In vitro Teste de trombose para dispositivos de assistência ventricular

Apresentamos um protocolo de bancada para induzir trombose em dispositivos de assistência ventricular (DVA) dentro de uma plataforma de teste de recirculação. Este método serve para identificar pontos de acesso trombogênicos no caminho do fluxo sanguíneo e pode ajudar a melhorar a resistência à tromborresistência antes dos testes pré-clínicos em modelos animais.

O risco de trombose continua sendo uma preocupação significativa no desenvolvimento e uso clínico de dispositivos de assistência ventricular (DVAs). As avaliações tradicionais da trombogenicidade do DVA, principalmente por meio de estudos em animais, são caras e demoradas, levantam preocupações éticas e, em última análise, podem não refletir com precisão os resultados humanos. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um protocolo de teste in vitro agressivo projetado para provocar trombose e identificar possíveis áreas de alto risco no caminho do fluxo sanguíneo. Este protocolo, motivado pelo trabalho de Maruyama et al., emprega uma estratégia de anticoagulação modificada e utiliza componentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível à maioria dos laboratórios que realizam exames de sangue in vitro de VADs. Demonstramos a utilidade desse método por meio de testes iterativos e refinamento de um VAD pediátrico em miniatura levitado magneticamente (PediaFlow PF5). O método tem sido eficaz na identificação de pontos críticos trombogênicos causados por falhas de projeto e fabricação nos primeiros protótipos de VAD, permitindo melhorias direcionadas antes de avançar para estudos em animais. Apesar de suas limitações, incluindo a ausência de fluxo pulsátil e a influência das características do sangue do doador, este protocolo serve como uma ferramenta prática para o desenvolvimento de DVA em estágio inicial e mitigação de riscos.

Os dispositivos de assistência ventricular (DVA) tornaram-se um padrão de tratamento no tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca avançada, mas o risco de trombose e acidente vascular cerebral continua sendo um desafio significativo ^1,2. A trombose dentro dos VADs é normalmente avaliada durante estudos pré-clínicos em animais, que, embora valiosos, apresentam custos substanciais e desafios logísticos. Esses estudos consomem muitos recursos, são demorados e são suscetíveis a um único defeito que compromete todo o teste e necessita de ensaios adicionais. Isso não apenas aumenta a carga financeira, mas também levanta preocupações éticas devido à necessidade de testes repetidos em animais.

Embora existam muitos modelos numéricos para prever deposição de plaquetas e trombose 3,4,5,6, apenas alguns são adequados para simular a formação de trombos em dispositivos de macroescala, como VADs ^7,8,9. Além disso, os modelos existentes inevitavelmente assumem superfícies idealizadas e geometrias "estanques" simplificadas, que não refletem com precisão as complexidades e imperfeições dos conjuntos de bombas do mundo real. Quando as interações plaqueta-superfície são consideradas, esses modelos em macroescala geralmente empregam propriedades de material uniformemente prescritas (normalmente modeladas como um coeficiente nas condições de contorno do fluxo de superfície) ^{10 , 11 , 12} . Consequentemente, os modelos numéricos não podem substituir completamente os testes experimentais com sangue.

Tanto a escolha do material quanto o acabamento da superfície desempenham papéis críticos na adesão plaquetária nas superfícies VAD 13,14,15,16,17. Imperfeições como manchas ásperas ou irregularidades podem promover a adesão plaquetária e a formação de trombos. Além disso, fendas entre componentes no caminho do fluxo podem servir como um nidus para trombose, fornecendo ambientes protegidos onde os coágulos podem se formar e crescer^18,19. O uso de graxa, lubrificantes ou selantes durante a montagem também pode representar um risco, pois essas substâncias podem penetrar no caminho do fluxo e interagir com o sangue, aumentando ainda mais o risco de complicações.

Há, portanto, a necessidade de um protocolo de teste in vitro bem definido que possa avaliar de forma confiável a tromborresistência dos VADs antes de serem submetidos a testes em animais ou uso clínico. Embora exista um padrão ASTM amplamente adotado para a avaliação da hemólise²⁰, não existe tal padrão para o teste de trombogenicidade de VADs sob condições operacionais clinicamente relevantes²¹. Apesar de estudos seminais que datam de três décadas demonstrarem a viabilidade do teste de trombose in vitro para bombas de sangue^{22 , 23 , 24 , 25} , o teste em animais persistiu como a prática de fato para avaliar a trombose até o momento²⁶. O obstáculo para uma adoção mais ampla de métodos in vitro provavelmente tem sido a natureza complexa da coagulação, com a multiplicidade de fatores de confusão que podem influenciar os resultados dos testes, tornando difícil diferenciar a trombogenicidade intrínseca da bomba dos artefatos decorrentes de limitações metodológicas e erros de procedimento.

Isso nos motivou a compartilhar um protocolo detalhado como um guia para os experimentalistas evitarem armadilhas, promovendo assim o uso de testes in vitro e mitigando a dependência de estudos em animais. O protocolo aqui descrito, derivado de Maruyama et ^al.27, foi refinado e validado durante o projeto da DVA pediátrica PediaFlow (PF5) de^5ª geração^28,29. Este método de teste provou ser fundamental na identificação e abordagem sistemática de riscos trombogênicos potenciais nos protótipos VAD antes dos testes em animais.

O sangue total ovino usado neste estudo foi obtido de um fornecedor comercial e, portanto, não exigiu uma revisão pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell.

1. Construção do circuito de fluxo de teste

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista detalhada dos componentes do loop e todos os outros materiais usados neste protocolo.

1. Modifique a bolsa intravenosa (IV).
   1. Use um selador térmico de plástico para modificar uma bolsa IV para ajustar seu volume e forma, conforme ilustrado na Figura 1.
      NOTA: O formato da bolsa facilita a desaeração e permite que a bolsa seja pinçada com um hemostático através da linha de fluido^30,31. A localização da linha de vedação é escolhida com base no volume de escorva do VAD e da tubulação para atingir um volume total de escorva de 150 mL.
   2. Introduza uma saída de ar fazendo uma incisão de 4 mm na parte superior da bolsa. Insira uma trava luer fêmea farpada na incisão e sele o local com adesivo de borracha de silicone RTV. Fixe uma torneira unidirecional à trava luer.
2. Monte o circuito de teste usando a bolsa IV modificada, tubulação de cloreto de polivinila (PVC), conectores farpados de policarbonato e torneiras de 3 e 1 vias, conforme mostrado na Figura 1.
3. Conecte o manômetro de pressão.
   1. Conecte linhas de extensão de 6 polegadas às portas de pressão do lado de entrada e saída. Prenda uma torneira unidirecional na outra extremidade da linha de extensão.
      NOTA: A torneira permite desconectar a tubulação do manômetro para escorvar a linha de extensão com fluido antes de ligar a bomba, conforme descrito na etapa 4.3.
   2. Conecte uma extremidade de cada tubo de diâmetro interno (ID) de 1/8" a uma farpa do manômetro e insira um encaixe luer macho na outra extremidade.
   3. Conecte as conexões luer macho às torneiras unidirecionais. Abra as torneiras para permitir as leituras de pressão.
4. Aplique uma sonda de fluxo ultrassônica clamp-on para medir a taxa de fluxo.
5. Coloque um Hoffman clamp distal à porta de pressão de saída para regular a resistência ao fluxo.

2. Preparação da solução de cloreto de cálcio (CaCl₂)

1. Dissolva o CaCl₂ em pó em solução salina tamponada com 1x TRIS (pH 7,4) para preparar uma solução 1 M. Evite tampões contendo fosfato (por exemplo, PBS ou DPBS), pois o cálcio e o fosfato reagem para formar um precipitado insolúvel.
2. Se estiver preparando CaCl₂ em grandes quantidades, adicione o pó de CaCl₂ de forma incremental em várias etapas, pois sua dissolução é um processo exotérmico.
3. Titular o pH da solução para 6-8 usando ácido clorídrico (HCl) ou hidróxido de sódio (NaOH), se necessário.

3. Preparação de sangue

NOTA: O sangue ovino usado neste estudo foi obtido de um fornecedor comercial listado na Tabela de Materiais. O sangue foi coletado com agulha 14-G, com o animal contido em posição ortostática agrícola padrão. O processo de coleta levou de 10 a 12 minutos desde a inserção da agulha até a conclusão. O sangue foi anticoagulado com 14 partes de CPD para 86 partes de sangue (formulação de CPD: 26,3 g/L de Na-Citrato, 25,2 g de dextrose, 3 g/L de ácido cítrico e 2,2 g/L de Na-Fosfato em água deionizada [DI]). A bolsa de sangue foi enviada durante a noite em um recipiente isolado com bolsas de gelo e foi usada para o experimento dentro de 24 h após a coleta.

1. Prepare o sangue do doador para uso.
   1. Coloque a bolsa de sangue em uma plataforma basculante por 15 a 30 minutos para misturar o sangue suavemente e permitir que ele atinja a temperatura ambiente (RT).
   2. Coloque uma barra de agitação magnética em um béquer ou recipiente de policarbonato designado para a transferência de sangue.
   3. Transferir o sangue para o copo através de um filtro de transfusão para remover os macroagregados. Manuseie o sangue suavemente para evitar danos aos componentes celulares. Despeje o sangue ao longo das paredes do recipiente para evitar queda livre e minimizar o trauma celular.
      NOTA: Descarte o sangue se houver trombos grandes ou se o filtro entupir.
   4. Coloque o copo ou recipiente em um agitador magnético e ajuste a velocidade até que a superfície do sangue comece a girar suavemente sem formar um grande vórtice. Mexa continuamente por pelo menos 5 min.
   5. Meça o hematócrito e a contagem de plaquetas para garantir que os valores estejam dentro da faixa normal para a espécie.
2. Realize titulações para determinar a concentração alvo de CaCl₂ .
   NOTA: O sangue citrato é recalcificado para permitir o teste de coagulação e trombose, com heparina adicionada para evitar a coagulação descontrolada. O tempo de coagulação ativado (ACT) alvo para o início do teste é de 300 s. Observe que os valores de referência do ACT fornecidos nesta seção foram obtidos usando sangue de ovelha de doadores e podem variar dependendo da espécie e do nível de anticoagulação usado durante a coleta. Além disso, as medidas do TCA podem variar entre os instrumentos 32,33,34. Algumas tentativas e erros podem ser necessários para estabelecer a faixa ideal de ACT para uma configuração laboratorial específica.
   1. Transfira 2 mL da solução preparada de 1 M CaCl₂ e 0,5 mL de heparina sódica (1000 U / mL) da embalagem do fabricante para tubos de microcentrífuga para evitar a contaminação das soluções de estoque.
   2. Transfira 10 mL de sangue para tubos de ensaio de polipropileno de 14 mL. Prepare quatro desses tubos.
   3. Para atingir uma concentração de 0,5 U/mL de heparina no sangue, adicione 5 μL de heparina sódica à amostra de sangue de 10 mL.
   4. Para atingir uma concentração de cálcio de 5 mM no sangue, adicione 50 μL de solução de CaCl₂ 1 M à amostra de sangue de 10 mL. Durante a dispensação, gire a ponta da pipeta para distribuir o CaCl₂ em uma área mais ampla.
   5. Imediatamente, inverta o tubo 10 vezes, role-o horizontalmente (em uma superfície plana ou entre as palmas das mãos) e inverta mais 10 vezes para garantir uma mistura completa.
   6. Meça o ACT usando um sistema de coagulação de sangue total no local de atendimento seguindo as instruções do fabricante. O ACT inicial normalmente varia entre 400-500 s.
   7. Mantendo a concentração de heparina constante, aumente a concentração de CaCl₂ (para aproximadamente 7-8 mM) para atingir um ACT de 300 s.
   8. Verifique a concentração final e o TCA resultante em um tubo de sangue separado.

4. Procedimentos de pré-ensaio

NOTA: Todas as etapas descritas nesta seção se aplicam às Seções 5 e 6. Execute estas etapas antes de operar a bomba com albumina de soro bovino (BSA) ou sangue na alça. Transfira sangue entre vasos usando alimentação por gravidade para minimizar o estresse mecânico. Evite usar o êmbolo da seringa para conduzir o sangue, pois isso pode criar pressão excessiva. Além disso, evite estrangular o sangue através de aberturas estreitas para evitar danos aos componentes celulares.

1. Enchimento e drenagem do circuito de teste
   1. Conecte uma linha de extensão de 30 polegadas à porta de injeção e conecte um corpo de seringa de 60 mL como um funil. Abra a torneira do reservatório para atuar como uma saída de ar.
   2. Despeje o fluido no funil, levantando-o conforme necessário para acelerar o arquivamento. Encha o laço até 1-2 cm abaixo da saída de ar na parte superior da bolsa. Feche as torneiras da saída de ar e da porta de injeção.
   3. Para drenar, abra as torneiras da saída de ar e da porta de injeção e abaixe o funil abaixo do nível da bancada. Levante a bomba acima da porta de drenagem para evacuar o fluido restante.
2. Desarejar o loop de teste
   NOTA: Execute este procedimento ao preencher o circuito com BSA ou sangue antes de iniciar a bomba.
   1. Certifique-se de que não haja ar preso em nenhum lugar do circuito. Desaloje as bolhas de ar nas superfícies batendo e apertando suavemente a tubulação e o reservatório.
   2. Se estiver avaliando uma bomba de sangue de fluxo axial, gire-a para a posição vertical para liberar o ar por flutuabilidade. Se estiver usando uma bomba centrífuga, vire-a de cabeça para baixo e gire-a para garantir que nenhum ar fique preso nos caminhos de fluxo secundários.
   3. Inspecione de perto as seções horizontais da tubulação e as junções entre a tubulação e os conectores para garantir que não haja bolhas de ar.
   4. Aperte a bolsa IV para aproximar o nível do fluido da parte estreita superior e prenda a bolsa com um hemostático na linha de fluido para eliminar a interface fluido-ar. Feche a torneira de ventilação.
3. Preparação das linhas de pressão e da porta de amostragem
   1. Feche a torneira no final das linhas de pressão, remova a tubulação do manômetro e coloque uma seringa de 3 mL. Abra a torneira e puxe 1-2 mL de fluido para a linha de extensão (aproximadamente 4 cm).
   2. Feche a torneira, retire a seringa e reconecte o tubo do manômetro. Abra a torneira para permitir as leituras de pressão.
   3. Preparar a porta de amostragem com uma seringa.
4. Limpeza das portas de injeção e amostragem
   1. Corte ou rasgue um lenço sem fiapos em três fragmentos iguais. Torça o canto de um fragmento para formar uma ponta e insira-o na porta para absorver qualquer sangue residual.
   2. Torça o segundo fragmento, umedeça-o com soro fisiológico e insira a ponta úmida na porta. Torça-o ao redor da porta para remover todo o sangue restante.
   3. Use o terceiro fragmento para absorver qualquer solução salina residual na porta.
      NOTA: Execute este procedimento de limpeza imediatamente após a coleta de uma amostra de sangue ou sempre que houver sangue residual nas portas.

5. Passivando as superfícies de contato com o sangue

1. Encha o circuito com solução de BSA a 1% e opere o VAD para circulá-lo por pelo menos 30 min.
2. Inspecione o loop quanto a vazamentos e remonte, se necessário.
3. Drene a solução BSA completamente para evitar hemodiluição.

6. Teste de trombose

1. Prepare o loop de teste.
   1. Encha o circuito com 150 mL de sangue.
   2. Desar o circuito e preparar as linhas de pressão e a porta de amostragem conforme descrito nas etapas 4.2 a 4.4.
   3. Ligue a bomba em baixa velocidade e opere-a por cerca de 5 s para desalojar quaisquer bolhas de ar presas dentro da bomba e, em seguida, pare a bomba.
   4. Se aparecerem bolhas no saco, repita o passo 4.2 para realizar a desventilação novamente.
   5. Reinicie a bomba em baixa velocidade para circular o sangue no circuito.
2. Adicione heparina ao sangue na alça.
   1. Transfira 1 mL de heparina sódica (1000 U / mL) e 1,5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA; 0,5 M) da embalagem do fabricante para tubos separados para facilitar o manuseio durante o teste.
   2. Use a porta transversal da torneira de 3 vias para administrar substâncias no laço usando uma seringa. Gire a trava luer macho na torneira de modo que a porta de injeção fique voltada para cima para reter as bolhas de ar na parte superior.
   3. Atinja uma concentração de heparina de 0,5 U/mL na alça adicionando 75 U de heparina sódica a 150 mL de sangue. Aspire 75 U de heparina (75 μL se estiver usando concentração de 1000 U / mL) em uma micropipeta e dispense-a em uma seringa de 3 mL dispensando simultaneamente a pipeta e puxando o êmbolo da seringa. Certifique-se de que todo o líquido seja transferido sem derramar.
   4. Encaixe a seringa na porta de injeção através da trava luer, com a porta voltada para cima e a ponta da seringa apontando verticalmente para baixo. Puxe o êmbolo da seringa para enchê-lo de sangue e misture a heparina com o sangue enquanto aspira o ar para a seringa. Deixe a bolha de ar subir até o topo da seringa. Injete a mistura no circuito, garantindo que nenhum ar entre.
   5. Transporte o sangue para dentro e para fora da seringa 4-5 vezes para garantir que o sangue heparinizado não fique confinado ao espaço na porta. Certifique-se de que nenhum ar entre no circuito.
3. Titular o ACT de sangue no loop.
   1. Atingir uma concentração inicial de cálcio de 5 mM na alça adicionando 750 μL de solução 1 M CaCl₂ a 150 mL de sangue usando o mesmo procedimento da heparina.
      1. O sangue exposto a altas concentrações de cálcio pode começar a coagular na seringa. Injete rapidamente o fluido após remover o ar residual. Opcionalmente, dilua o CaCl₂ na seringa com 1 ml de solução salina tamponada com TRIS para reduzir o risco de coagulação prematura.
   2. Deixe o CaCl₂ injetado circular no loop por pelo menos 2 minutos antes de coletar uma amostra de sangue para medir o TCA inicial.
   3. Conecte uma seringa de 1 mL à porta de amostragem. Retire e descarte 0,5 mL de sangue residual para limpar o sangue estagnado da porta.
   4. Conecte uma nova seringa de 1 mL, retire 0,5 mL de sangue para análise e meça o TCA. Limpe a porta de amostragem usando o procedimento na etapa 4.4.
   5. Consulte os valores de titulação na etapa 3.2 para informar a concentração alvo de CaCl₂ . Aumente gradualmente a concentração de cálcio para atingir um ACT de 300 s. Evite adicionar a quantidade total de CaCl₂ de uma só vez para evitar a coagulação rápida.
      NOTA: Nos testes utilizados neste estudo, a concentração inicial de cálcio de 5 mM resultou em TCA de 450 ± 50 s, e a concentração final de 7-8 mM rendeu TCA de 300 ± 20 s. Embora essa resposta possa variar, tente trazer o ACT para ou abaixo de 300 s para o início do teste.
4. Comece o teste.
   1. Assim que o ACT de 300 s for alcançado no loop, comece o teste de 1 h. Ajuste a bomba para a vazão e pressão desejadas modificando a velocidade do rotor e regulando a resistência usando o grampo Hoffman.
   2. Meça o ACT a cada 15 minutos seguindo as etapas 6.3.3-6.3.4.
   3. Se o ACT cair abaixo de 200 s, injete mais 25 U de heparina sódica na alça.
5. Finalize o teste.
   1. Ao final de 1 h, injete EDTA na alça para inibir a coagulação adicional, visando uma concentração final de 5 mM no sangue. (Injete 1,5 mL se estiver usando uma solução EDTA 0,5 M.)
   2. Deixe o EDTA circular e misture por 2 min, depois pare a bomba.
6. Desconecte e lave a bomba.
   1. Prenda a tubulação conectada à entrada e saída da bomba usando hemostáticos, posicionando as braçadeiras a 3-4 cm de distância das farpas de entrada e saída.
   2. Desconecte cuidadosamente a tubulação para liberar a bomba.
   3. Drene o sangue da bomba e flua para um recipiente.
   4. Lave qualquer sangue residual da bomba por gravidade ou pipetando solução salina através da entrada e saída da bomba.
      NOTA: As etapas 6.7 e 6.8 são executadas simultaneamente.
7. Inspecione o caminho do fluxo da bomba.
   1. Capture imagens da entrada e saída da bomba usando uma câmera de endoscópio/boroscópio.
   2. Desmonte a bomba (se aplicável). Lave os componentes em um banho de solução salina e inspecione se há trombos usando um escopo de dissecação ou lente macro.
   3. Fotografe superfícies de contato com o sangue para documentação.
      NOTA: Inspeção consistente e documentação completa são essenciais para testes comparativos.
8. Filtre o sangue usado.
   1. Corte um pedaço de tecido de malha de nylon de 100 μm grande o suficiente para cobrir a abertura de um recipiente de captura.
   2. Posicione a malha sobre o recipiente com uma leve cortina para permitir que o sangue flua através dela de forma eficaz. Prenda as bordas da malha para evitar que escorregue durante a filtração.
   3. Passe o sangue usado através de uma malha de nylon. Descarte o sangue de acordo com as diretrizes de manuseio de resíduos biológicos da instituição.
   4. Examine a malha em busca de trombos capturados e documente os achados.
9. Prepare-se para a análise histológica.
   1. Se a análise histológica for planejada, fixe quaisquer trombos encontrados na solução de formalina seguindo os procedimentos de segurança apropriados.
      CUIDADO: Sempre use uma hotte ao manusear formaldeído.

7. Procedimento de limpeza

1. Desmonte o loop de fluxo. Descarte a bolsa de sangue e o tubo de PVC.
2. Mergulhe todos os outros componentes em contato com o sangue (conectores, torneiras, travas luer, etc.) em uma solução de detergente em pó ativo com enzimas a 1% durante a noite. Enxágüe com água morna da torneira, seguida de água DI e seque ao ar.
   1. Se os coágulos permanecerem, sonice os componentes na solução detergente. Enxágue bem e seque ao ar.
3. Limpe a bomba.
   1. Se a bomba puder ser desmontada, mergulhe e sonice os componentes em contato com o sangue com uma solução de limpeza/desengraxante multiuso a 1%, seguida por uma solução de detergente em pó ativo com enzima a 1%.
   2. Se a bomba não puder ser desmontada, conecte-a a um novo circuito de fluxo cheio de soluções de limpeza e opere-a em alta velocidade por pelo menos 30 min. Repita conforme necessário.
4. Enxágue bem a bomba com água morna da torneira, seguida de água DI e seque ao ar.

A execução bem-sucedida deste protocolo permite a identificação de áreas localizadas de deposição de plaquetas, revelando pontos problemáticos dentro do caminho de fluxo da bomba. A aplicação consistente deste protocolo permite melhorias incrementais ao abordar esses "pontos críticos" identificados.

Por exemplo, durante o desenvolvimento do PediaFlow PF5 VAD, encontramos desafios no polimento manual do lado da pressão das palhetas do estator devido ao tamanho em miniatura dos componentes. Os testes de trombose in vitro destacaram esse problema, pois a deposição de plaquetas foi consistentemente observada ao longo das raízes das lâminas, como visto na Figura 2A. Um padrão de deposição semelhante foi posteriormente confirmado em um estudo agudo em animais, onde a bomba foi conectada extracorpórea à circulação de uma ovelha e operada por 3 h (não detalhado neste artigo). Para resolver isso, empregamos uma técnica de eletropolimento para obter um acabamento espelhado nesses componentes de titânio, o que eliminou com sucesso a formação de trombos nessas áreas (Figura 2B). Esta bomba foi posteriormente empregada em um estudo in vivo de 7 dias em ovelhas, que também demonstrou ausência de trombose.

Outra característica problemática identificada em nossos protótipos de bomba foi a junção entre os componentes da carcaça dianteira e traseira. A coaptação imperfeita nesta junção pode criar uma fenda onde o sangue pode penetrar e coagular, como visto na Figura 3A. Testamos vários métodos de lapidação e polimento para melhorar a fixação desses componentes e usamos o método de teste de trombose in vitro para avaliar os resultados. As melhoras foram avaliadas por meio da reaplicação do protocolo, que confirmou a redução da formação de trombos na junção, conforme demonstrado na Figura 3B.

É crucial distinguir a trombose causada por erro experimental ou artefato da formação real de coágulos dentro do dispositivo. Vários fatores podem desencadear a coagulação excessiva. Ao administrar a solução de CaCl₂ , um pequeno volume de sangue é aspirado para a seringa para aspirar qualquer ar preso na porta, conforme descrito na etapa 6.3.1. Se esse sangue permanecer exposto a uma alta concentração de CaCl₂ por muito tempo, ele pode começar a coagular prematuramente. Quando posteriormente injetado na alça, esse sangue coagulado pode atuar como um nidus para o crescimento adicional do coágulo, potencialmente sendo ingerido no VAD. A Figura 4 mostra um grande trombo que foi presumivelmente ingerido em uma bomba centrífuga maglev, ocluindo o caminho do fluxo.

Injetar um grande volume de CaCl₂ de uma só vez pode desencadear coagulação descontrolada. Para evitar isso, recomenda-se primeiro aumentar a concentração de CaCl₂ na alça para 5 mM, verificar o ACT e, em seguida, prosseguir com uma segunda dose para atingir o ACT alvo.

Coágulos esféricos e frouxamente aderidos observados nas superfícies são frequentemente o resultado de bolhas de ar encapsuladas em coágulos, exemplos dos quais são mostrados na Figura 5A, B. Esses coágulos circulantes podem colidir com as bordas dianteiras das pás do impulsor e do estator, criando depósitos que se assemelham a manchas de insetos no para-brisa de um carro. Isso enfatiza a importância de remover completamente o loop como uma etapa crítica no protocolo. Da mesma forma, qualquer material estranho e detritos circulando na alça podem estar encapsulados em trombos e aderir às superfícies da bomba, como mostrado na Figura 5C, D.

Por outro lado, a presença de trombos em anel nas junções tubo-conector, conforme mostrado na Figura 6, normalmente indica que o TCA estava dentro de uma faixa ideal que suportava a coagulação localizada sem se transformar em coagulação descontrolada. As junções tubo-conectores são conhecidas por serem a região mais trombogênica nos circuitos de ECMO³⁵. Em nossa experiência, essa faixa ideal de ACT está entre 200 s e 300 s. Se o ACT durante os experimentos cair abaixo de 200 s, um bolus adicional de heparina de 25 U pode ser injetado no loop.

Evitar as armadilhas descritas acima e garantir a execução consistente do protocolo maximizará sua utilidade na identificação de potenciais riscos trombogênicos no início do processo de desenvolvimento do DVA, permitindo melhorias direcionadas antes de avançar para estudos em animais.

Figura 1: Esquema do circuito de fluxo de teste. (A) Teste o circuito de fluxo para uma bomba com farpas de entrada e saída de 1/4" e (B) para uma bomba com farpas de entrada e saída de 3/8". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Melhoria iterativa e avaliação de protótipos de VAD usando o protocolo de trombose in vitro . (A) A deposição de plaquetas foi consistentemente observada ao longo das raízes das palhetas do estator na versão polida manualmente da bomba. (B) Este problema foi resolvido na versão eletropolida. Em ambos os testes, o TCA foi mantido entre 250 s e 300 s, e a bomba foi operada a 2,5 L/min por 1 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O protocolo de trombose in vitro foi usado para solucionar o problema de encaixe imperfeito entre os componentes correspondentes da carcaça da bomba. (A) O projeto de linha de base sofria de coaptação imperfeita nesta junção, levando ao acúmulo de sangue e coagulação naquele espaço. Inserção: o coágulo resultante, extraído e esticado entre dois cotonetes. (B) Um projeto revisado com ajuste aprimorado eliminou esse problema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Um grande trombo ocluindo o caminho do fluxo de uma bomba centrífuga maglev, presumivelmente resultante de um erro experimental durante a injeção de CaCl₂ no circuito de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coágulos frouxamente aderidos, material estranho e detritos. (A, B) Coágulos esféricos e frouxamente aderidos observados nas superfícies são frequentemente o resultado de bolhas de ar encapsuladas em coágulos. (C, D) Qualquer material estranho e detritos que circulem no circuito podem ficar encapsulados em trombos que aderem às superfícies da bomba ou colidem com as bordas de ataque (LE) das pás do impulsor e do estator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Trombo em anel. (A) Um trombo em anel formado na junção tubo-conector. (B) O trombo do anel colocado ao lado de uma lâmina de barbear de aço inoxidável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O primeiro teste em humanos de uma nova bomba é sempre um esforço precário, pois os estudos pré-clínicos não podem prever com segurança a trombogenicidade dos VADs em humanos²⁶. Notavelmente, alguns VADs que demonstraram ausência de trombose em ensaios com animais exibiram posteriormente trombogenicidade significativa no uso clínico³⁶. Um regime agressivo de testes in vitro projetado especificamente para provocar trombose oferece uma oportunidade valiosa para identificar possíveis falhas de projeto ou fabricação no início do processo de desenvolvimento. Embora este protocolo não possa oferecer uma previsão definitiva do futuro desempenho in vivo de um VAD, essa abordagem proativa pode revelar potenciais pontos de trombose que podem surgir sob condições pró-coagulantes.

Os métodos in vitro existentes para trombose de DVA variam amplamente na duração do teste e nas estratégias de anticoagulação. Hastings et al. realizaram testes com sangue suíno altamente heparinizado durante um período de 48 horas, replicando com sucesso os padrões de trombose observados clinicamente nas bombas de ECMO³⁷. Em contraste, estudos pioneiros de Schima et al. usaram protamina para reduzir o TCA do sangue heparinizado para 3x seu valor basal no início do teste, encerrando o experimento quando o TCA caiu para 1,5x a linha de base²³. Essa abordagem inovadora comprimiu estudos in vivo típicos de 2 a 3 dias em apenas 1 a 3 h de testes in vitro .

Maruyama e col. compararam sistematicamente o uso de complexos citrato-cálcio e heparina-protamina para o teste de trombose, onde o cloreto de cálcio é adicionado para reverter a ação do citrato, e o sulfato de protamina é usado para neutralizar a heparina²⁷. Eles concluíram que o sangue citrato recalcificante forneceu uma resposta ACT mais gradual e monotônica. Ao empregar o complexo citrato-cálcio, Maruyama e colegas alcançaram um controle preciso do ACT, mantendo-o em 200 s durante um teste de 2 horas. Seu estudo in vitro comparando vários protótipos de bomba replicou efetivamente os padrões de trombose observados em estudos com animais.

Embora o protocolo descrito aqui seja amplamente baseado no método de Maruyama, procuramos abordar duas barreiras principais à sua acessibilidade mais ampla. Primeiro, o estudo de Maruyama utilizou componentes bioativos do circuito de fluxo revestidos com heparina, que podem ser caros e difíceis de adquirir. Simplificamos a abordagem adicionando diretamente uma quantidade fixa de heparina ao sangue e usando componentes de loop de teste prontamente disponíveis de fornecedores comuns. Em segundo lugar, seu método exigia várias injeções de cloreto de cálcio e citrato trissódico durante todo o teste para manter um ACT constante. Em contraste, este protocolo inicia o teste em um ACT mais alto e evita a necessidade de ajustes contínuos, reduzindo assim a complexidade e o potencial de erros de procedimento. Essas adaptações tornam o protocolo deste estudo mais acessível à maioria dos laboratórios que realizam exames de sangue in vitro de VADs.

Embora este protocolo aborde as principais barreiras técnicas, seu sucesso e utilidade final ainda dependem da execução cuidadosa e consistente de cada etapa experimental. Um aspecto crítico deste protocolo é a deseração completa do loop e o método cuidadoso de injetar substâncias no circuito sem gerar êmbolos de ar. A falha em qualquer uma dessas áreas pode introduzir artefatos que podem confundir os resultados, induzindo trombose excessiva.

É fundamental que não haja bolhas de ar e interfaces sangue-ar no circuito antes de iniciar o teste. Quaisquer bolhas de ar que circulem no circuito podem ficar encapsuladas em coágulos e provavelmente serão depositadas nas bordas de ataque do impulsor e das pás do estator. A linha de pressão do lado da entrada representa o maior risco de introdução de ar devido à baixa pressão criada a montante da entrada da bomba. Ao ligar a bomba e aumentar sua velocidade, a coluna de ar na linha de pressão será puxada para o fluxo. Para evitar isso, as linhas de pressão são pré-preparadas com BSA ou sangue, conforme descrito na etapa 4.3. Embora a desaeração seja particularmente importante ao trabalhar com sangue, também recomendamos a desaeração antes de circular a BSA. Essa precaução é necessária porque a ingestão e a quebra de grandes êmbolos aéreos podem produzir espuma que pode persistir após a drenagem da solução de BSA e potencialmente interferir nos testes subsequentes.

O método de injeção de soluções de heparina e CaCl₂ exige técnica precisa e execução cuidadosa, pois a lavagem repetida da seringa aumenta o risco de introdução de êmbolos aéreos. A incorporação de uma seringa motorizada programada para dispensar volumes precisos de substâncias pode ser considerada para mitigar esse risco. Tal aparelho também permitiria a injeção contínua de heparina durante o teste, calibrada para manter o TCA em um nível constante, reduzindo assim a variabilidade causada por mudanças na dinâmica de coagulação ao longo do tempo.

Existem limitações para este método, particularmente as condições de estado estacionário in vitro, que diferem das condições de fluxo pulsátil in vivo. Embora loops in vitro pulsáteis estejam disponíveis, eles exigem um número maior de componentes, adicionando complexidade que pode potencialmente introduzir artefatos.

Outro aspecto notável deste protocolo é que os testes foram realizados à temperatura ambiente e não à temperatura fisiológica de 37 °C. Embora a temperatura fisiológica imitasse melhor as condições in vivo , colocar o circuito de fluxo em uma câmara aquecida e manter 37 ° C de forma consistente foi um desafio devido à necessidade de acesso frequente ao circuito de fluxo durante os experimentos. Também foi considerada a submersão do reservatório de sangue em banho-maria aquecido; no entanto, essa abordagem era incompatível com a configuração atual do loop vertical, que minimiza artefatos experimentais ao facilitar o transporte de bolhas de ar para o topo do reservatório de sangue.

Além disso, o estudo de Patel et al. avaliou o impacto da temperatura no teste de trombose in vitro com sangue ovino e bovino³⁸. Suas descobertas sugerem que o teste à temperatura ambiente oferece melhor sensibilidade em comparação com o teste de 37 ° C e permite durações de teste mais curtas (1 h versus 2 h). Considerando o benefício adicional de eliminar equipamentos de aquecimento pesados, eles propõem que o teste à temperatura ambiente é uma opção viável e prática para a avaliação da trombogenicidade in vitro de biomateriais.

Este protocolo baseia-se na detecção visual da formação de trombos, o que o torna particularmente adequado para VADs com invólucros transparentes ou removíveis. Para dispositivos com invólucros opacos permanentes, a inspeção direta para deposição de trombo é mais desafiadora sem comprometer a integridade estrutural do dispositivo. Nesses casos, o uso de câmeras flexíveis de fibra óptica pode fornecer uma solução parcial, permitindo uma inspeção interna limitada.

Finalmente, fatores como a escolha da espécie doadora, o método de coleta, o tipo de anticoagulante usado e a idade do sangue podem influenciar a resposta trombogênica. As concentrações de heparina e cálcio fornecidas neste protocolo são valores de referência específicos para a configuração usada neste estudo. Além disso, as medidas do TCA podem variar entre diferentes instrumentos 32,33,34. Como tal, este protocolo pode exigir ajustes de ajuste fino por tentativa e erro para determinar a faixa ideal de ACT para uma determinada configuração de laboratório.

Para melhorar ainda mais a consistência entre os experimentos, estudos futuros poderiam incorporar elementos do ensaio ASTM F2888-19 como medida de controle, utilizando o sangue recalcificado do estágio de titulação para avaliação simultânea da trombogenicidade em materiais de referência^39,40. Essa abordagem reduziria a dependência de alcançar um ACT padronizado, pois essa métrica pode não levar em conta totalmente as variações na coagulabilidade decorrentes de diferenças nas propriedades do sangue, como hematócrito, contagem de plaquetas e concentração total de proteínas.

Apesar dessas limitações, este método de teste continua sendo uma ferramenta valiosa para a identificação precoce de riscos trombogênicos durante o desenvolvimento do DVA e oferece uma abordagem prática e acessível para melhorar iterativamente a segurança do dispositivo antes de avançar para estudos em animais.

S.E.O. atualmente atua como consultor da Magenta Medical e anteriormente foi consultor da Boston Scientific. Nenhum outro autor tem quaisquer divulgações financeiras relevantes ou conflitos de interesse a relatar.

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R01HL089456 e pelo Projeto de Atividade de Aquisição de Pesquisa Médica do Exército dos EUA Número W81XWH2010387.