼠肺部的显微 CT 扫描和颌下静脉采血收集血样。对获得的数据进行交叉验证以评估小鼠的疾病进展。（A） 实验设计概述。（B） 颌下动脉采血示意图。（C） 显微 CT 成像装置的示意图，显示小鼠位于动物床上（蓝色），黄色框架作为取景器，应完全覆盖小鼠的肺组织。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：小鼠体重在 20 周内的变化。 体重趋势表明，A/J 小鼠的 NNK 治疗没有显着降低体重。显微 CT 扫描和颌下静脉采血可能会给小鼠带来一些压力;然而，他们很快就恢复了过来。数据表示为 SEM ±平均值 （n = 5）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：随时间变化的血细胞计数。 在第 4 周、第 10 周和第 20 周测量小鼠白细胞、血小板、红细胞和血红蛋白的含量。与对照组相比，NNK 组白细胞和血小板数量呈增加趋势，而血红蛋白和红细胞水平无显著变化。这些发现表明，PN-LC 的转化过程与炎症增加有关，并且间隔 4 周以上的颌下静脉采血方法不会引起感染或小鼠造血功能损害。（A） 白细胞。（B） 血小板。（C） 红细胞。（D） 血红蛋白。数据表示为 SEM ±平均值 （n = 5）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：小鼠在第 4 周、第 10 周和第 20 周的显微 CT 扫描图像。 显微 CT 成像结果表明，A/J 小鼠的 NNK 处理有效模拟了 PN-LC 的转化过程。与对照组相比，NNK 组在第 10 周开始表现出肺部图像增厚和纹理改变的特征。第 20 周时，肺组织内可辨别出强壮的阴影病灶。（A） 第 4 周的图片。（B） 第 10 周的图片。（C） 第 20 周的图片。 请单击此处查看此图的较大版本。

重申本研究中的几个关键点很重要。首先，虽然下颌下静脉采血是一种损伤相对较低的手术，但它仍然可能对动物造成一定程度的伤害。因此，有必要进行多种程序以减轻小鼠的负担并及时完成该过程²⁷。其次，在采集血液样本之前去除毛发可确保样本的纯度。第三，必须使用合适的采血管。在本研究中，含有 EDTA 的采血管用于常规血液检查。如果要使用血清，则需要专门为收集纯血而设计的血管²⁸.第四，所有麻醉剂都有一定的致死率;因此，最大限度地减少麻醉和成像时间可以有效保护小鼠的健康。第五，由于显微 CT 可以观察多种组织和器官，因此 PN 成像过程中使用的显微 CT 软件中的具体参数设置可以参考本研究，但可能不适用于其他组织^29,30。

以前的研究更倾向于在固定时间点对动物实施安乐死，并通过病理染色检查肺结节转化的过程³¹。这种方法导致实验动物中相当多的死亡，并阻碍了对肺部变化的实时跟踪。与传统技术相比，下颌下血采样和显微 CT 具有多种优势，包括损伤最小、实时监测、直观作和多功能性。在这项研究中，下颌下血采集被选为获取血样进行常规检查的首选方法³²。此外，血液可用于蛋白质组学、血清药理学和血液生化分析。

同样，本研究采用显微 CT 观察实验小鼠体内 PN 的动态生长，而无需对它们实施安乐死。这种方法有助于更直观、更准确地评估药物对 PN 的抑制作用，同时显着减少实验所需的动物数量，从而提高实验结果的准确性。值得注意的是，这两种技术的结合可以全面跟踪实验动物的结节形成、发展和致癌过程，以及关键靶标（如 TNF-α）改变的定位³³。这为这项关于 PN 甚至肺癌的研究提出了一个独特的概念。

然而，为了提高未来研究的质量，有几个问题需要进一步考虑。鉴于 NNK 与 A/J 小鼠结合的动物模型需要较长的实验时间，因此必须以最高精度进行早期药物注射³⁴。其次，在小鼠中产生肺腺癌的标准方法涉及 NNK 与雌性 A/J 小鼠的协调，其潜在机制与雌二醇有关。因此，必须考虑所涉及的治疗药物的具体作用机制³⁵.此外，显微 CT 未用于确定阴影病灶的性质，因此需要使用苏木精染色和荧光染色，这仍然需要对小鼠实施安乐死才能获得肺组织样本。最后，虽然显微 CT 具有低辐射暴露的优势，但它仍然会对人体造成一定的损害，需要避免靠近无关人员³⁶。为了解决这些问题，可以通过尾静脉注射造影剂来有效地实现各种组织、气道和血管的分化和标记。此外，显微 CT 与新型材料药物 （例如纳米颗粒） 相结合可用于更精确的治疗。最后，显微 CT 技术已逐渐与病理学（如空间和成像组织学）相结合，以更动态地跟踪肺结节的变化^36,37。

作者没有什么可披露的。

我们感谢成都中医药大学基础医学院的 Cong Huang 教授和药学院的 Yan Huang 教授的支持。我们还要感谢 Binjie Xu 博士和 Pengmei Guo 博士。（成都市中医药创新研究院
中医药大学）提供仪器和技术支持。